Name: 一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ 量子ドット標識BDNFの一次ニューロン軸索輸送のライブイメージング法。マイクロ流体チャンバーを用いてラット海馬ニューロンで神経栄養因子の動態をリアルタイムで追跡し、神経変性疾患の理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、彼らの技術支援のための越（ポーリン）胡、レイチェルSINITに感謝したいと思います。研究は、NIHの助成金（PN2 EY016525）によって、及びダウン症の研究と治療財団とラリーL. Hillblom財団からの資金によってサポートされています。

外科および動物の手順は厳密に実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って行われる。動物の使用を含む全ての実験は、UCSDの施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 1プラスミドのクローニング、モノビオチン化BDNFの発現および精製（mBtBDNF） 注：HEK293FTセル10におけるpcDNA3.1ベクターと共発現に予めproBDNFaviとBirAをするcDNAを構築します。 mBtBDNFは、成熟生物学的に活性モノビオチン神経成長因子（mBtNGF）10を製造する以前に公開された方法に従ってのNi-NTAビーズを用いて精製する。 マイクロ流体チャンバーの調製マイクロ流体ニューロン培養装置は、流体ニューロン細胞体から軸索を単離することができる。右の各解剖前にコーティングされたばかりカバースリップでチャンバーを組み立てます。使用マイクロ流体室このプロトコルで、商業的に（資機材の表を参照）を購入している。手洗いや5-6xまでの再利用、商業的に購入室。 <ol><li>手洗い1％Alconoxマイクロ流体室。 30分ごとにミリQ水で3回すすいでください。手を70％エタノールで再びチャンバを洗浄する。 </li><li>層流フード中でパラフィルム上で乾燥さ室をレイアウト。 UV下で20分間チャンバーの両側を照射し、滅菌する。ストアは、室温でパラフィルムで密封し、滅菌15cmの皿にチャンバを滅菌した。 </li><li>ガラス容器に24×40ミリメートル1号カバーガラスを配置します。一晩回転装置に35％の塩酸でカバースリップを浸す。翌日、30分水でそれぞれにカバースリップを3回すすいでください。 </li><li>カバースリップを100％エタノールに各カバースリップを浸漬し、ブンゼンバーナーの上に炎によって一枚ずつ滅菌する。無菌ペトリ皿に乾燥カバースリップを保存し、コーティングまで室温で保管してください。 </li><li> OUを置き15cmの培養皿にカバースリップはt。コー​​ト0.01％ポリ-L-リジン（PLL）0.7mlを各カバースリップとは、室温でフード内でインキュベートする。 </li><li> 1時間後、カバースリップを滅菌水で3回リンス。ドライカバーガラス、真空とし、6cmの培養皿に各カバースリップを配置。 </li><li>マイクロ流体チャンバーを組み立てるために、マイクログルーブに触れないように注意して、PLLコーティングしたカバーガラス上に下部にマイクログルーブ側でチャンバーを配置。優しく室が密閉されたことを確認するためにピペットチップでチャンバーを押し下げる。 </li></ol>チェンバースでの神経文化、プレートの3解剖<ol><li> 1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mMのHEPESと2ミリリットル解剖バッファー（HBSS、無カルシウム、ないマグネシウムを含む15ミリリットルコニカルチューブ中で解剖2 E17-E18ラット海馬（1脳）を配置します。組織をすすぎ5mlで3倍解剖できる限り解剖バッファを削除してください。たびにバッファリングし、新鮮なディ900μlのを追加ssectionバッファ。 </li><li>組織を消化するために、1×作業濃度を作るために解剖バッファーに10倍のトリプシン（2.5％）の100μlを添加する。 37℃の水浴中で円錐管を置き。消化の10分後、1 mg / mlの周りの最終濃度に10 mg / mlのDNase Iを100μlのを追加します。 </li><li>ファイアーポリッシュパスツールガラスピペットを使用して、静かにピペッティング5〜10倍によって組織を粉砕する。右粉砕後、（10％FBS、2mMのグルタマックス、2％のB27とのNeurobasal）培地めっき2mlのトリプシンをクエンチする。 </li><li>組織のいずれ破片が底に落ち着くことができるように5分間フード内のサンプルのままにしておきます。慎重に細胞をペレットに5分間200×gで清潔な無菌の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に上清の2ミリリットルを削除します。 50μlのメッキメディアでペレットを再懸濁</li><li>血球計算板を用いて細胞を数える。負荷のマイクロ流体チャンバーの1区画への15〜20μlの細胞懸濁液（〜40,000細胞）。チャンバーを配置細胞がカバーグラスに付着することを可能にする10分間インキュベーター中。 10分後、チャンバーの両方の区画を埋めるために、よりメッキメディアを追加。 </li><li>解剖の二日目に、完全に細胞体と軸索コンパートメントの両方で維持培地（2mMのグルタマックス、2％のB27と神経基本）でメッキのメディアを交換してください。海馬ニューロンからの軸索は、3日目に微小溝を渡り、一日5-7間の軸索コンパートメントに到達するために開始します。この期間中、新鮮な維持培地ごとに24〜48時間で培養培地の半分を交換してください。 </li></ol> QD-BDNFの4軸索輸送<ol><li>徹底的に2時間BDNFフリー、無血清神経基本培地で両方の区画ごとに、30分をすすぐことにより、マイクロ流体チャンバーの細胞体と軸索のコンパートメントの両方からのBDNFを枯渇、QD-BDNF軸索輸送のイメージングを生きる前に。 </li><li> BDNFの枯渇時には、QD-BDNF結合体を準備します。モノビオチン化BDの50 nMのミックスNFの神経基礎培地中の50 nMのQD655-ストレプトアビジン抱合体と二量体と60分間氷上でインキュベートする。 </li><li>軸索コンパートメントにメディアを取り出し、37℃で4時間、0.25 nMでの最終濃度で300μlのQD-BDNFを追加します。細胞体区画にQD-BDNFの拡散を最小限に抑えるためには、常に軸索区画におけるよりも細胞体コンパートメント内のメディアのより高いレベルを維持することは非常に重要である。ライブイメージングの前インキュベーション後に、結合していないQD-BDNFを洗い流す。 </li><li> 100X油対物レンズを備えた倒立顕微鏡を用いてQD-BDNF輸送のライブイメージングを実施する。範囲および一定温度（37℃）とCO 2（5％）、それに取り付けられた環境室を温める。 QD655信号を可視化するためにテキサスレッド励起/発光キューブのセットを使用してください。 </li><li>取得しCCDカメラを用いて2分間、合計1フレーム/秒の速度で中間軸索内のタイムラプス画像を取り込む。股関節のない軸索とマイクログルーブを使用してくださいtは浸潤のコントロールとして何QDので、無信号がありません。 </li><li>任意の画像解析ソフトウェアまたはNIHのImageJを使用して、BDNF輸送を分析します。 </li></ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptors%3A+roles+in+neuronal+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li>
<li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li>
<li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon%3A+a+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li>
<li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor%3A+a+slow+route+to+the+signaling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li>
<li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li>
<li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li>
<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

