Name: 脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ 新生マウスの急速ジェノタイピングと初代脳神経細胞培養の確立方法。グリアフィーダー層を用いた低密度培養により、生後致死性マウスモデルの神経科学研究を効率的に支援します。

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著者は、線条体培養に関する指示と有益なコメントをいただいたアイオワ大学の研究者、ルイス・テセドール博士、イネス・マーティンス博士、ビバリー・デビッドソン博士に感謝します。また、ジェノタイピングの支援と議論について、カラ・ゴードン博士、ニコール・ボーデ博士、ペドロ・ゴンザレス・アレグレ博士に感謝します。また、タトゥーに関するご意見をいただいたEric Weyand博士(Animal Identification and Marking Systems)や、マウス培養に関するご意見をいただいた葛林秀太郎博士(福岡大学)にも感謝いたします。この研究は、米国心臓協会、国防総省(ピアレビュー医学研究プログラム賞W81XWH-14-1-0301)、ジストニア医学研究財団、エドワード・マリンクロット・ジュニア財団、国立科学財団、およびホワイトホール財団(N.C.H.)からの助成金によって支援されました。

著者(Zhengmin Huang)は、この記事で説明した試薬を製造するEZ BioResearch LLCの社長です。

ここで提示するプロトコルには、マウスにラベルを付け/識別するための入れ墨、尾先からマウスをジェノタイピングするための手順、およびマウスの脳ニューロンを低密度で培養するための手順が含まれています。6〜8匹の子犬を使用した1ラウンドの実験では、これらの手順は通常、それぞれ~0.5時間、~4時間、~2時間、合計6〜7時間かかります。これにより、1人の実験者が、子犬の誕生から神経細胞培養のプレーティングまで必要なすべての手順を1営業日未満で完了することができます(グリアフィーダー層の事前準備を除く)。
入れ墨
動物の長期的な同定は、組織学、細胞機能、動物の行動の分析などの繁殖や科学的研究の目的で必要です。生まれたばかりの動物にタトゥーを入れることは、迅速に行うことができ、動物の生涯の大部分が続くため、有利です7,22-25。足の裏にタトゥーを入れることは、テスト可能な行動、例えばサスペンションやグリップ22,26の維持に関して、つま先のクリッピング23...

遺伝病のげっ歯類モデルは、正常なタンパク質と核酸の生理学的機能、およびこれらの欠陥の病態生理学的影響を確立するのに有用であることが証明されています。例としては、主要な細胞機能に関与するタンパク質が不足しているマウスや、アルツハイマー病などの疾患のマウスモデルなどがあります。しかし、特定の遺伝子操作により、新生児は生後間もなく、または数日後に致死率に達する可能性があります。これらの場合、生細胞は死前に胚または新生児の仔から採取でき、少なくとも数週間in vitroで維持でき、この間に初期のニューロン発生を生化学的、機能的、形態学的に追跡できるため、初代細胞培養は重要なツールとなります。初代培養では、ニューロンを低密度で播種することが有益です。これにより、個々の体細胞、樹状突起、軸索幹、神経終末を高い空間分解能で視覚化することが可能になります。しかし、低密度でのニューロンの生存と分化には、通常、ニューロンをグリアフィーダー層に播種するか、物理的に接触しない状態でグリア細胞と共培養するか、グリア1によってコンディショニングされた培地で培養する必要があります。
グリアフィーダー層上での低密度ニューロン培養の確立は、数日かかるのとは対照的に、数時間以内の迅速で信頼性の高いジェノタイピングに先立って行うことができます。速度は、ニューロンの遺伝子型を事前に準備したグリアフィーダー層の遺伝子型と一致させる必要がある場合に特に重要です。より実用的な例として、実験の効率を最適化するために、培養物の生成にどの遺伝子型のどの仔犬を使用するかを決定する必要があるかもしれません。
ここでは、以前の出版物2-6で、高速で簡素化された信頼性の高いマウスジェノタイピングに使用されてきた作業プロトコルを示しています。マウステールと市販のキットを使用。このプロトコールには、組織からの核酸のシングルステップ抽出が含まれており、核酸精製ステップも終了バッファー(「停止溶液」)の使用も必要ありません。このジェノタイピング法の信頼性は、検体の開始量、動物の年齢、PCRアンプリコンの長さに違いが生じた場合の一連の試験結果を示すことで示されています。このキットには、自動抽出と信頼性という利点があります。
包括的であるために、遺伝子型マウスの長期的な同定のための入れ墨の使用も示されています。入れ墨は、皮膚の真皮(表皮の下)7に入れ墨インクを適用することによって達成されます。新生児または生後1日齢のマウスの足パッドに入れ墨をするための手順が説明されていますが、入れ墨は尾やつま先などの体の他の部分や、すべての年齢の動物に適用できます。さらに、マウスニューロンを低密度でプレーティングおよび培養するための手順を、異なるタイプのグリアフィーダー層2,8の最適化された調製に基づいて実証する。
私たちは遺伝性神経障害DYT1ジストニアの遺伝的マウスモデルを使用します。これは、遺伝子TOR1A(c.904_906delGAG/c.907_909delGAG;p.Glu302del/p.Glu303del)の突然変異によって引き起こされる常染色体優性運動障害です9。コードされたタンパク質であるtorsinAは、「多様な細胞活動に関連するATPase」(AAA+)ファミリーのタンパク質に属し、そのメンバーは一般にシャペロンのような機能を果たし、タンパク質のアンフォールディング、タンパク質複合体の分解、膜輸送、および小胞融合を支援します10-13。この突然変異は、グルタミン酸のコドンのインフレーム欠失をもたらし、「早期発症の全身性孤立性ジストニア」の発現につながる可能性があります14,15。しかし、この障害の原因となる病態生理学的メカニズムは、まだ十分に理解されていません。ノックインマウスモデルでは、変異対立遺伝子はTor1atm2Wtdであり、以下Tor1aΔEと記載します。ヘテロ接合型ΔE-トルシンAノックインマウスは生存可能であり、遺伝的にはDYT1ジストニアのヒト患者を模倣しているが、ホモ接合型ノックインマウスは出生後に死亡し16,17、出生後死亡までの潜伏期間は遺伝的背景18に影響される。ホモ接合型ノックインマウスの早期死亡は、動物のジェノタイピングとニューロン培養の確立の両方を迅速に完了することを必要とします。ジェノタイピングの別の例として、Tfap2a(転写因子AP-2α、活性化エンハンサー結合タンパク質2α)が使用されます。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、増殖、分化、生存、アポトーシスなどの複数の細胞プロセスを調節する上で重要である19。

