Name: の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶトランスポゼースベースの技術によるgDNAエンリッチメント法で、DNA損傷修復関連11遺伝子の全配列を同時にNGS解析する効率的なプロトコルです。2週間以内に結果が得られ、従来のサンガー法より高いスループットを実現します。

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私たちは、コートドールのリーグとジョルジュ・フランソワ・ルクレールセンターの財政的支援に感謝します。原稿の編集にご協力いただいたPhilip Bastable氏に感謝いたします。

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<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
<li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240(2011).</li>
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<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
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</ol>

著者には宣言すべき利益相反はありません。

NGS機器や技術の普及は、がんや遺伝性疾患の研究に新たな機会を提供してきました。全ゲノムシーケンシングまたはRNA配列決定に加えて、多数の患者では、選択したgDNAシーケンスを多量の分析は、同時に診断に大きな展望を提供しています。ここでは、ミディアムスループットシークエンシングデバイス（材料/機器の表）と同時に24人の患者の11の完全な遺伝子を研究するためにネクストエラ·テクノロジーを使用して（オンデマンドで利用可能な）特定の設計を開発しました。このプロトコルは、エラーのリスクが低い患者の懸念に迅速な対応を可能にするデータの迅速な生成を可能にする。 図6に示すように、サンガー配列決定で検出されたすべての遺伝的変異はまた、トランスポザーゼベースの調製キットを用いて検出した。この方法は、特に直接分析されている複雑なインデルの変化のために、信頼性が高く、解釈が容易である。それにもかかわらず、それは重要であるマイナス鎖に位置する遺伝子のためにそれを注意することは、それが（反転なしで）ヌクレオチドを​​補完することが必要である。本研究は、11の完全な遺伝子の分析のためのデザインを用いて行ったが、プロトコルがデザ...

2010年にはほぼ150万人（基本的に女性は）世界的に乳癌を開発しました。なお、これらの症例の5〜10％が遺伝性であったと推定される。ほぼ20年前、BRCA1およびBRCA2は 、遺伝性乳癌および卵巣癌1に関わると同定された。約15年前から、BRCA1およびBRCA2コード領域は、乳癌および卵巣癌の遺伝的素因を決定するために配列決定されている。 BRCA1およびBRCA2の変化は、これらの領域の分析は、効果的なスクリーニングのために十分ではないことを示唆して選択された家族2 10〜20％で検出される。最近では、BRCA1およびBRCA2の非コード配列（プロモーター、イントロン、3 - &#39;UTR）の分析は、新たな変異/バリエーションが乳癌3-6のリスクが高いにリンクすることができることを強調した。 BRCA1およびBRCA2タンパク質は、相同組換え修復に関与している（多数のパートナー企業7によって完成さHHR）。 BRCA1またはBRCA2の変化は、DNA修復における欠陥を誘発するが、他のパートナーはまた、乳癌のリスクに影響を及ぼし得る。この仮説はBRIP1 8以来確認されているように見えるとPALB2 9は、それぞれ、子宮頸および乳癌に対する実績のある影響を与えます。さらに、2つの他の「中程度リスク」乳癌感受性遺伝子、ATMおよびCHEK2は 、また、日常的に10研究することができる。 これらの研究に続いて、私たちは非常に簡単で、比較的を用いて同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAP80、およびTP53）を分析するためのプロトコルを開発することを決定中スループットデバイス上の濃縮およびシーケンシングとトランスポザーゼ技術に基づく高速プロトコル。感謝この技術は、2,500塩基対のイントロン領域をカバーされなかったRAP80、（：176,381,588-176,390,180 Chr5）を除いて、3&#39;-UTRの端に対するプロモーターの開始から完全な遺伝子を配列決定した。これは2,734プローブを用いて研究し、約1000300塩基対の合計を表します。通常、BRCA1およびBRCA2エキソン配列は、20未満の患者について1.5カ月を必要とするサンガー配列決定によって分析される。現在のプロトコル（ 図1）を使用すると、同じ時間で、75以上の患者のための11の完全な遺伝子を解析することができた。

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>シーケンシング/中スループットデバイス</td></tr><tr><td>Nextera エンリッチメントキット</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>トランスポザーゼベースの技術</td></tr><tr><td>300サイクルカートリッジ</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPureビーズ</td><td>ベックマンコール</td><td>ターA63881</td><td>磁気精製ビーズ</td></tr><tr><td>磁気スタンド</td><td>アルパクア</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96ウェルプレート</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>PCR増幅にのみ必要なシールです。他の標準的なシールは実験を通して使用することができます</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>シーケンシング装置に付属しています Experiment Managerソフトウェア インターネットアドレス:http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new メーカーウェブサイトツール</td></tr></tbody></table>

の全配列のngs解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgdnaのエンリッチメント brca1 brca2、およびdna損傷修復に関与する遺伝子9

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

次世代シーケンシングの普及は、癌研究および診断のための新たな道を切り拓いてきた。 NGSは巨大な癌に対する新たなデータの量、特にがんの遺伝学をもたらすでしょう。現在の知識と未来の発見は、それが必要な癌の遺​​伝的素因に関与することができる遺伝子の膨大な数を研究するようになります。この点では、DNA損傷の修復に関与する11の完全な遺伝子を研究するためにエラ·デザインを開発した。このプロトコルは、安全に、同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80、およびTP53）プロモーターからの3&#39;-UTRに研究するために開発されました。トランスポザーゼ技術とgDNAの濃縮に基づくこ​​のプロトコルは、多重化をサンプリングする遺伝子診断のおかげで時間の面で大きな利点を提供します。このプロトコルは、安全に、血液のgDNAと共に使用することができる。