利害関係が宣言されていない。

本研究では、生物学的に活性な生成するための新しい技術の開発を報告し、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）がモノビオチン化。量子ドットストレプトアビジンにタンパク質をコンジュゲート、およびマイクロ流体チャンバを使用することにより、この方法は、1つはリアルタイムでかつ空間的及び時間的解像度で、単一分子感度を有する一次ニューロンにおけるBDNFの軸索輸送を検出することを可能にする。ここに使用されるツールは、健康および疾患におけるニューロンにおけるBDNF / TrkBのシグナル伝達エンドソームの軸索輸送を仲介する分子機械を研究する手段を提供する。 BDNF-GFP、または-mCherryは、 インビトロでさまざまな神経細胞培養におけるBDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。これらの試薬は、TrkBの自己分泌の活性化を調べるため、場合によっては、順行性輸送を調べ用のオプションを提供しています。しかし、WHIの逆行性輸送を研究するための、最も顕著な主要な欠点​​がありますchがGFP又はmCherryを、単一の分子研究...

ニューロンは、高度が長く、多くの場合、非常に精緻化プロセスの確立及び神経回路の構造および機能を維持するための基本である細胞を分極されている。軸索はシナプスとの間で貨物を運ぶ重要な役割を果たしている。細胞体で合成されたタンパク質および細胞小器官は、神経機能をサポートするために、シナプス前末端に到達するために軸索を通って輸送される必要がある。これに対応して、遠位軸索で受信された信号は、形質導入し、細胞体に搬送する必要がある。これらのプロセスは、ニューロンの生存、分化および維持に必須である。いくつかのニューロンにおけるその軸索輸送が距離を通って1000倍以上細胞体の直径を行わなければならないでは、可能性は容易に小さくても赤字は著しく、神経回路機能に影響を与える可能性があることが想定される。 脳由来神経栄養因子（BDNF）、増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ミリアンペアで存在する海馬、大脳皮質、および前脳基底核を含むニューヨークの脳領域、。 BDNFは、認知回路に関与するニューロンの生存、分化、および機能をサポートすることによって、認知および記憶形成において重要な役割を果たしている。 BDNFは、それがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（MAPK / ERK）、ホスファチジルイノシトール3 - キナーゼを含むのTrkB媒介性シグナル伝達経路を活性化する軸索末端に、その受容体、チロシンキナーゼのTrkBに結合する（PI3K）およびホスホリパーゼC-ガンマ（PLCγ）。これらのシグナル伝達経路に関与するタンパク質を、逆行性神経細胞の細胞体に輸送され、エンドソーム1-6シグナリング BDNF / TrkBのを形成するために、エンドサイトーシス小胞構造にパッケージ化されています。 マイクロ流体培養チャンバーは、通常の条件下でだけでなく、怪我や病気7,8の設定で軸索生物学を研究するための非常に便利なプラットフォームです。軸索を分離することにより細胞体から、デバイスは、1つの軸索8-10で特異的に輸送を研究することができました。本研究で用いた450μmでマイクログルーブの障壁とPDMSベースのマイクロ流体プラットフォームは、商業的に（材料の表を参照）から購入した。 BDNF輸送を調べるために、モノビオチン化BDNF（mBtBDNF）を生成するための新規な技術を開発しました。私たちは（またAviTagをとして知られている）のビオチンアクセプターペプチドは、APを利用しました。これは、特に、大腸菌酵素ビオチンリガーゼ、BirAをすることによって、ビオチンに連結することができるリジン残基を含む15アミノ酸配列である。私たちは、PCR（ 図1A）、マウスプレproBDNF cDNAのC末端にAviTagを融合。構築物は、哺乳動物発現ベクター、をpcDNA3.1 mycを、彼のベクターにクローニングした。またをpcDNA3.1のmyc彼のベクターに細菌のBirA DNAをクローン化した。二つのプラスミドを一過両方のタンパク質を発現させるためにHEK293FT細胞に同時トランスフェクトした。 BirAをはビオのライゲーションを触媒するモノビオチン化BDNFモノマーを製造するために：1の比率、特にリジンの1でBDNFのC末端にAviTagを内に存在する。 〜18 kDaの分子量を有するビオチン化、成熟BDNFをNi-樹脂（ 図1C）を用いて培地から回収して精製した。イムノブロッティング（ 図1D）で修正されていないBDNFを検出することができないことによって判断されるようにBDNFのビオチン化は、完了した。ストレプトアビジン共役量子ドット、量子ドット655は、QD-BDNFを作るためにmBtBDNFを標識するために使用された。 mBtBDNFは、リン酸化のTrkB（ 図1E）を活性化し、組換えヒトBDNF（rhBDNF）程度に神経突起伸長（ 図1F）を刺激することができたとしてAviTagをの存在は、BDNFの活性を妨害しませんでした。免疫染色は、QD-BDNFはQD-BDNFは、生物活性（ 図1G）であることを示す、海馬軸索でのTrkBと共局在することが示さ。 BDNF輸送を研究するために、QD-BDNFは、遠位軸索区画に添加したラットE18海馬ニューロン（ 図2A）を含むマイクロ流体文化。軸索内のQD-BDNF逆行性輸送を赤色蛍光タグ（ 支援動画S1、S2）のリアルタイムライブイメージングによって捕獲された。生成されたカイモグラフを分析することによって、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒（ 図3A）の移動速度で逆行性に輸送されることが観察された。 GFPまたはmCherryをタグ付きBDNFは、BDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。主な欠点は、それらが単一分子研究のための十分に明るいではないということです。また、順行性および逆行性BDNFの動きの両方の存在は、それが困難な逆行性輸送BDNFは、ニューロトロフィン/受容体複合体にあったかどうかを評価することができる。 このビデオでは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内にQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証する。 ultrabrightnessと量子ドットのMAKの優れた光安定性エスことが可能BDNF輸送の長期的な追跡を実行する。これらの技術は、AD、HD、および他の神経変性疾患において、軸索機能の研究を強化するために利用することができる。