<table><tbody><tr><td>試薬 - タトゥー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マシンクレンザー</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>これは、入れ墨の後に針とホルダーを洗浄するために使用されます。</td></tr><tr><td>機械乾燥剤</td><td>動物識別およびマーキングシステム株式会社</td><td>NDAR4</td><td>これは、洗浄後に針とホルダーを乾燥させるために使用されます。</td></tr><tr><td>新生児タトゥーブラックピグメント</td><td>動物識別およびマーキングシステム株式会社</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>スキンプレップアプリケーター</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Qチップ。</td></tr><tr><td>スキンプレップソリューション</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSP01</td><td>この試薬は、入れ墨の効率を高め、入れ墨の退色を防ぐオイルの薄い層を提供します(ベンダーからの情報):1)入れ墨のない皮膚が一時的に汚れるのを防ぎ、それにより、子犬が自宅のケージに戻る前に足パッドの入れ墨の品質を簡単に評価できるようにします。汚れた皮膚の表面は、入れ墨された皮膚と混同される可能性があります、2)入れ墨中の皮膚の損傷を軽減します。皮膚を柔らかくし、針を滑らかにすることで、針が皮膚に損傷を与えることなく皮膚に浸透するのを助け、3)分子状酸素が皮膚に入るのを防ぎ、それによって生成される可能性のある活性酸素種に対する炎症反応を減らします。</td></tr><tr><td>試薬 - ジェノタイピング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR ジェノタイピングキット (ストリップチューブフォーマット)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>2X PCR Ready Mix溶液には、電気泳動用の赤色のローディング色素が含まれています。</td></tr><tr><td>組織溶解液 A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>20 & micro を混合して DNA 抽出液を調製します。組織溶解液Aおよび180のl&マイクロ;検体あたりの組織溶解液Bのl。</td></tr><tr><td>組織溶解液B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>20 & microを混合してDNA抽出液を調製します。組織溶解液Aおよび180のl&マイクロ;検体あたりの組織溶解液Bのl。</td></tr><tr><td>酢酸、氷河</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr>ア<tr><td>ガロース最適化グレード、分子生物学グレード</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>SYBR Safe DNAゲル染色剤(10,000倍希釈)または臭化エチジウム(0.5 & micro;g / mlゲル量)。</td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>フィルター付きピペットチップ、エアロゾルフリー、0.1-10 &micro;l</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>無菌でDNA、RNase、DNaseを含まないピペットチップを使用してください。DNAが関与するすべてのステップでは、クロスコンタミネーションを避けるために、フィルター付きピペットチップを使用してください。</td></tr><tr><td>フィルター付きピペットチップ、プレミアムフィットフィルターチップ、0.5-20 & マイクロ;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td> 無<td>菌でDNA、RNase、DNaseを含まないピペットチップを使用してください。DNAが関与するすべてのステップでは、クロスコンタミネーションを避けるために、フィルター付きピペットチップを使用してください。</td></tr><tr><td>フィルター付きピペットチップ、プレミアムフィットフィルターチップ、1-200 & マイクロ;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td> 無<td>菌でDNA、RNase、DNaseを含まないピペットチップを使用してください。DNAが関与するすべてのステップでは、クロスコンタミネーションを避けるために、フィルター付きピペットチップを使用してください。</td></tr><tr><td>分子量マーカー、EZ DNA 偶数梯子 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>これら3つの分子量マーカーのいずれかを使用しています。</td></tr><tr><td>分子量マーカー、EZ DNA 偶数ラダー 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>分子量マーカー、TrackIt、100 bp DNA ラダー</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ、8 チューブ ストリップ、個別に取り付けられたドーム トップ キャップ付き、ナチュラル、0.2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>無菌でDNA、RNase、DNaseを含まないチューブを使用してください。