Name: 不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ 不連続ショ糖勾配超遠心分離によるシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の精製法。脳組織のサブセルラー分画を用いて神経科学研究でタンパク質動態を解析する基盤技術です。

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著者は、シナプス原形質膜の細胞内分画のプロトコルを最初に実証したマイク・エーラーズ博士と彼の研究室のメンバーに感謝します。また、マウスコロニーの管理をしてくれたWendy Horsfall氏にも感謝します。この作業は、CIHR(AJRおよびAS)からの運営助成金によって支援されました。

以下のプロトコルは、動物管理のカナダの協議会のガイドラインに準拠し、トロント大学の医学部や薬学部動物実験委員会によって承認されています。 表1に記載のように1。必要な試薬を準備する<ol><li> 表1に概説濃度ですべてのスクロース溶液、緩衝液にプロテアーゼおよびホスファターゼ（必要な場合）阻害剤を加え、のddH 2 O。重要：実験の開始に先立って試薬や機器のすべてを、4℃でのすべての手順を実行して、事前にクール。油性マジックで超遠心管を含め、全てのチューブにラベルを付けます。 </li></ol>適切な脳領域の2解剖<ol><li>頸椎脱臼または断頭により動物を生け贄に捧げる。ハウスとは、動物のケアに関する制度や政府の方針に従って動物を安楽死させる。 </li><li>急速番目を削除チルド解剖台の頭蓋骨と場所からの電子の脳。 </li><li>新鮮な組織から適切な脳領域を解剖し、ステップ3に進みます。 </li></ol>モーター駆動ガラステフロンホモジナイザーで3組織の均質化<ol><li> 0.32 M HEPES緩衝ショ糖溶液4ml含む標識13ミリリットルポリプロピレンチューブ中で解剖組織（SPM用）50〜100 mg、または（PSD用）100〜200ミリグラムを置きます。 15ミリリットルに試料を移す先細ガラステフロン組織グラインダー/ホモジナイザー、900rpmで（設定7）にモータ駆動に設定し、30秒かけて12ストロークでサンプルを均質化する。サンプル間の異なるガラステフロンホモジナイザーを使用するか、またはサンプル間の冷蒸留水でホモジナイザーをすすぎ、キムワイプで拭いて乾かしてください。注：組織の最大4グラムを0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液4mlに均質化することができる、しかし、それは適切な分別を保証するために少ない組織を使用することをお勧めします。 </li><li> Tバックホモジナイズサンプルを転送同じ13ミリリットルポリプロピレンチューブO。予備後続のタンパク質定量、総タンパク質画分のウェスタンブロット分析のために-80℃でホモジネートし、店舗100μlの。 </li></ol>核画分を削除する4。低速遠心（上清S1に利回り） <ol><li>遠心し、4℃で10分間、900×gで固定角ローターでホモジネート。新しい上清（S1）を移し、13ミリリットルチューブを標識し、0.32MのHEPES緩衝スクロースを500μlの核画分のペレット（P1）を懸濁します。 NOTE：（P1）画分は-80℃で保存し、核画分のウエスタンブロット分析のために使用することができる。 </li></ol>粗製シナプトソーム画分の5。エンリッチメント（利回りペレットP2） <ol><li> 4℃で15分間のを10,000×gで遠心上清（S1）。その後のタンパク質定量のために-80℃で保存するために上清（S2）、および予備マイクロチューブ内の500μlのを削除しますificationおよび細胞質/光膜画分のウエスタンブロット分析。 0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液1ml中に残った粗シナプトソーム画分をペレット（P2）に再懸濁し、別の3ミリリットルの0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液を添加する。 </li><li> 4℃で15分間、10,000×gで遠心する。その後のタンパク質の定量化および細胞質/光膜画分のウエスタンブロット分析のために-80℃で保存するためのマイクロ遠心チューブに上清（S2 &#39;）と予備500μlのを削除します。ポリプロピレンチューブに洗浄された粗シナプトソームペレット（P2 &#39;）を保存します。 </li></ol>粗製シナプトソーム画分の6。·ライジング（低浸透圧ショック） <ol><li>溶解のddH 2 O 1ml中に再懸濁することによりポリプロピレンチューブ中の粗シナプトソームペレット（P2 &#39;）のddH 2 Oを別の3mlをガラステフロン組織ホモジナイザーに移し、追加し、3ストロークで、手で均質化する。注：これは重要です可能な限り迅速に、この手順を実行し、すぐに6.2に進みます。 </li><li>バック同じ13ミリリットルのポリプロピレンチューブに、急速にホモジナイザーからの振替サンプル混合する反転、1M HEPES溶液の16μlのバック4のHEPESにサンプルを調整します。 </li><li>完全な溶解を確実にするために30分間、4℃でサンプルを回転させます。 </li></ol>シナプトソーム膜画分の7。エンリッチメント（P3） <ol><li> 4℃で20分間25000×gで遠心する。原油水疱分画上清（S3）を取り外し、その後のタンパク質定量およびウエスタンブロット分析のために-80℃で保存するために5ミリリットルチューブにそれを予約。 0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液1mlにシナプトソーム膜画分（P3）を再懸濁する。 </li></ol>不連続ショ糖勾配の8。準備<ol><li>ピペットで正確に3.5ミリリットルの1.2M HEPES緩衝ショ糖溶液の正確3.0ミリリットルそれぞれ1.0 Mおよび0.8 M HEPEの独立した6ミリリットル中に、S-緩衝化ショ糖溶液はキャップチューブをはめ込みます。注：このスクロース勾配を作るために使用される緩衝液の体積を予め測定するために行われる。ボリュームの正確な測定は、得られた勾配超遠心分離のためにバランスされることを保証することが重要である。 </li><li>ガラスパスツールピペットや電球を使用して、12ミリリットルポリアロマー超遠心管に1.2MのHEPES緩衝スクロース溶液を移す。慎重に1.2MのHEPES緩衝スクロース溶液の上に1.0MのHEPES緩衝スクロース溶液をレイヤー。最後に、1.0MのHEPES緩衝スクロース溶液の上に0.8MのHEPES緩衝スクロース溶液をレイヤー。各ショ糖溶液のために、新鮮なパスツールピペットを使用し、ショ糖勾配を乱さないように注意してください。ベンチボルテックスまたはマイクロ遠心からの振動は、勾配の整合性を乱す。 </li><li>パスツールピペットを使用して、調製された不連続ショ糖勾配の上に再懸濁したシナプトソーム膜画分（P3）の層。勾配がスイングバケットローターのバケツの中にそれらの重量を測定することによってバランスされていることを確認。バケットがバランスの取れていない場合は、慎重に勾配の上部に0.32 M HEPES緩衝蔗糖を追加し、ローターバケットのバランスをとるP200ピペットを使用しています。 </li></ol>シナプス形質膜（SPM）の9分画<ol><li> 4℃で2時間150,000×gで、スイングバケットローターで超遠心分離機。慎重に超遠心バケットからショ糖勾配を削除します。 18 G針および1mlシリンジを用いて、1.0 M / 1.2 M HEPES緩衝スクロース溶液相間の下部にチューブを穿刺し、シナプス形質膜層（SPM）を引き出す。 </li><li>各SPMサンプルは1mlシリンジに占めるボリュームをメモしておいてください。各サンプルが調整された後、正確に4のHEPES、2.5容量の0.32 Mに1.2 Mからスクロース濃度を調整するために追加し、3.5ミリリットル厚肉超遠心管に集め、SPM層を配置edは0.32 Mスクロース、0.32MのHEPES緩衝ショ糖溶液で試験管のバランスをとる。 </li><li> 4℃で30分間200,000×gで固定角ローター中で超遠心機。上清を除去し、廃棄する。 50のHEPES / 2mMのEDTA溶液300μlのシナプス形質膜ペレット（SPM）を再懸濁します。 -80℃で保存サンプルは、ウェスタンブロッティングに使用するまで。 </li></ol>シナプス後肥厚画分の10。準備（PSD） <ol><li>氷上でのSPMのサンプルを解凍する。 </li><li> 50のHEPES / 2のEDTA溶液中の0.54％トリトンX-100の溶液を作る。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンチューブ中で、トリトンX-100 / HEPES / EDTA溶液および300μlのSPMフラクション2.7mlのを結合し、4°Cで15分間試料を回転させる</li><li> 4°Cで20分間32,000×gで3.5ミリリットル厚肉超遠心管、遠心サンプルに転送サンプル。 </li><li> -80上清（トリトンX-100可溶性画分[TS]）​​と店舗を予約;°C。注：この段階では、ペレットは「PSD-1T」割合を表す。界面活性剤による第二の治療は、「PSD-2T」部分を生成します。 PSD-1T画分が所望される場合、10.6に進む。 <ol><li> PSD-2T分画を生成するために、50mMのHEPES / 2mMのEDTA溶液中で0.5％トリトンX-100 3mlにペレットを再懸濁する。 4℃で15分間、サンプルを回転させます。 4℃で20分間、32,000×gで遠心分離した試料とは10.6に進みます。 </li></ol></li><li>上清を捨て、50のHEPES / 2のEDTA溶液中のシナプス後（PSD）ペレットを再懸濁。注：再懸濁体積はペレットのサイズに依存してもよい。 50〜75μlの容量を推奨します。 PSD画分は、界面活性剤不溶性画分であるため、タンパク質の完全な再懸濁を可能にするために0.5％SDSの1〜2μlを添加することがしばしば必要である。 -80℃で保存サンプルは、ウェスタンブロッティングに使用するまで。 </li></ol>