<table><tbody><tr><td>Platinum pfx DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>フェルメンタス</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT細胞</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-高グルコース培地</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-ビオチン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>ターボフェクト&nbsp;</td><td>フェルメンタス</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P7626</td><td></td></tr>ア<tr><td>プロチニン</td><td>シグマ</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルNTA樹脂</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグ</td>マ<td>&nbsp;S8820</td><td></td></tr><tr><td>シルバー染色キット&nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chambers</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 ガラスカバースリップ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン&nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>ギブコ</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>インビトジェン</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp;&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-ストレプトアビジンコンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Q10121MP抗Aviタグ抗体</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-アガロースビーズ&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>&nbsp;SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Σ</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>抗pTrkB抗体</td> NYU <td></td><td></td>anti-TrkB antibody BD Science 610101 <td>の M. Chao 博士からの寛大な贈り物</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたbdnfの軸索輸送のリアルタイムイメージング

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNFは、神経細胞の生存、分化、および機能のいくつかのファセットに重要な役割を果たしている。軸索における構造的および機能的障害は、ますますアルツハイマー病（AD）およびハンチントン病（HD）を含む神経変性疾患の早期の特徴とみなされる。未だ不明な軸索損傷が誘導される機構（単数または複数）である。私たちは、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）モノビオチン、生物学的に活性な生産する新規な技術の開発を報告した。量子ドットで標識されたBDNF（QD-BDNF）がmBtBDNFに量子ドット655を結合させることにより作製した。マイクロ流体デバイスは、ニューロン細胞体から軸索を単離するために使用した。軸索コンパートメントへのQD-BDNFを添加すると、軸索におけるBDNF輸送のライブイメージングを可能にした。私たちは、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒の移動速度で、非常に少数のポーズで、逆行本質的に排他的に移動させることを実証した。このシステムは私を調査するために使用することができADまたはHDビデオで破砕軸索機能だけでなく、他の変性疾患のchanisms。

生産と生物学的に活性なモノビオチン化BDNFの精製 AviTagをシーケンス（GGGLNDIFEAQKIEWHE）と融合したBDNFの発現ベクターは、以前に公開されたプロトコル10に従って作成されました。完全長融合タンパク質の分子量は〜32kDaのが（であると予測された<a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ）18 kDaの（ 図1A）の予測分子量を有するモノビオチン化成熟BDNFを製造した馴化培地からHEK293FT細胞および精製された10に記載されるように。 異なる画分を回収し、15％SDS-PAGE上で分離した。ウサギ抗アビタグ抗体を用いて、〜18 kDaの分子量を有するバンドが第一の画分（ 図1B）で検出された。調製物の純度を試験す...

BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

この手順の全体的な目標は、ライブイメージングによって脳由来神経栄養因子またはBDNFの逆行性軸索輸送を追跡することです。これは、最初にポリリジンコーティングされたカバースリップ上にマイクロ流体チャンバーを組み立てることによって達成されます。第2のステップでは、解離したラットE18海馬ニューロンが解剖され、マイクロ流体チャンバーの細胞体コンパートメントに播種されます。次に、ニューロンを培養して、軸索がマイクログルーブを横切ってチャンバーの軸索コンパートメントに拡張できるようにします。最後のステップでは、BDNFとラベル付けされた量子ドットが軸索コンパートメントに追加されます。最終的には、蛍光顕微鏡を使用して、海馬ニューロンの軸索内のBDNFの動きを評価できます。B-D-F-E-G-I-PやBDFMチェリーラベリングのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、量子ドットでBDFをラベリングすることで、軸索内の単一のBDF二量体の光イメージングが可能になり、手順が実証されることです。私の左の3つからポストドットを描き、まずマイクロ流体チャンバーを1%aoxで手洗いし、続いてミリQ水で30分間を3回すすぎます。次に、チャンバーを70%エタノールで手洗いした後、層流フードでパラムで乾燥させ、チャンバーの両側をUV光で20分間滅菌し、放射されたチャンバーを室温でパラムで密封した滅菌15センチメートルの皿に保管します。次に、24×40ミリメートルを浸します。ナンバーワンのガラスカバーは、ローテーターで一晩中10%塩酸を滑り込ませ、最後の洗浄後に30分間水で3回洗浄します。各カバースリップを100%エタノールに浸して滅菌し、続いてブンゼンバーナーで炎上し、室温で滅菌ペトリ皿で乾燥させて保管します。カバースリップをコーティングするには、15cmの培養皿にスリップを置き、それぞれに0.01%ポリLリジン0.7ミリリットルを重ねます。組織培養フードで1時間のインキュベート後、カバースリップを滅菌水で再度3回すすぎ、真空で乾燥させて6cm培養皿に入れます。次に、滅菌チャンバーの1つを、マイクログルーブ側を下に向けてポリLリジンコーティングされたカバースリップの上に置きます。マイクログルーブに触れないように注意し、マイクロピペットチップを使用してチャンバーを優しく押し下げ、組み立てたマイクロ流体チャンバーをしっかりと密閉します。次に、2つのE 17〜E 18ラットのカバカンピを、2ミリリットルの解剖緩衝液を含む15ミリリットルの円錐管に入れ、毎回5ミリリットルの解剖緩衝液で組織を3回すすぎます。次に、洗浄液をできるだけ多く取り除き、900マイクロリットルの新鮮な解剖バッファーを追加して組織を消化します。次に、100マイクロリットルの2.5%トリプシンを組織に加え、チューブを摂氏37度の水浴に入れます。10分間の消化後、100マイクロリットルのDNA1を加え、ファイヤーポリッシュされたPEガラスピペットを使用して、混合直後に組織を5〜10回穏やかに上下にトライレートします。2ミリリットルのめっき培地でトライインを急冷し、破片が組織培養フード内でチューブの底に5分間沈殿するのを待ちます。次に、2ミリリットルの上清を清潔な滅菌15ミリリットルの円錐管に慎重に移し、細胞をスピンダウンします。ペレットを50マイクロリットルのめっき培地に懸濁し、次いで計数後、15〜20マイクロリットルの細胞懸濁液をマイクロ流体チャンバの1つのコンパートメントにロードする。チャンバーを10分間インキュベートして細胞をカバースリップに付着させ、さらにプレーティング培地を追加してチャンバーの両方のコンパートメントを埋めます。