シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

次の実験の全体的な目標は、生理学的条件で遭遇する3D環境を模倣して、一連の微小空洞上の細胞小器官の形態とダイナミクスを観察することです。分裂酵母のように硬い壁を持つ細胞の場合、空洞は細胞構造を組織化し、配向させることができます。これは、まずマスターからPDMSピラーの配列を作製し、レプリカ成形によってエッグカップと呼ばれるPDMSマイクロキャビティの配列を得ることによって達成されます。

第2のステップとして、卵カップは細胞外マトリックスのタンパク質で官能化され、円筒形のカスタムメイドプラスチック片を備えたチューブに導入され、これにより微小共振器サンプルが支持され、各微小空洞に個々の哺乳動物細胞が導入されます。次に、細胞で満たされたエッグカップを取り出し、目的の薬物または化合物とインキュベートして、3D閉じ込め内の細胞の表現型と動的プロセスを研究します。細胞の表現型と、細胞の向きに基づく標準的な2D in vitroアッセイと比較した場合に観察される新しい動的構造の違いを示す結果が得られました。

この手法が標準的な2D細胞培養アッセイなどの既存の方法よりも優れている点は、卵カップ内の哺乳類細胞が論理的な微小環境と同様の3D環境を体験しながらも、順序付けられた標準化されたグレードで配置されていることです。秩序と配向も、分裂酵母の場合には大幅な改善です。この方法は、ハイコンテントスクリーニングによる新規および抗がん剤の同定など、細胞骨格および創薬分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の意味するところは、がんなどの多因子疾患の診断にも及んでおり、薬物スクリーニングアッセイはエッグカップを用いて容易に実施・分析できるため、この手法は個別化医療にとって特に興味深いものとなっています。この方法は、個々の哺乳類細胞や分裂酵母細胞の組織化された構造と動態の内部鍵を提供することができ、また、C.elegansやri-so-flu-aなどの胚の組織化研究にも適用できます。このプロトコルでは、レプリカ成形によりカバースリップ上に接着されたポリジメチルシロキサンまたはPDMS層に、マイクロキャビティまたはエッグカップのアレイがパターン化されます。

最初のステップはマスターの製作であり、これは示されませんが、テキストプロトコルで説明されています。マスターが作成されたら、次のステップは PDMS レプリカを作成することです。50ミリリットルのチューブ内で、架橋剤とプレポリマーを1対10の重量比または体積対体積比で合計30gで十分に混合します。

チューブを1, 800倍gで5分間遠心分離し、気泡を取り除きます。PDMSをマスターの上にそっと落とします。気泡が出た場合は、混合物を脱気します。

サンプルを摂氏65度のオーブンに4時間置きます。PDMSが硬化した後、メスを使用して、約10〜5番目の微小空洞、または卵カップを含む約1平方センチメートルの関心領域を穏やかに切ります。PDMSスタンプをそっと剥がします。

レプリカ成形の手順を開始するには、酸素プラズマ処理によりPDMSスタンプを30秒間アクティブにします。アクティブ化されたstamp ほこりの堆積を防ぐために、閉じたペトリ皿に一時的に保管してください。ヒュームフードで作業し、アクティブ化されたPDMSスタンプを、構造物を上または逆さまにして、15ミリリットルのキャップの隣のシャーレに

キャップに200マイクロリットルのトリメチルクロロシランを入れます。ペトリ皿を閉じ、スタンプを7分間塩漬けにします。PDMSスタンプをスピンコーターに置き、構造を逆さまにします。

構造物の上に液体PDMSを少量ずつ垂らします。1500 RPMで30秒間スピンコートし、構造の上にPDMSの薄層を堆積させます。スタンプを摂氏65度のオーブンに4時間置き、堆積したスピンコーティングされたPDMS層を硬化させます。

次に、PDMSスタンプを逆さまにしてガラスカバースリップと一緒に酸素プラズマクリーナーに30秒間配置して、薄いPDMS層をアクティブにします。すぐにスタンプをガラスカバースリップに接触させ、ピンセットでスタンプの表面全体をそっと押して接着します。その後、スタンプの上部に一定の圧力を約10秒間押し続けます。

30分後、エッグカップを解放するために、カバースリップからスタンプをそっと剥がします。サンプルを壊さないように十分注意してください。エッグカップをエタノールでよくすすぎ、乾かします。

PDMSエッグカップがガラスカバースリップに付着しておらず、ピン留め解除の際に外れてしまった場合は、プラズマクリーナーの設定を調整し、レプリカ成形の手順をやり直すことを検討してください。後でサンプルを操作しやすくするために、硬化したPDMSの小片をカバースリップの端に接着することをお勧めします。このビデオで紹介されている哺乳類細胞の場合、PDMS表面は細胞外マトリックスの接着タンパク質で官能基化されている必要があります。

卵カップを酸素プラズマクリーナーで30秒間水化します。その後、卵カップを紫外線で5分間滅菌します。エッグカップ領域全体を覆うようにフィブロネクチン溶液を少量沈殿させ、室温で1時間インキュベートします。