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<li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner%3A+conserved+Pex5p+WXXXF%2FY+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li>
<li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li>
<li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-100B%2C+neuron-specific+enolase+%28NSE%29%2C+myelin+basic+protein+%28MBP%29+and+glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+in+cerebrospinal+fluid+%28CSF%29+and+blood+of+neurological+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li>
<li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li>
<li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

成功した結果のために重要である手順にはいくつかのステップがあります。ステップ3では、均質化の一貫性の程度は、各サンプルについて達成されることが重要である。モーター駆動ホモジナイザーで組織を均質化する場合には、一定の速度を乳棒の回転のためだけでなく、ストローク数でも利用される。低張液の拡張均質化またはインキュベーションがミトコンドリアを溶解し、SPMサンプルを汚染するので、浸透圧ショック時のインキュベーション時間は、正確である必要があります。 もう一つの重要なステップは、試薬、特にスクロース溶液の調製である。ショ糖溶液のモル濃度が正しくない場合は手順が動作しません。したがって、スクロース溶液は、その後、正確な最終容量に4のHEPESを加える4のHEPES溶液中に溶解させ、ショ糖の重量を測定することによって準備する必要があります。トラブルシューティングのヒント：ENに準備されたショ糖溶液を用いた試験勾配を構築勾配が適切に組み立てられていることを確認してください。三つの異なる層の可視化を支援するための3つのスクロース溶液のうちの2つに（例えば、w / vの0.005％-0.02％の最終濃...