8チューブストリップは、個々のチューブよりも取り扱いが簡単で、試料をグループ化するのが簡単です。</td></tr><tr><td>PCRチューブ、ウルトラフラックスインディビジュアル&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>無菌でDNA、RNase、DNaseを含まないチューブを使用してください。</td></tr><tr><td>Seal-Rite 0.5 ml 微量遠心チューブ、天然</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>DNA、RNase、DNaseを含まない無菌のチューブを使用してください。</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tor1a gene in &Delta;E-torsinAノックインマウス</td><td></td><td></td>:<td>5'-AGT、CTG、TGG、CTG、GCT、CTC、CC-3'(フォワード)、5'-CCT、CAG、GCT、GCT、CAC、AAC、CAC-3'(リバース)(参考文献18)。これらのプライマーは、最終濃度1.0 ng/&microで使用しました。l (~0.16 &micro;M)(参考文献2)。</td></tr><tr><td>野生型マウス</td><td></td><td></td>におけるTfap2a遺伝子増幅用プライマー <td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3'(前方)、5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GGT GAG GTA-3'(リバース)、5'-CAC CCT ATC AGG GGA CAA CTT TCG-3'(フォワード)、5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3'(リバース)、983-BPアンプリコン用、 1990-BPアンプリコン用の5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'(フォワード)、5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3'(リバース)。これらのプライマーは0.5μmで使用されます。</td></tr><tr><td>試薬 - 細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-フルオロ-2&プライム;-デオキシウリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>詳細については、ウリジンのコメントセクションを参照してください。</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td><td>BD falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml</td><td>BD falcon</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ、T75、組織培養処理済み、カンテッドネック、ベンテートキャップ、75 cm2 Growth Area、250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube、ポリプロピレン、15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (cell number counter) chamber slides</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine &beta;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース(デキストロース)無水、SigmaUltra、99.5%(GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>皿、ペトリガラス100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr>蒸留<tr><td>水</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>原液は1,500ユニット/20μ;l = 蒸留水で75,000ユニット/ ml。</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)、高グルコース、GlutaMAX、ピルビン酸</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010、500 ml</td><td></td></tr><tr><td>高速PESフィルターユニット、250 ml、直径50 mmのメンブレン、0.2 & マイクロ;m 細孔サイズ</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES フィルターユニット、500 ml、直径 90 mm メンブレン、0.2 &micro;m 細孔径</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ、12 mm 丸型、厚さ 0.09&ndash;0.12 mm、No. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、&ge;99.5% (滴定)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>塩酸、37%、A.C.S 試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物、MgSO4&bull;(7H2O)、BioUltra、&ge;99.5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>これは、カバースリップとフラスコのコーティング材料です。 