サンプルを乾燥から保護します。プラスチック製の分注ピペットを使用して、約1ミリリットルのPBSで卵カップをやさしくすすぎます。合計3回繰り返します。

次に、カスタムメイドの円筒形のプラスチック片を50ミリリットルのチューブに入れます。13ミリリットルの細胞培養培地をチューブに加えます。培地は、サンプルが完全に浸るように、円筒形片から少なくとも2センチメートル上に達する必要があります。

鋭利でまっすぐなピンセットを使用してサンプルをPDMSハンドルで保持し、卵カップをチューブ内に慎重に置き、カバースリップをプラスチック片の上側の上に置き、完全に浸るまでカバースリップを静かに押します。エッグカップに導入する細胞は、80〜100%のコンフルエント度で培養し、5ミリリットルの培地に再懸濁する必要があります。エッグカップの上に200マイクロリットルの細胞をピペットで固定し、エッグカップの上にできるだけ中央に細胞を落としますが、物理的な接触を避けます。

これにより、サンプルの破損や損傷を防ぐことができます。50ミリリットルのチューブを1,800倍gで2分間遠心分離します。卵カップの上にさらに200マイクロリットルの細胞をピペットで動かし、再び1,800倍gで2分間遠心分離します。

充填率を最適化するために、合計3回繰り返します。最後の遠心分離後、顕微鏡でエッグカップの充填率を確認します。ピンセットを使用してPDMSハンドルを保持し、卵カップ内の細胞を乱さないようにサンプルをチューブから慎重に取り出し、サンプルを培地の入ったシャーレに入れます。

エッグカップにない余分な細胞を取り除くには、微細構造アレイの両側の横で3回ピペッティングして静かに上下にすすぎます。最後に、培地を新しい培地と交換して、付着していない細胞を取り除きます。固定された細胞小器官を観察するには、固定サンプルの入った卵カップを落射蛍光倒立顕微鏡のステージに置き、60倍オイル対物レンズを選択します。

この例では、サンプルはNIH 3T3線維芽細胞であり、ゴルジ体、核、およびアクチン繊維が染色されています。卵のカップと細胞が観察面に入るまで、明視野光を使用して慎重に焦点を合わせます。関心領域を選択してフォーカスし、画像キャプチャを開始します。

この手順は、エッグカップを顕微鏡ホルダーに入れ、1ミリリットルの10%FCS L15細胞培養培地で満たすことから始めます。ホルダーを顕微鏡のステージに取り付けます。蒸発を防ぐため、ホルダーの上にガラスの蓋を敷いてください。

60倍のオイル対物レンズを装備した落射蛍光倒立顕微鏡で細胞を観察します。この例では、有糸分裂時の細胞動態環閉鎖に関与する2つの重要な分子である蛍光タグ付きミオシンとアクチンを発現するHeLa細胞を使用しています。関心領域を選択し、GFPまたはTexas Redチャネルを使用して細胞動態リングを探します。

ピントを合わせる。リングが完全に閉じるまで、両方のチャンネルで自動取得を実行します。エッグカップの走査型電子顕微鏡画像は、その形状とサイズが非常に規則的であることを示しています。

分裂酵母のような硬い壁を持つ細胞の場合、卵カップは細胞動態リングを配向させることができます。哺乳類の細胞の場合、3D卵カップ上の細胞と2D平面上の細胞を比較すると、前者は均質な球状表現型を持つ秩序ある配列を形成し、後者は無秩序で不均一な形態を示すことが明らかになりました。エッグカップの細胞は、ブレビスタチンによる治療の適度な効果の数によって示されるように、ストレス繊維の数の減少も示しています。.

2D培養のゴルジ装置は通常、拡張された表現型を示しますが、エッグカップでは、より圧縮された表現型を示します。これは、ゴルジ表現型の定量化によって確認されました。最後に、2D表面では、細胞核はランダムに配向されていますが、卵カップでは、野生型とブレビスタチン処理細胞の両方で、xy平面上で直交しています。

核の球形度の値を決定すると、卵カップは細胞核の正常な球形度に影響を与えないことがわかります。しかし、エッグカップ上の野生型細胞とブレビスタチン処理細胞の違いは、エッグカップが2Dでマスクされた薬物の実際の効果を明らかにしていることを示唆しています。エッグカップを用いた生細胞研究は、標準的な培養では見えない新規の活性プロセスの同定を可能にします。

例えば、有糸分裂時に細胞細胞動態環が閉じると放射状に移動するミオシンの周期的な蓄積がHeLa細胞で観察されました。マスターすると、エッグカップはレプリカから6時間未満で準備でき、セルの充填は約15分で完了します。このプロセスを試みる際には、研究対象の細胞に対する卵カップのサイズを用意することが重要です。

この手順は、製薬会社の大量スクリーニング活動のためのハイコンテントスクリーニングプラットフォームや、個々の特定の治療法を評価する際の患者の個別化診断アッセイにさらに適応させることができます。このビデオを見た後、エッグカップのマイクロキャビティの製造方法と使用方法についてよく理解しているはずです。エッグカップは、哺乳類の細胞のような壁のない個々の細胞から、酵母や胚のような壁のあるシステムまで、さまざまな類似のシステムを標準化し、秩序を生み出します。