Name: シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: 学ぶマイクロキャビティアレイを用いた3D環境での細胞形態とオルガネラ動態の観察法。哺乳類細胞や分裂酵母を秩序正しく配列し、標準的な2Dアッセイでは見られない新たな動的構造を同定する技術です。

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我々は、抗Giantin抗体、M. Labouesseラボで私たちを提供するためのL. Brino（IGBMCハイコンテントスクリーニング施設、イルキルシュ、フランス）を認めます。 C.のためのエレガンス （IGBMC）とBセラフィンラボ。酵母（IGBMC）、分裂酵母細胞用の蛍光HeLa細胞（MPI-CBG、ドレスデン）、J.モーズリー（ダートマス医科大学）とJQウー（オハイオ州立大学）のためのE. PaluchとA.ハイマンを出芽するため、 A.フールと実験の助けのためのF. Evenou、技術的なヘルプのためのC.リック（IBMC、ストラスブール、フランス）、および微細加工のヘルプのためのJC Jeannot（フェムト-ST、フランス）。この作品は、CNRS、ストラスブール大学、CONECTUS、ラ財団ラRECHERCHEMédicaleとCI-FRCストラスブールのを注ぐからの資金によってサポートされていました。

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

レプリカ成形は「eggcups」を作製するために使用しました。製造プロセスは、クリーンルームを必要としません。いくつかの練習が必要になることがありますが、それは、簡単でシンプルです。具体的には、PDMSスタンプを解放すると、高品質」eggcups &#39;の大きな領域を生成するための最も重要なステップです。このため、特別な注意は、このステップで注意しなければなりません。このステップが繰り返し失敗する場合、シラン化およびプラズマ結合する前に、プラズマクリーナーのパラメータを最適化することを検討してください。不十分なシラン化は、PDMSフィルムにスタンプの強い固着につながります。これが観察された場合、シラン化試薬とのインキュベーション時間を増加させることができます。他の技術および材料は、リガンド（フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲンなど ）の広い範囲で官能化することができる「eggcups &#39;を製造するのに適用することができます。特に、ポリスチレンにおけるマイクロキャビティは容易にCUSによって製造することができますトム製ホットエンボス加工技術。これは、生体適合性および標準的な培養皿で得られた結果との直接比較を...

インビトロでの細胞ベースのアッセイにおける電流は、（2D）二次元です。この構成では、哺乳動物細胞のための自然ではないので、1生理学的に関連はありません。細胞は形状、サイズおよび異種の表現型の多様性を示します。このような平面や細胞小器官の極端な表現型（特にストレスファイバー）内の無秩序分布として、スクリーニング用途に適用されるとき、彼らは追加の重大な制限を提示します。これは、高予算が毎年費やされている薬物検査のための臨床試験において特に重要です。薬剤スクリーニングの初期段階であるため、人工2D培養条件の動物モデルに適用した場合、これらの薬物のほとんどはいえません。