1) それを準備するには、マトリゲル基底膜マトリックス溶液を氷上で解凍します。これには通常 ~1 日かかります。予冷したピペットを使用して、解凍した溶液を氷上の予冷したT25フラスコに分注し、フラスコを-20°Cで保存します。作動するマトリゲル溶液を調製するには、分注したマトリゲルを氷上のフラスコで解凍し、予冷したMEM溶液を加えて50倍に希釈し、希釈した溶液を4°Cに保ちます。カバーガラスのコーティング中およびコーティング後を除き、Matrigelと接触するすべての培養器および培地を予冷して、ゲルが早期に形成されるのを防ぐことが重要です。2) ガラスカバースリップまたは培養フラスコをマトリゲルでコーティングするには、マトリゲル溶液を表面に塗布します。セルをめっきする前に、表面を完全に乾かすことが重要です。この目的のためには、細胞をプレーティングする直前の細胞遠心分離中にマトリゲルを吸引し、乾燥に十分な時間を確保することが役立つ場合があります。</td></tr><tr><td>最小必須培地 (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td><td>BD falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treatment 6-well plate</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), 液体</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Neuronal Supplement) 21&nbsp;</td><td>ラボ</td><td></td>で調製 <td>出典:参考文献69</td></tr><tr><td>Pasteur pipets, 5 &frac34;&rdquo;&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-678-6A</td><td>この綿栓5&frac34を使用してください。&rdquo;細胞トリチュレーション用のパスツールピペット。事前に先端をファイヤーポリッシュして切断面を滑らかにし、内径を元の50〜80%に小さくします。チップが小さすぎると細胞が破壊され、細胞生存率が低下しますが、チップが大きすぎるとトリチュレーションの効率が低下します。</td></tr><tr><td>パスツールピペット、9インチ&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)、SigmaUltra、&ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>セロジカルピペット、2 ml</td><td>BDファルコン</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット、5 ml&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット、10 ml</td><td>BDファルコン</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット、25 ml</td><td>BDファルコン</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット、50 ml&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(NaHCO3、炭酸水素ナトリウム)、SigmaUltra、&ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)、SigmaUltra、&ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)、ペレット、99.998% 微量金属ベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物 (Na2HPO4&bull;(7H<サブ>2</サブ>O))、&ge;99.99%、アルドリッチ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖、シグマウルトラ、&ge;99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、滅菌済み、0.2 &micro;m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 3 ml</td><td>BD falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin, Holo, ウシ血漿</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain, 0.4%</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>生細胞/死細胞のカウントに使用されます。古いトリパンブルー溶液を何度も再利用する場合(例:週に数回、数週間)、沈殿物を形成し、細胞密度の誤った読み出しを引き起こすため、更新してください。</td></tr><tr><td>トリプシン、タイプ XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 溶液、0.25%&nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>ストック溶液は、25 mL DMEM (それぞれ 8.12 mM、20.48 mM) 中の 5-フルオロ-2'-デオキシウリジンと 125 mg のウリジンで調製されます。</td></tr><tr><td>試薬 - 免疫細胞化学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体, ウサギポリクローナル抗MAP2</td><td>メルクミリポア</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>抗体, マウスモノクローナル抗GFAPカクテル</td><td>メルクミリポア</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>機器 - タトゥー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>ネオ&#8211;9</td>この<td>新生児げっ歯類の入れ墨システムは、皮膚に垂直に1点または3点の入れ墨の針を急速に移動することによって動作する電気システムです。