インキュベーションの1日後、プレーティング培地を細胞体と軸索コンパートメントの両方で維持培地と交換します。3日目には、海馬ニューロンからの軸索がマイクログルーブを横切り始め、5日目から7日目の間に軸索コンパートメントに到達します。この間、量子標識BDNF軸索輸送のライブイメージングの前に、24〜48時間ごとに培養培地の半分を新鮮なメンテナンス培地と交換します。BDNF枯渇中に、マイクロ流体チャンバーの両方のコンパートメントをBDNFフリー血清フリーニューロ基礎培地で30分ごとに2時間徹底的にすすぎ、50ナノモルモノビオチン化BDNFダイマーを50ナノモル量子でインキュベートします。氷上で神経基礎培地で6、5、5、5ストリッピンコンジュゲートを60分間行います。次に、軸索コンパートメント内のメディアを300マイクロリットルのBDNFと標識された量子ドットと交換し、摂氏37度で4時間、BDNFとラベル付けされた量子ドットの細胞体コンパートメントへの拡散を最小限に抑えます。インキュベーション、ウォームアップ、倒立顕微鏡の終了時に、100 x オイル対物レンズと環境チャンバーを備えた、装置がウォームアップしている間、摂氏37度と二酸化炭素5%の一定温度に環境チャンバーを備えた、細胞体コンパートメント内の培地を常に高レベルに維持することが非常に重要です。BDNFとラベル付けされた未結合の量子ドットをマイクロ流体チャンバーから洗い流し、次にテキサスレッドの励起キューブと発光キューブのセットを使用して、量子ドット6 5 5信号を視覚化します。最後に、CCDカメラを使用して、中軸索内のタイムラプス画像を1秒あたり1フレームの速度で合計2分間キャプチャします。浸潤のコントロールとしてQDを持たない軸索のない微小溝を使用し、適切な画像解析ソフトウェアを使用してBDNF輸送を解析する 量子ドット標識BDNF信号輸送のタイムラプスイメージングでは、軸索のある微小溝のほとんどで量子ドット信号が観察されますが、軸索のない微小溝では量子信号は見られず、軸索コンパートメントからの量子ドット信号の拡散がほとんどまたはまったくないことを示していますここのセル本体コンパートメントに。海馬ニューロン軸索の80マイクロメートルの長さのセグメントを100秒間蛍光で記録しました。合計6個です。イメージング中に量子BDNF信号がはっきりと認められ、3つの信号が細胞体に向かって一方向に移動することが観察されました。1つのシグナルは、約70秒で全電場を横切る細胞体にスムーズに移動することが観察されました。別のものは、最初の20秒間は逆行性に移動し、10〜20秒間は順行性運動に切り替え、最後の20秒間は再び細胞体に向かって方向を変えることが観察されました。3番目のイベントも逆行方向に移動することが注目されましたが、移動の途中で約20秒間一時停止します。このBDNF輸送と標識された量子ドットの最初の代表的なチャイムグラフでは、BDNFと標識された量子ドットが細胞体に向かって迅速かつスムーズに移動し、約60秒で80マイクロメートルのフィールドを横切りました。この秒クロノグラフでは、クォンタムBDNFは120秒で約50マイクロメートルの逆行方向に進み、少なくとも3つのセグメントが長い休止を挟みました。最後に、散布図は、BDNFとラベル付けされた各量子ドットの移動速度、平均速度、および一時停止時間を測定します。BDNFと標識された量子ドットの移動速度は、毎秒0.47〜1.97マイクロメートルの範囲で比較的速く、平均は毎秒1.06±0.05マイクロメートルでした。輸送中のBDNFの一時停止のため、平均速度は移動速度よりもはるかに低く、平均0.48±0.03マイクロメートル/秒、平均一時停止時間は15.88±1.30秒でした。この技術により、神経科学の分野の研究者は、健康なニューロンと疾患ニューロンのニューロトロフィンと受容体の輸送を調査できます。