また、このアプローチを使用することによって、特定の細胞小器官は、適切に、そのような細胞質分裂のアクトミオシン細胞の有糸分裂の間にリング、および観察面に垂直な面内で進化している一般的な構造として、視覚化することができません。一部新しい2Dアッセイは、細胞骨格組織の上述の欠点及び重要な洞察が2,3観察されている解決するために提案されています。しかしながら、これらのアッセイは、まだ現在のもの重大な制限：細胞は、細胞が3次元構造を提示し、インビボで観察されるものとは対照的に、非常に広がり表現型を示します。培養法に関連したこれらのアーティファクトは、強化されたストレスファイバー1,4,5などの非生理的な機能をトリガすることができます。 2D環境6,7と比較した場合、三次元細胞培養アッセイは、多数の利点を提供します。彼らは、生理的に、より関連性の高い、との結果は、したがって、意味があります。一例として、ヒドロゲルに埋め込 ​​まれた細胞は、3Dのような構造を示すが、その形態は、他の8,9、1つのセルから異なります。しかし、その形態は、スクリーニングアプリケーションを複雑に別のセルとは異なります。別の戦略は、単一埋め込むことです微細加工キャビティ10,11内の細胞。セル位置、形状、極性および内部セル組織が正規化になることができます。細胞に3Dのようなアーキテクチャを提供するだけでなく、マイクロキャビティは、高コンテンツスクリーニング研究10,12-14を可能にします。単一細胞は、マイクロアレイおよび細胞小器官に注文することができ、それらの進化を並行して観察することができます。この規則は、細胞の数が少ない、より良い空間的/時間的解像度との良好な統計情報を提供します。有用な化合物を確実に識別しやすくなります。 本研究では、高コンテンツスクリーニングアプリケーション10,12,13のための新しい3Dのような単一細胞培養システムの製作と応用を示しています。デバイスは、エラストマーマイクロキャビティ（10 5の空洞/ cm 2）で、造語「eggcups」（EC）の配列で構成されます。この作品での寸法とECの総容積は、個々のNIH3T3およびHeLa細胞の典型的なボリュームに最適化されています細胞分裂時に。円筒 - - 空洞の形態は、アクティブなプロセスの可視化のための適切配向セルの形状に選択されています。 15,16カバースリップレプリカモールディングをガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）層上にパターンにECのアレイを使用します。遠心分離により細胞をECに導入されます。ここでは、2D（平らな）表面上の同じ細胞と比較して、3D（EC）における細胞小器官（アクチンストレスファイバー、ゴルジ装置および核）の観察および正規化を報告しています。我々はまた、このような細胞有糸分裂17の間の細胞質分裂のアクトミオシンリングの閉鎖などの活性力学過程の観察を報告しています。最後に、我々はそのような出芽酵母、分裂酵母とCのような剛性の壁、と他のシステムでこの方法論の結果を示しますモデルシステムの広い範囲に私達の方法の適用性を確認するエレガンス胚 。 私たちは、詳細かつ網羅pは次の提示します3次元微細加工のための「eggcups」を製作し、適用するためにrotocol。我々のアプローチはシンプルで、クリーンルームを必要としません。私たちは、この新しい方法論がペトリ皿の代わりに、薬物スクリーニングアッセイおよびオーダーメイド医療のために特に興味深いものになることを期待しています。最後に、私たちのデバイスは、ガン18内または基礎研究19、例えば、外部刺激に対する細胞応答の分布を研究するために有用であろう。