タトゥーの針先が皮膚表面に対して垂直に保たれている間に、タトゥーマシンを約0.5秒間1回アクティブにします。入れ墨の領域を最大化するために3本針の入れ墨を好みますが、1本針の入れ墨は、つま先または細かい機械的制御が必要な場合は、数字が入れ墨されている場合たとえば。最も遅い速度で2ラウンドの入れ墨(3つのステップのうち「1」を設定)は、通常、肉球の目に見える長持ちする入れ墨を作成するのに十分です。</td></tr><tr><td>機器 - ジェノタイピング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動システム、横型、ワイドミニ&#8211;サブセルGT</td><td>BIO&#8211;RAD</td><td>170&#8211;4405</td><td>典型的な電気泳動パラメータは、6 V / cmでの電界強度と10 cmゲルの25分間の持続時間です。</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>&#916;E-torsinAノックインマウスは以下の通りである:94 &#176での1サイクルの変性;C を 3 分間、94 &#176 で 35 サイクルの変性。C を 30 秒間、58 &#176 でアニーリングします。C 30 秒間、72 &#176 で延長。Cで2分間これに続いて、72 &#176 で最終的な延長が行われます。C で 10 分間、4 &#176;C で保持します。</td></tr><tr><td>電源、PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>機器 - 細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター、Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>この自動セルカウンターは、生細胞と死細胞の密度を別々に測定します(それぞれ非染色細胞とトリパンブルーで染色)。密度測定の最適な範囲を知ることは重要です:私たちが使用するカウンターは、1 x 105から4 x 106/sup/mlの範囲で最高精度を持っています。測定された細胞密度値が推奨範囲外にある場合は、再懸濁量を適切に調整してください。</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット、クラスII、タイプA2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>このフードは、脳の解剖を除くすべての細胞培養手順に使用されます。</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター、オートフロー、湿度制御ウォータージャケット</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>横型クリーンベンチ</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>脳の解剖(「脳の解剖と細胞解離」のステップ3.1.1および3.1.2)に使用されるクリーンベンチです。</td></tr><tr><td>Orbit LS 低速シェーカー</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus 超高速遠心分離機</td><td>Fisher</td><td>46910 (遠心分離機)/46922 (ローター)</td><td></td></tr></tbody></table>

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

哺乳類の神経細胞の形態および機能の高分解能分析は、多くの場合、ニューロンの初代培養物の分析を行った個々の動物の遺伝子型決定を必要とする。遺伝子型を決定する新生マウス、迅速な遺伝子型判定を標識し、そしてこれらのマウスからの脳のニューロンの低密度培養を確立する：我々はのための一連の手順について説明します。個々のマウスは、大人になって持続長期的な識別を可能に入れ墨の標識で標識されている。説明されたプロトコルによる遺伝子型決定は、高速かつ効率的で、かつ信頼性よく、核酸の自動抽出が可能になる。これは、従来の遺伝子型判定のための十分な時間が新生児致死苦しむマウスでは、例えば 、利用できない状況下で有用です。初代ニューロン培養物を、高い空間分解能で画像化実験を可能にし、低密度で生成される。この培養方法は、従来の神経めっきグリアフィーダー層の調製を必要とする。 Protocolは、運動障害DYT1ジストニア（ΔE-torsinAノックインマウス）のマウスモデルにその全体が印加され、神経細胞培養物を、これらのマウスの海馬、大脳皮質および線条体から調製される。このプロトコルは、他の遺伝子の突然変異を有するマウスに、ならびに他の種の動物に適用することができる。さらに、プロトコルの個々の成分は、単離されたサブプロジェクトのために使用することができる。したがって、このプロトコルは、神経科学ではなく、生物学的および医学科学の他の分野だけでなく、幅広い応用を持つことになります。

このプロトコルの適用例として、タトゥーによるマウスの標識、さまざまな実験条件下での信頼性の高いジェノタイピング、およびグリアフィーダー層での初代ニューロン培養の確立に関する代表的な結果が示されています。
タトゥー
新生児の子犬は、タトゥーシステム(図1の「新生児」)を使用して肉球にラベル付けされました。ラベルは、3週齢(「3週齢」)と32週齢(「32週齢」)ではっきりと見えました。個々のマウスは、4つの前足の入れ墨の組み合わせ(番号1〜16)と動物ケージに関する情報、またはより複雑な番号付けスキーム(図示せず)によって一意に識別できます。
ジェノタイピング 
ジェノタイピングの代表的な例を1つ示します（図2〉。野生型(Tor1a+/+)、ヘテロ...