real-time-imaging-axonal-transport-quantum-dot-labeled-bdnf-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。...

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

このプロトコルではのライブ解剖について説明...

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

出典: Winkle, C. C., et al. 軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。(2016年)このビデオでは、示差干渉コントラスト (DIC) 顕微鏡を使用して、皮質ニューロンの軸索分岐をリアルタイムで観察するライブ...

マウス皮質ニューロンにおける軸索分岐のリアルタイム in vitro イメージング

ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳の生体調における高刺激性樹状フィロポディアの画像化に用いた方法と、デンドライトの定量的評価のためのタイムラプス3Dイメージングデータセットを定量化するために開発したプロトコルについて説明します。ニューロンの発達におけるダイナミクス。...

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Avi配列を含む組換えBDNF(BDNFAvi)は、コスト効率の高い方法でHEK293細胞で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。BDNFaviは、その後、チューブ内の酵素BirAで直接モノビオチン化されます。BDNFaviおよびモノビオチン化BDNFaviは、市販のBDNFと比較して生物学的活性を保持します。...

ニューロンの細胞密売研究のためのチューブ内の組換えBDNFを精製し、直接モノビオチン化するための改良されたプロトコル

光活性化可能なニューロフィラメントタンパク質を発現するトランスジェニックマウス由来の末梢神経の単一ミリン化軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析する蛍光光活性化法について説明する。...

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。...

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

この論文では、生きた線虫の内因性標識カーゴの軸索輸送を単一ニューロン分解能で視覚化するための蛍光顕微鏡取得パラメータの最適化について説明しています。...

Living Caenorhabditis elegansにおける蛍光顕微鏡による内因性貨物の軸索輸送の可視化の最適化

学ぶ 量子ドット標識BDNFの一次ニューロン軸索輸送のライブイメージング法。マイクロ流体チャンバーを用いてラット海馬ニューロンで神経栄養因子の動態をリアルタイムで追跡し、神経変性疾患の理解に貢献します。

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

さらに動画を探す