ニューロンは、シナプスを介して通信しており、この通信の品質はシナプスにおけるタンパク質の組成変化によって大幅に規制されている。特に、シナプス後密度で存在するタンパク質は、そのシグナル伝達系1と密接に足場神経伝達物質受容体による神経細胞のコミュニケーションに参加しています。さらに、シナプス効力の強度の持続的な変化は、シナプス後密度1-6で追加または受容体を除去することによって制御されている。したがって、シナプスタンパク質の単離および定量化は、神経細胞がシナプス効力7を刺激し、変更するための対応方法への洞察を得るために必要かつ有用な技術である。この記事では、不連続ショ糖勾配超遠心分離によって齧歯類脳組織からシナプスのタンパク質を分離するために一般的な手法について説明します。シナプス形質膜画分を濃縮することができるとに基づいて単離さ経験的に1.2Mのショ糖に類似すると判断されたショ糖でのその密度、。 生物学的問題によっては、細胞下画分は、スクロース又はパーコールのいずれかの連続または不連続勾配によって分離することができる。連続勾配は、複数の画分へのタンパク質の分離を可能に。これは、与えられた画分8内のタンパク質の共局在を実証するために特に有用であり得る。しかし、連続的な勾配の調製は、より面倒であり、多くの用途のためには不要である。不連続勾配は調製が比較的容易であり、少数の、一般的に定義された画分にタンパク質を分離するために使用することができます。増加モル濃度の三スクロースの層から構成されている不連続勾配が広くシナプス形質膜（SPM）に関連するタンパク質を単離するために使用されてきた。このシナプス形質膜画分は、さらに、シナプス後密度fractioに加工することができる界面活性剤不溶性画分の界面活性剤処理および分離によりn（PSD）。 このプロセスは、最初に1960年代9,10に記載されたときに、電子顕微鏡は、大まかに、シナプス形質膜およびシナプス後密度画分9-14を定義細胞小器官、膜を実証した。これらの研究は、シナプス前および後膜とSPM画分中のシナプス小胞を含めることを実証した。界面活性剤処理した後、主に電子密度の高い、シナプス後密度が見えた。手順では、低張性ショックは、電池本体10からシナプスプロセスをピンチオフするために使用される。このステップは、ミトコンドリア浸透圧ショックに対してより耐性であり、無傷のままであり、従ってそれらはショ糖勾配（ 図1）の底部に沈降するという事実を利用する。 これと同じ濃縮技術を使用して、SPMとPSD画分を生化学的に最初でした主要なタンパク質成分15〜17のポリアクリルアミドゲル電気泳動および配列決定によって定義される。続いてウェスタンブロット分析（ 図2）、これらの画分を定義し、さらに検出し、シナプスのタンパク質のレベルを定量化するために使用されている。私たちは、SLC6A3遺伝子座をマウス18で重複しているときに発生するドーパミントランスポーターのシナプスレベルの変化を定量化するために私たちの研究室でこの技術を使用している。また、DISC1のインタラクトーム19の一部であるタンパク質中のシナプス特異的な減少を明らかにNMDA受容体欠損マウスでは、この技術を使用している。 これは、SPM画分を、シナプス小胞膜タンパク質、エンドソームのマーカー、ミトコンドリアタンパク質、膜結合合成酵素およびシグナル伝達分子、ならびにシナプス後密度の不可欠な構成要素とシナプス形質膜20〜23を含有し、ウェスタンブロット分析から明らかである。 EVEN PSD画分を豊富ミトコンドリアタンパク質の混入を持つことができ、それは彼ら13を除去する第二の勾配沈降または追加の精製工程を実行する必要があるかもしれない。最近では、定量的な質量分析だけでは、シナプス後密度の100以上のタンパク質のリスト、ならびにこれらの構成要素24,25の相対存在量の指標を提供してきました。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES、pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖&nbsp;</td><td>バイオショップ</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>バイオベーシック</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>バイオショップ</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>バイオショップ</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>バイオショップ</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>バイオショップ</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>ベンザミジン</td><td>バイオショップ</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>ピロリン酸ナトリウム</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-グリセロリン酸</td><td></td><td>BioShop GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &frac12;&rdquo;ニードル</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc シリンジ</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>ガラステフロンホモジナイザー Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA モデル RW 16 ベーシックスターラー</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 固定角ローター</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus 遠心分離機</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ポリアロマーチューブ (13.2 ml)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti ロータースイングバケット</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン L-80 床超遠心分離</td>機 <td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>厚肉ポリカーボネートチューブ (3.5 ml)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 固定角ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>ベックマンTL-100卓上超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

神経細胞下分画技術がシナプスとの間で売買されているタンパク質の定量化を可能にします。もともと1960年代後半に記載されるように、シナプス形質膜に関連するタンパク質は、ショ糖密度勾配超遠心分離によって単離することができる。シナプス膜が単離されると、シナプス後密度として知られている高分子複合体は、続いて、その界面活性剤不溶性に単離することができる。シナプス形質膜およびシナプス後密度タンパク質を単離するために使用される技術は、40年後に本質的に同じままであり、広く現在の神経科学の研究で​​使用されている。この記事では、不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後密度に関連するタンパク質の分画について詳しく説明します。得られたタンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。

ショ糖密度勾配の調製は、ショ糖の3モルソリューション（0.8、1.0、1.2 Mショ糖）の明確な分離をもたらすはずである。タンパク質サンプルを添加する前勾配の例については、 図3Aを参照してください。勾配は、事前にあまり用意され、またはそれは他の機器からの振動をベンチ表面上に用意されている場合、勾配が損なわれ、適切な分離が達成されない場合。三つの溶液の明確な分離が表示されていない場合には、タンパク質試料を追加する前に、新しいグラデーションを作成することをお勧めします。タンパク質サンプルが追加されたショ糖勾配（黒矢印）の例については、 図3（b）を参照してください。 遠心分離後、各間期におけるタンパク質画の明確なバンド（0.32 / 0.8、0.8 / 1.0、1.0 / 1.2）があるはずです。加えてペレットをチューブの底に見えるはずです。例については、 図3Cを参照してください超遠心分離後の留バンドの。画分だけ、間で拡散して存在している場合、それは勾配が侵害された更なる処理をお勧...