私たちは、新生児マウスの標識とジェノタイピング、およびそれらから一次ニューロン培養を生成する手順について説明します。ジェノタイピングは迅速、効率的、信頼性が高く、自動核酸抽出が可能です。これは、ジェノタイピングを事前に完了する必要がある新生児致死マウスとその培養物に特に有用です。

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

この手順の全体的な目標は、新生仔マウスの遺伝子型を分類し、グリアフィーダー層上に低密度のニューロン培養物を生成することです。これは、まず、第2ステップで尾先を使用して新生児マウスを迅速にジェノタイピングすることによって達成されます。同日、脳を解剖し、グリアフィーダー層として培養します。その後、数週間後、新生マウスの別のグループが急速に遺伝子型決定され、ニューロン細胞が動物の脳から生成され、先行するグリアフィーダー層で培養されます。最終的に、この方法は、迅速で信頼性の高いジェノタイピングだけでなく、健康なニューロンやグリア細胞の生成にも使用できます。このプロトコルには、主に2つの利点があります。1つは、健康なニューロンをグリア胎児層に播種することで、イメージング実験のために非常に低い密度で健康なニューロンを培養できることです。第2の利点は、新生仔マウスを数時間で遺伝子型決定することができるため、ニューロンとグリア胎児層の遺伝子型を一致させることができることです。私はHarta研究室の研究助手です。ジェノタイピングと培養の手順を実演します。まず、検体が入った各PCRチューブに200マイクロリットルのDNA抽出溶液を加えます。チューブストリップをPCRサーマルサイクラーに入れ、抽出が終了したらDNA抽出を開始します。サーマルサイクラーからチューブストリップを取り外し、チューブを5回反転させます。次に、各検体から4マイクロリットルのDNA抽出物を8本のチューブストリップ上の未使用のチューブに移し、サンプルを10マイクロリットルの2つのXPCRと混合します。2マイクロリットルの混合フォワードプライマーとリバースプライマー、および4マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を混合します。各試料について、試料をサーマルサイクラーに入れ、サーマルサイクリングプログラムを開始します。プログラムが終了したら、増幅されたサンプルまたは分子量マーカーごとに20マイクロリットルをarosゲルの適切なウェルに直接ロードします。次に、ゲルを泳動し、紫外線下でのバンドの蛍光画像を取得します。増幅されたDNA産物を検出するには、まず脳の各半球から関心領域を取り出し、次に脳組織を15ミリリットルのチューブに移します。組織をチューブの底に沈殿させてから、スライスの上部からの溶液を5〜10ミリリットルの氷冷と交換します。前に示したように、ウシ胎児血清の有無にかかわらずハンク溶液で、すべての溶液を完全に吸引します。4回目の洗浄後、3ミリリットルのシリンジを使用して、0.2マイクロメートルのシリンジで2ミリリットルの新たに調製した消化液を含むトライインを濾します。脳組織を含むチューブに直接ろ過し、トリプシン化を室温で進行させます。13分後、最初にトリプシン溶液の大部分を吸引し、次にウシ胎児血清を含む7〜10ミリリットルの氷冷ハンク溶液を追加して反応を中和します。次に、示したように、ウシ胎児血清の有無にかかわらず、ハンク溶液で組織をすすぎます。次に、2ミリリットルの解離溶液を脳組織にろ過します。次に、綿の詰まった火で磨かれたPEを使用して、ピペットで細胞を穏やかなトライアで10〜20回機械的に解離します。目に見える組織片が消えるまでトライアを続けます。