<table><tbody><tr><td>ddH20(超高純度)</td><td>ミリポア</td> <td>-</td> <td>常に真水を使用する。</td></tr><tr><td>パラフィルム(プラスチックフィルム)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>パラフィルムを水滴を使用してラボベンチに接着し、表面の平坦性を確保します。</td></tr><tr><td>フォトマスク</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="RANGE!D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a</td></tr><tr><td>>SU-8 フォトレジスト</td><td>MicroChem</td><td>2000 series</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp;</A></td></tr><tr><td>ヒュームフードでの作業が必要です。詳細については、製造元のデータシートを確認してください。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8開発者</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp;</a></td></tr><tr><td>ヒュームフードでの作業が必要です。詳細については</td><td></td><td></td><td></td>、製造元のデータシートを確認してください。</tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp;region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp;region=CA</a></td></tr><tr><td>複数の会社から入手可能です。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シグマコート(シリコン処理試薬)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp;region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp;region=FR&nbsp;</a</td></tr><tr><td>>有害で、ヒュームフードでの作業が必要です。詳細については、製造元のデータシートを確認してください。&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロトリメチルシラン(TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCSは急性吸入および皮膚毒性を引き起こし、非常に可燃性です(発火フラッシュバックはかなりの距離で発生する可能性があります)ため、発火源から離れたヒューム食器棚で使用する必要があります</td></tr>ニ<tr><td>トリル手袋</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional。com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>複数の会社から入手可能です。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ#0</td>ニット<td>ガラス</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a</td></tr><tr><td>>非常に壊れやすい。優しく操作します。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャープなストレートピンセット</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td></td></tr><tr><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 50mlチューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>複数社から入手可能です。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>ダウ コーニング</td><td>シルガード 184 kit</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN&nbsp;</a></td></tr><tr><td>パッケージにはPDMSベースと硬化剤の両方が含まれています。同様のエラストマーは、複数の会社から入手可能です。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>複数の会社から入手可能です。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM高グルコース培地</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>ウシ子牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp;region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp;region=CA</a></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD</a</td></tr><tr><td>>PBS 1x</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBSは10倍であり、ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15中 Fisher</td><td>Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medium、CO2制御</td><td></td><td></td><td></td>フィ</tr><tr><td>ブロネクチンのない雰囲気用&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;term=F1141-5MG&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;term=F1141-5MG&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>ペニシリン &ストレプトマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp;store=サイエンティフィック&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM</a</td></tr><tr><td>>ペトリ皿 P35</td><td>グライナー</td><td></td> <td>627102<a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>ペトリ皿 P60</td><td>グライナー</td><td></td> <td>628163<a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>ペトリ皿 P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp;region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp;region=FR&nbsp;</a></td></tr>特に<tr><td>目には有害で、ヒュームフードでの作業が必要です。詳細については、製造元のデータシートを確認してください。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトン 0.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;用語= 93443-100ML&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;用語= 93443-100ML&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>ファロジン-グリーン蛍光 Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=検索-a12379&nbsp;</a></td></tr><tr><td>粉末を1.5 mlメタノール</td><td></td><td></td><td></td>に溶解</tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td> 1<td>:200 PBSで希釈 1x</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗ジャイアンチン</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>1:500 PBSで希釈 1x</td></tr><tr><td><a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp;</a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-anillin</td><td>Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. &Glotzer, M. Anillinは、細胞質分裂中にRhoA、アクチン、およびミオシンを結合する足場タンパク質です。現在の生物学 18, 30&ndash;6(2008年)。</td><td></td><td>PBS 1x</td></tr><tr><td>抗ホスホチロシン</td><td>導入ラボ</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 ヤギ抗ウサギ&nbsp;</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp;><</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp;region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp;region=FR&nbsp;</a></td></tr><tr><td>1 mg/ml で 1 分間</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;term=G2025&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;term=G2025&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;term=M8410-500ML&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp;term=M8410-500ML&lang=ja&地域=CA&フォーカス=製品&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>-</td><td>-</td><td>哺乳類細胞は多くの会社から入手可能です。表1</td></tr><tr><td>NIH3T3細胞</td>も参照してください <td>ATCC</td><td>-</td><td>哺乳類細胞は多くの企業から入手可能です。表1</td></tr><tr><td>分裂酵母&nbspも参照してください。</td><td>●</td><td></td><td>株の詳細については、担当著者にお問い合わせください。&nbsp;表 1</td></tr><tr><td>C. elegans worms</td><td>-</td><td></td><td>-詳細については、対応する著者にお問い合わせください。&nbsp;表1</td></tr><tr><td>YES(寒天)+ 5サプリメントが含まれています</td><td>MPバイオメディカル</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp;s=検索">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp;s=検索&nbsp;</a></td></tr><tr><td>準備のため:箱</td><td></td><td></td><td></td>に記載されている指示に従ってください</tr><tr><td>はい(メディア)+ 5つのサプリメントが含まれています</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp;s=検索">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp;s=検索&nbsp;</a></td></tr><tr><td>準備のため:箱</td><td></td><td></td><td></td>に記載されている指示に従ってください</tr><tr><td>EMM(Media)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp;s=検索">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp;s=検索&nbsp;</a></td></tr><tr><td>準備の場合:ボックス</td><td></td><td></td><td></td>に記載されている指示に従ってください&nbsp;</tr><tr><td>フィルター滅菌EMM(メディア)-イメージングのみMP</td><td>Biomedicals</td><td>4110-012</td>準備<td>の場合:ボックスに記載されている指示に従ってください。0.22&microを使用して培地をフィルター滅菌します。mフィルターの代わりに。これにより、メディアの透明性が得られ、自家蛍光が減少します。</td></tr><tr><td>サプリメント(EMM用)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp;s=Search">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp;s=Search</a></td></tr><tr><td>&nbsp;(オートクレーブまたはろ過する前に、EMM培地に225 mg / Lを追加してください)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>StericupおよびSteritop真空駆動滅菌</td><td>フィルターMillipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp;tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp;tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