この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

この手順の全体的な目標は、不連続なスクロース勾配を使用して脳組織の細胞内分画を実証し、シナプス膜とシナプス後の密度からタンパク質を濃縮することです。これは、まずパワードホモジナイザーで脳組織を均質化することによって達成されます。次に、粗膜タンパク質抽出物を調製するための一連の遠心分離ステップです。次に、メンブレン抽出物を不連続なショ糖勾配上に重ねて、超遠心分離を行います。最後のステップは、グラジエントからタンパク質を収集することです。最終的に、ウェスタンブロット解析により、シナプスタンパク質レベルの変化を示すことができます。これは、40年以上にわたって神経科学者によって使用されてきた確立された技術です。私たちの研究室では、さまざまな神経伝達物質系を乱したときにシナプスのタンパク質組成がどのように変化するかを理解するためにこれを使用しています。この手法が他の方法(呼び出しごとの勾配や連続的なショ糖勾配など)と比較した場合の主な利点は、不連続なショ糖勾配を手作業で簡単に構築できることです。このプロトコルは、モーター駆動のガラステフロンホモジナイザーを利用し、常にサンプル間の乳棒を交換し、すすぎ、乾燥させます。ホモジナイザーはまず、解剖した組織を 4 ミリリットルの 0.32 モル HEPA 緩衝ショ糖溶液を含む 13 ミリリットルのチューブにロードします。次に、ティッシュを清潔なガラスのホモジナイザーに移します。モーターを900RPMに設定し、4グラム未満の組織を使用して30秒以上12回のストロークでサンプルを均質化することで、サンプルをチューブに戻し、タンパク質分析のために100マイクロリットルのアリコートをマイナス80°Cで保存します。次に、ホモジネートを900Gで10分間紡糸して核物質を分離します。摂氏4度で、上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。上清には粗膜画分が含まれています。今、粗いシナプトソーム遠心分離機、4°Cで15分間10, 000 Gで上清を濃縮するために、上清を除去します。ペレットには、粗シナプトソーム画分Resusが含まれています。それを1ミリリットルの0.32モルスクロース溶液に懸濁します。その後、懸濁液に溶液の別の3ミリリットルで、15分間粗画分を遠心分離機に 10, 000 Gで摂氏4度で、上清を除去します。次に、ペレットをすばやくシラミにし、ペレットをミリリットルの純水に再懸濁します。次に、さらに3ミリリットルの水を急速に加えます。これをホモジナイザーに移します。手で3ストロークを適用し、13ミリリットルのチューブに戻します。1モルHEAを16マイクロリットル添加してサンプルを4ミリモルHEAに素早く戻し、反転して混合します。次に、サンプルを摂氏4度のローテーターに30分間置きます。サンプルの溶解を確実に行うには、Ly

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。...

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。...

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

このプロトコルは、結合したリボソームの数に基づいて植物組織から転写物を抽出し、分画する簡単な方法を説明しています。これにより、翻訳活性の全体的な推定と、特定のmRNAの翻訳状態の決定が可能になります。...

工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

シナプスの可塑性と記憶を制御する分子と経路の同定は、神経科学における依然として大きな課題です。ここでは、聴覚学習パラダイムにおける学習および記憶の固定化中にシナプスの分子再編成に関与すると思われるシナプスタンパク質の相対定量化に対処するワークフローについて説明します。...

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。...

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々...

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。...

哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

このプロトコルは、マウスの脳から高純度のシナプトソーム、シナプス小胞、およびその他のシナプス画分を取得するための堅牢で詳細な方法を提供します。この方法は、タンパク質の局在と機能の生化学的分析を含むシナプスプロセスのコンパートメント分解能での評価を可能にします。...

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。...

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

学ぶ 不連続ショ糖勾配超遠心分離によるシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の精製法。脳組織のサブセルラー分画を用いて神経科学研究でタンパク質動態を解析する基盤技術です。

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

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