小片が落ち着くまで3分間待ってから、PEピペットを使用して、約1.5ミリリットルの溶液を3ミリリットルの氷冷ハンク溶液を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移し、ウシ胎児血清を185Gと摂氏4度で13分間チューブをスピンダウンします。次に、同じパスツールピペットを使用して上清を慎重に吸引します。ペレットを1ミリリットルの予温めっき培地に静かに再懸濁します。次に、約4ミリリットルの予温めっき用メディウムを追加します。細胞懸濁液をコーティングされていないT 25培養フラスコに移し、フラスコを細胞培養インキュベーターに入れます。in vitroで1日、5ミリリットルの氷冷めっき培地で細胞を2回すすぎ、1回はフラスコを数回静かに傾けてin vitroで6〜9日で細胞培養皿のガラスカバースリップに細胞外マトリックスタンパク質を含むコーティング材料100μリットルを入れ、細胞培養インキュベーターに入れます。翌日、フラスコ内のすべての溶液を吸引し、約13ミリリットルの氷冷ハンク溶液を追加して、フラスコをすすぎます。次に、溶液を完全に吸引します。次に、4ミリリットルのトリプシンEDTAとDNA溶液を直接細胞にろ過し、摂氏37度のインキュベーターで細胞を細胞培養フラスコから解離させます。13分後、2ミリリットルの氷冷、100%ウシ胎児血清で反応を中和し、5〜10ミリリットルのピペットを使用して細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、約4ミリリットルの氷冷ハンク溶液をウシ胎児血清遠心分離機で加えて細胞を洗浄し、次いでペレットを1ミリリットルの予熱めっき培地に懸濁させて蘇生します。1。次に、カバーからコーティング材料を完全に吸引し、再懸濁されたグリア細胞の約50マイクロリットルをカバースリップにスリップしてプレートします。グリアフィーダー層を確立するには、グリア細胞を摂氏37度で20〜60分間インキュベートし、次に1ミリリットルの予熱めっき培地を各カバースリップに1つずつ加え、めっき培地を添加します。別のピペットを使用してカバースリップの周囲を押し下げると、カバースリップが媒体に浮かばないようにすると便利です。一晩の文化の後。メディウムを1ミリリットルの新鮮な温めたメッキメディウムと交換します、2〜3日で1つずつ。In vitroでは、10マイクロリットルの有糸分裂阻害剤を各フィーダー層培養物に添加して、DNA複製とグリア細胞の増殖を7〜9日で阻害します。In vitroで、培地を予熱めっき培地2と交換します。次に、約50〜100マイクロリットルのマウス神経細胞を、各グリアフィーダー層に2つずつ、予温播種培地で穏やかに播種します。この画像では、遺伝子のツアー1は、ノックインDYTの野生型ヘテロ接合体およびホモ接合性の子犬の新生児のテールクリップから分離されたゲノムDNAから増幅されました DYT 1つのジストニアモデル。野生型と変異対立遺伝子の別々のバンドがはっきりと見えます。この図では、マウス海馬の神経細胞培養から得られた2つの代表的なフィールドが示されています。これらは、野生型マウスのCA3、CA1の海馬領域から生成された。予め設定されたCA3にめっきしてから14日後、野生型マウスの海馬1つの海馬グリアフィーダー層の差動干渉コントラスト画像では、神経細胞体の明確なマージンなどの良好な健康状態の兆候が神経細胞のプロセスを延長し、グリア細胞の比較的均一な層が観察できる。ニューロンマーカーマップのためのさらなる免疫細胞化学染色。2つ目は、各フィールドのニューロンとそのプロセスを特定することも観察できることです。このプロトコルを使用すると、1ラウンドの培養物でのジェノタイピングを67時間で完了できます。このプロトコールは、生後数日で死亡する可能性のある遺伝子操作マウスのニューロンを培養するのに特に有用です。

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