シングルセルおよび3d閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

生物細胞は、通常、平坦（2D）表面上に観察されます。この条件は、生理的ではなく、表現型と形状は非常に可変です。そのような環境下での細胞に基づくスクリーニングは、したがって、重大な制限があります細胞小器官は、異種および/または特定の細胞小器官が適切に可視化することができない極端な表現型、細胞形態とサイズを示しています。また、in vivoでの細胞は、3D環境に位置しています。このような状況では、細胞は主に組織の周囲の細胞外マトリックスとの相互作用の異なる表現型を示します。標準及び細胞ベースのアッセイのための生理学的に関連する3次元環境内の単一のセルの順序を生成するために、ここでは、インビトロの3D細胞培養のためのデバイスの微細化およびアプリケーションを報告します。このデバイスは、マイクロキャビティの2次元配列（典型的には、10 5の空洞/ cm 2）を、単一細胞または胚で満たされ、それぞれ構成されています。細胞ポジション、形状、極性および内部細胞組織は、3Dアーキテクチャを示す正規化となります。私たちは、カバーガラスに付着した薄いポリジメチルシロキサン（PDMS）層の上に、「eggcups &#39;、パターンにマイクロキャビティの配列をレプリカ成形を使​​用していました。空洞は、接着を促進するために、フィブロネクチンで被覆しました。細胞を遠心分離により挿入しました。充填率は80％まで許容するシステムごとに最適化しました。細胞および胚の生存率を確認しました。私たちは、このような核やゴルジ装置などの細胞小器官の可視化のためにこの手法を適用し、このような細胞有糸分裂中の細胞質分裂のリングの閉鎖などのアクティブなプロセスを、研究します。このデバイスは、ゴルジ体や核の位置合わせのための細胞質分裂の閉環と固めの表現型の間に、このような定期的な蓄積とミオシンとアクチンの不均一性などの新機能、の同定を可能にしました。我々は、哺乳動物細胞、分裂酵母、出芽酵母、C.するための方法を特徴としますエレガンスワットそれぞれの場合の具体的な適応i番目。最後に、このデバイスの特性は、薬物スクリーニングアッセイおよびパーソナライズされた医療のために特に興味深いもの。

「eggcups '（EC）は、3D環境に配向した細胞と胚の可視化を可能にする新たな高コンテンツのスクリーニング方法論です。さらに、標準的な2D（フラット）培養物中で観察することが困難であるいくつかの細胞プロセスは、この新たな方法により観察することができる。 図1aは、ECの微細加工のための手順の概要を示している（上記のプロトコルでも、第1参照）。この方法は、簡単、迅速、効率的かつ特別な装置の任意の必要がない。 図1Bおよび1Cは、それぞれ、大規模な画像と'eggcups」の拡大された走査型電子顕微鏡画像を示します。それを観察できるように、その形状及び大きさは、非常に規則的です。この方法は非常に柔軟です。異なる形状およびサイズ​​を容易に製造し、別のモデル系に適合させることができます。 'eggcups'の寸法は、次のように選択した：寸法を分裂する細胞の2D表面上で測定した：彼らは球状の形状を有し、その直径は、EC直径のための良い指標としました。例えば、細胞分裂時にその長軸に沿って'eggcups'細長いと東洋における細胞。細胞や胚 ...

私たちは、デバイスと、細胞や胚を研究するための新しい方法を報告しています。単一細胞が正確にマイクロキャビティアレイに並べられます。その3Dの閉じ込めは、生理的条件に遭遇した3D環境への第一歩であり、細胞小器官の向きを可能にします。セル形状を制御することにより、この設定は、標準的なアッセイで報告変動を最小限に抑えることができます。

