一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

この手順の全体的な目標は、ライブイメージングによって脳由来神経栄養因子またはBDNFの逆行性軸索輸送を追跡することです。これは、最初にポリリジンコーティングされたカバースリップ上にマイクロ流体チャンバーを組み立てることによって達成されます。第2のステップでは、解離したラットE18海馬ニューロンが解剖され、マイクロ流体チャンバーの細胞体コンパートメントに播種されます。

次に、ニューロンを培養して、軸索がマイクログルーブを横切ってチャンバーの軸索コンパートメントに拡張できるようにします。最後のステップでは、BDNFとラベル付けされた量子ドットが軸索コンパートメントに追加されます。最終的には、蛍光顕微鏡を使用して、海馬ニューロンの軸索内のBDNFの動きを評価できます。

B-D-F-E-G-I-PやBDFMチェリーラベリングのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、量子ドットでBDFをラベリングすることで、軸索内の単一のBDF二量体の光イメージングが可能になり、手順が実証されることです。私の左の3つからポストドットを描き、まずマイクロ流体チャンバーを1%aoxで手洗いし、続いてミリQ水で30分間を3回すすぎます。次に、チャンバーを70%エタノールで手洗いした後、層流フードでパラムで乾燥させ、チャンバーの両側をUV光で20分間滅菌し、放射されたチャンバーを室温でパラムで密封した滅菌15センチメートルの皿に保管します。

次に、24×40ミリメートルを浸します。ナンバーワンのガラスカバーは、ローテーターで一晩中10%塩酸を滑り込ませ、最後の洗浄後に30分間水で3回洗浄します。各カバースリップを100%エタノールに浸して滅菌し、続いてブンゼンバーナーで炎上し、室温で滅菌ペトリ皿で乾燥させて保管します。

カバースリップをコーティングするには、15cmの培養皿にスリップを置き、それぞれに0.01%ポリLリジン0.7ミリリットルを重ねます。組織培養フードで1時間のインキュベート後、カバースリップを滅菌水で再度3回すすぎ、真空で乾燥させて6cm培養皿に入れます。次に、滅菌チャンバーの1つを、マイクログルーブ側を下に向けてポリLリジンコーティングされたカバースリップの上に置きます。

マイクログルーブに触れないように注意し、マイクロピペットチップを使用してチャンバーを優しく押し下げ、組み立てたマイクロ流体チャンバーをしっかりと密閉します。次に、2つのE 17〜E 18ラットのカバカンピを、2ミリリットルの解剖緩衝液を含む15ミリリットルの円錐管に入れ、毎回5ミリリットルの解剖緩衝液で組織を3回すすぎます。次に、洗浄液をできるだけ多く取り除き、900マイクロリットルの新鮮な解剖バッファーを追加して組織を消化します。

次に、100マイクロリットルの2.5%トリプシンを組織に加え、チューブを摂氏37度の水浴に入れます。10分間の消化後、100マイクロリットルのDNA1を加え、ファイヤーポリッシュされたPEガラスピペットを使用して、混合直後に組織を5〜10回穏やかに上下にトライレートします。2ミリリットルのめっき培地でトライインを急冷し、破片が組織培養フード内でチューブの底に5分間沈殿するのを待ちます。

次に、2ミリリットルの上清を清潔な滅菌15ミリリットルの円錐管に慎重に移し、細胞をスピンダウンします。ペレットを50マイクロリットルのめっき培地に懸濁し、次いで計数後、15〜20マイクロリットルの細胞懸濁液をマイクロ流体チャンバの1つのコンパートメントにロードする。チャンバーを10分間インキュベートして細胞をカバースリップに付着させ、さらにプレーティング培地を追加してチャンバーの両方のコンパートメントを埋めます。

インキュベーションの1日後、プレーティング培地を細胞体と軸索コンパートメントの両方で維持培地と交換します。3日目には、海馬ニューロンからの軸索がマイクログルーブを横切り始め、5日目から7日目の間に軸索コンパートメントに到達します。この間、量子標識BDNF軸索輸送のライブイメージングの前に、24〜48時間ごとに培養培地の半分を新鮮なメンテナンス培地と交換します。

BDNF枯渇中に、マイクロ流体チャンバーの両方のコンパートメントをBDNFフリー血清フリーニューロ基礎培地で30分ごとに2時間徹底的にすすぎ、50ナノモルモノビオチン化BDNFダイマーを50ナノモル量子でインキュベートします。氷上で神経基礎培地で6、5、5、5ストリッピンコンジュゲートを60分間行います。次に、軸索コンパートメント内のメディアを300マイクロリットルのBDNFと標識された量子ドットと交換し、摂氏37度で4時間、BDNFとラベル付けされた量子ドットの細胞体コンパートメントへの拡散を最小限に抑えます。

インキュベーション、ウォームアップ、倒立顕微鏡の終了時に、100 x オイル対物レンズと環境チャンバーを備えた、装置がウォームアップしている間、摂氏37度と二酸化炭素5%の一定温度に環境チャンバーを備えた、細胞体コンパートメント内の培地を常に高レベルに維持することが非常に重要です。BDNFとラベル付けされた未結合の量子ドットをマイクロ流体チャンバーから洗い流し、次にテキサスレッドの励起キューブと発光キューブのセットを使用して、量子ドット6 5 5信号を視覚化します。最後に、CCDカメラを使用して、中軸索内のタイムラプス画像を1秒あたり1フレームの速度で合計2分間キャプチャします。

浸潤のコントロールとしてQDを持たない軸索のない微小溝を使用し、適切な画像解析ソフトウェアを使用してBDNF輸送を解析する 量子ドット標識BDNF信号輸送のタイムラプスイメージングでは、軸索のある微小溝のほとんどで量子ドット信号が観察されますが、軸索のない微小溝では量子信号は見られず、軸索コンパートメントからの量子ドット信号の拡散がほとんどまたはまったくないことを示していますここのセル本体コンパートメントに。海馬ニューロン軸索の80マイクロメートルの長さのセグメントを100秒間蛍光で記録しました。合計6個です。

イメージング中に量子BDNF信号がはっきりと認められ、3つの信号が細胞体に向かって一方向に移動することが観察されました。1つのシグナルは、約70秒で全電場を横切る細胞体にスムーズに移動することが観察されました。別のものは、最初の20秒間は逆行性に移動し、10〜20秒間は順行性運動に切り替え、最後の20秒間は再び細胞体に向かって方向を変えることが観察されました。

3番目のイベントも逆行方向に移動することが注目されましたが、移動の途中で約20秒間一時停止します。このBDNF輸送と標識された量子ドットの最初の代表的なチャイムグラフでは、BDNFと標識された量子ドットが細胞体に向かって迅速かつスムーズに移動し、約60秒で80マイクロメートルのフィールドを横切りました。この秒クロノグラフでは、クォンタムBDNFは120秒で約50マイクロメートルの逆行方向に進み、少なくとも3つのセグメントが長い休止を挟みました。

最後に、散布図は、BDNFとラベル付けされた各量子ドットの移動速度、平均速度、および一時停止時間を測定します。BDNFと標識された量子ドットの移動速度は、毎秒0.47〜1.97マイクロメートルの範囲で比較的速く、平均は毎秒1.06±0.05マイクロメートルでした。輸送中のBDNFの一時停止のため、平均速度は移動速度よりもはるかに低く、平均0.48±0.03マイクロメートル/秒、平均一時停止時間は15.88±1.30秒でした。

この技術により、神経科学の分野の研究者は、健康なニューロンと疾患ニューロンのニューロトロフィンと受容体の輸送を調査できます。