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

次の実験の全体的な目標は、生理学的条件で遭遇する3D環境を模倣して、一連の微小空洞上の細胞小器官の形態とダイナミクスを観察することです。分裂酵母のように硬い壁を持つ細胞の場合、空洞は細胞構造を組織化し、配向させることができます。これは、まずマスターからPDMSピラーの配列を作製し、レプリカ成形によってエッグカップと呼ばれるPDMSマイクロキャビティの配列を得ることによって達成されます。第2のステップとして、卵カップは細胞外マトリックスのタンパク質で官能化され、円筒形のカスタムメイドプラスチック片を備えたチューブに導入され、これにより微小共振器サンプルが支持され、各微小空洞に個々の哺乳動物細胞が導入されます。次に、細胞で満たされたエッグカップを取り出し、目的の薬物または化合物とインキュベートして、3D閉じ込め内の細胞の表現型と動的プロセスを研究します。細胞の表現型と、細胞の向きに基づく標準的な2D in vitroアッセイと比較した場合に観察される新しい動的構造の違いを示す結果が得られました。この手法が標準的な2D細胞培養アッセイなどの既存の方法よりも優れている点は、卵カップ内の哺乳類細胞が論理的な微小環境と同様の3D環境を体験しながらも、順序付けられた標準化されたグレードで配置されていることです。秩序と配向も、分裂酵母の場合には大幅な改善です。この方法は、ハイコンテントスクリーニングによる新規および抗がん剤の同定など、細胞骨格および創薬分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の意味するところは、がんなどの多因子疾患の診断にも及んでおり、薬物スクリーニングアッセイはエッグカップを用いて容易に実施・分析できるため、この手法は個別化医療にとって特に興味深いものとなっています。この方法は、個々の哺乳類細胞や分裂酵母細胞の組織化された構造と動態の内部鍵を提供することができ、また、C.elegansやri-so-flu-aなどの胚の組織化研究にも適用できます。このプロトコルでは、レプリカ成形によりカバースリップ上に接着されたポリジメチルシロキサンまたはPDMS層に、マイクロキャビティまたはエッグカップのアレイがパターン化されます。最初のステップはマスターの製作であり、これは示されませんが、テキストプロトコルで説明されています。マスターが作成されたら、次のステップは PDMS レプリカを作成することです。50ミリリットルのチューブ内で、架橋剤とプレポリマーを1対10の重量比または体積対体積比で合計30gで十分に混合します。チューブを1, 800倍gで5分間遠心分離し、気泡を取り除きます。PDMSをマスターの上にそっと落とします。気泡が出た場合は、混合物を脱気します。サンプルを摂氏65度のオーブンに4時間置きます。PDMSが硬化した後、メスを使用して、約10〜5番目の微小空洞、または卵カップを含む約1平方センチメートルの関心領域を穏やかに切ります。PDMSスタンプをそっと剥がします。レプリカ成形の手順を開始するには、酸素プラズマ処理によりPDMSスタンプを30秒間アクティブにします。アクティブ化されたstamp ほこりの堆積を防ぐために、閉じたペトリ皿に一時的に保管してください。ヒュームフードで作業し、アクティブ化されたPDMSスタンプを、構造物を上または逆さまにして、15ミリリットルのキャップの隣のシャーレに置きます。キャップに200マイクロリットルのトリメチルクロロシランを入れます。ペトリ皿を閉じ、スタンプを7分間塩漬けにします。PDMSスタンプをスピンコーターに置き、構造を逆さまにします。構造物の上に液体PDMSを少量ずつ垂らします。1500 RPMで30秒間スピンコートし、構造の上にPDMSの薄層を堆積させます。スタンプを摂氏65度のオーブンに4時間置き、堆積したスピンコーティングされたPDMS層を硬化させます。次に、PDMSスタンプを逆さまにしてガラスカバースリップと一緒に酸素プラズマクリーナーに30秒間配置して、薄いPDMS層をアクティブにします。すぐにスタンプをガラスカバースリップに接触させ、ピンセットでスタンプの表面全体をそっと押して接着します。その後、スタンプの上部に一定の圧力を約10秒間押し続けます。30分後、エッグカップを解放するために、カバースリップからスタンプをそっと剥がします。サンプルを壊さないように十分注意してください。エッグカップをエタノールでよくすすぎ、乾かします。PDMSエッグカップがガラスカバースリップに付着しておらず、ピン留め解除の際に外れてしまった場合は、プラズマクリーナーの設定を調整し、レプリカ成形の手順をやり直すことを検討してください。後でサンプルを操作しやすくするために、硬化したPDMSの小片をカバースリップの端に接着することをお勧めします。このビデオで紹介されている哺乳類細胞の場合、PDMS表面は細胞外マトリックスの接着タンパク質で官能基化されている必要があります。卵カップを酸素プラズマクリーナーで30秒間水化します。その後、卵カップを紫外線で5分間滅菌します。エッグカップ領域全体を覆うようにフィブロネクチン溶液を少量沈殿させ、室温で1時間インキュベートします。サンプルを乾燥から保護します。プラスチック製の分注ピペットを使用して、約1ミリリットルのPBSで卵カップをやさしくすすぎます。合計3回繰り返します。次に、カスタムメイドの円筒形のプラスチック片を50ミリリットルのチューブに入れます。13ミリリットルの細胞培養培地をチューブに加えます。培地は、サンプルが完全に浸るように、円筒形片から少なくとも2センチメートル上に達する必要があります。鋭利でまっすぐなピンセットを使用してサンプルをPDMSハンドルで保持し、卵カップをチューブ内に慎重に置き、カバースリップをプラスチック片の上側の上に置き、完全に浸るまでカバースリップを静かに押します。エッグカップに導入する細胞は、80〜100%のコンフルエント度で培養し、5ミリリットルの培地に再懸濁する必要があります。エッグカップの上に200マイクロリットルの細胞をピペットで固定し、エッグカップの上にできるだけ中央に細胞を落としますが、物理的な接触を避けます。これにより、サンプルの破損や損傷を防ぐことができます。50ミリリットルのチューブを1,800倍gで2分間遠心分離します。卵カップの上にさらに200マイクロリットルの細胞をピペットで動かし、再び1,800倍gで2分間遠心分離します。充填率を最適化するために、合計3回繰り返します。最後の遠心分離後、顕微鏡でエッグカップの充填率を確認します。ピンセットを使用してPDMSハンドルを保持し、卵カップ内の細胞を乱さないようにサンプルをチューブから慎重に取り出し、サンプルを培地の入ったシャーレに入れます。エッグカップにない余分な細胞を取り除くには、微細構造アレイの両側の横で3回ピペッティングして静かに上下にすすぎます。最後に、培地を新しい培地と交換して、付着していない細胞を取り除きます。固定された細胞小器官を観察するには、固定サンプルの入った卵カップを落射蛍光倒立顕微鏡のステージに置き、60倍オイル対物レンズを選択します。この例では、サンプルはNIH 3T3線維芽細胞であり、ゴルジ体、核、およびアクチン繊維が染色されています。卵のカップと細胞が観察面に入るまで、明視野光を使用して慎重に焦点を合わせます。関心領域を選択してフォーカスし、画像キャプチャを開始します。この手順は、エッグカップを顕微鏡ホルダーに入れ、1ミリリットルの10%FCS L15細胞培養培地で満たすことから始めます。ホルダーを顕微鏡のステージに取り付けます。蒸発を防ぐため、ホルダーの上にガラスの蓋を敷いてください。60倍のオイル対物レンズを装備した落射蛍光倒立顕微鏡で細胞を観察します。この例では、有糸分裂時の細胞動態環閉鎖に関与する2つの重要な分子である蛍光タグ付きミオシンとアクチンを発現するHeLa細胞を使用しています。関心領域を選択し、GFPまたはTexas Redチャネルを使用して細胞動態リングを探します。ピントを合わせる。リングが完全に閉じるまで、両方のチャンネルで自動取得を実行します。エッグカップの走査型電子顕微鏡画像は、その形状とサイズが非常に規則的であることを示しています。分裂酵母のような硬い壁を持つ細胞の場合、卵カップは細胞動態リングを配向させることができます。哺乳類の細胞の場合、3D卵カップ上の細胞と2D平面上の細胞を比較すると、前者は均質な球状表現型を持つ秩序ある配列を形成し、後者は無秩序で不均一な形態を示すことが明らかになりました。エッグカップの細胞は、ブレビスタチンによる治療の適度な効果の数によって示されるように、ストレス繊維の数の減少も示しています。.2D培養のゴルジ装置は通常、拡張された表現型を示しますが、エッグカップでは、より圧縮された表現型を示します。これは、ゴルジ表現型の定量化によって確認されました。最後に、2D表面では、細胞核はランダムに配向されていますが、卵カップでは、野生型とブレビスタチン処理細胞の両方で、xy平面上で直交しています。核の球形度の値を決定すると、卵カップは細胞核の正常な球形度に影響を与えないことがわかります。しかし、エッグカップ上の野生型細胞とブレビスタチン処理細胞の違いは、エッグカップが2Dでマスクされた薬物の実際の効果を明らかにしていることを示唆しています。エッグカップを用いた生細胞研究は、標準的な培養では見えない新規の活性プロセスの同定を可能にします。例えば、有糸分裂時に細胞細胞動態環が閉じると放射状に移動するミオシンの周期的な蓄積がHeLa細胞で観察されました。マスターすると、エッグカップはレプリカから6時間未満で準備でき、セルの充填は約15分で完了します。このプロセスを試みる際には、研究対象の細胞に対する卵カップのサイズを用意することが重要です。この手順は、製薬会社の大量スクリーニング活動のためのハイコンテントスクリーニングプラットフォームや、個々の特定の治療法を評価する際の患者の個別化診断アッセイにさらに適応させることができます。このビデオを見た後、エッグカップのマイクロキャビティの製造方法と使用方法についてよく理解しているはずです。エッグカップは、哺乳類の細胞のような壁のない個々の細胞から、酵母や胚のような壁のあるシステムまで、さまざまな類似のシステムを標準化し、秩序を生み出します。

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Research

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Bioengineering

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