サンプルQC結果標的遺伝子の配列を決定するためのこの方法の能力は、gDNAの品質（ 図2A）とtagmentation工程の品質に基づいている。 tagmentationが（ 図2B、上部パネル）が十分でない場合には、シークエンシングは満足できなくなります。上述したように、tagmentation精製後に、gDNAを、300塩基対の周りの断片の大部分（ 図2B、下のパネル）で1000 bpの150 bpのからのフラグメントにtagmentedする必要があります。 ライブラリー調製の最後に、ライブラリ品質がバイオアナライザーを用いてチェックされる。得られたプロファイルはtagmentation後でフラグメントの高い数字（ 図2C）とほぼ同じであるべきである。図書館品質は図1Cと同一でない場合、配列決定を実行するべきではありません。 <p class="jove...

NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

次の実験の目的は、トランスポゼースベースの技術に基づく非常に簡単で比較的高速なプロトコルで、11個の遺伝子の配列を同時に分析することです。これは、トランスポゼーゼの作用により、アダプターで直接ライゲーションされた300塩基対のDNA断片を得ることによって達成されます。特定のプローブを使用した最初のキャプチャでは、関心領域のサンプルが濃縮されます。この手順をもう一度繰り返して、ターゲット配列のみを取得します。次に、シーケンシングするための材料を増やすためにPCR増幅を行い、シーケンシングの結果は、シーケンシングとバイオインフォマティクス解析に基づいて遺伝子の遺伝的変異を示す結果が得られます。この手法がサンガーシーケンシングのような既存の方法よりも優れている点は、11の完全な遺伝子に対する24の情熱を2週間未満で解析できるという優れた能力です。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるサンディです。まず、DNA濃縮キットのすべての試薬を調製します。準備ができたら、25マイクロリットルのTDバッファーを、次に5マイクロリットルのTDE1バッファーを添加することにより、96ウェルプレートの開始メンテーションの各ウェルに約50ナノグラムのゲノムDNAを添加します。各ウェルにピペットを50マイクロリットルにセットし、全容量を10回上下に静かにピペットします。短時間遠心分離し、準備ができたらプレートをサーモサイクラーに入れます。ST溶液をボルテックスし、サンプルを含む各ウェルに15マイクロリットルを加えます。ピペットを65マイクロリットルに設定し、全容量を静かに上下に10回ピペットで動かし、室温で5分間インキュベートしてから遠心分離します。次に、あらかじめ混合した精製磁気ビーズ52マイクロリットルを各ウェルミックスに加え、室温で10分間インキュベートしてから遠心分離します。ビーズをエタノールで洗浄した後、プレートを磁気スタンドから取り外し、22.5マイクロリットルのRSBバッファーを追加します。混合後、プレートを磁気スタンドに置き、2分間インキュベートします。上清が完全に透明に見えることを確認します。20マイクロリットルのスナットを新しい96ウェルプレートに静かに移します。PCR増幅の最初のラウンドを開始するには、20マイクロリットルのLP PMMと、インデックス1とインデックス2のそれぞれに5マイクロリットルを追加します。プレートをよく混ぜて、接着剤のMicros EALフィルムで覆います。遠心分離後、プレートをサーモサイクラーに入れ、プログラム1を実行します。PCRの最初のラウンドから収量を精製して決定した後、最大12個のサンプルをプルアップして最初のハイブリダイゼーションを開始します。新しい96ウェルプレートでは、各プールの最終容量が40マイクロリットルを超えないように、NCTの1つの溶液を完全に混合し、各ウェルに50マイクロリットルを追加します。10マイクロリットルのCSOを追加した後、プレートを混合して密封します。遠心分離後、プレートをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。2。最初のハイブリダイゼーション洗浄では、プレートをサーモサイクラーから取り外し、遠心分離機にかけます。接着剤カバーを非常に慎重に簡単に取り外します。100マイクロリットルの反応ミックスをプレートから新しいMIDI 96ウェルプレートに移し、250マイクロリットルのウェルVortex SMB溶液を追加します。プレートを混合して密封してから、室温で30分間インキュベートします。スープナを洗浄して廃棄した後、ビーズを含むウェルに200マイクロリットルのよく混合されたWS 2溶液を加え、全ボリュームを新しい96ウェルプレートに完全にトランストランスファーして混合します。プレートを密封し、サーモサイクラーに入れます。サーモサイクラーを摂氏42度で30分間起動します。完了したら、すぐにプレートをマグネティックスタンドに2分間置きます。上清が完全に透明に見えることを確認します。シールをはがし、すぐにすべての上清を捨てます。プレートをマグネットスタンドから取り外します。よく混合したWs 3溶液200マイクロリットルをビーズを含むウェルに加え、十分に混合します。仰臥位を洗浄して取り除いた後、プレートを密封し、短時間遠心分離機で残りのsupinenatantを引き下げます。プレートを磁気スタンドに2分間置きます。残りの ?? 酸を廃棄します。.次に、マグネットスタンドからプレートを取り外します。23マイクロリットルの事前に調製した混合物を追加します。混合後、プレートを密封し、室温で5分間放置してから遠心分離します。21マイクロリットルのセートを新しい96ウェルプレートに移した後、それぞれに4マイクロリットルのET2溶液を加えます。遠心分離の前にプレートをよく混合して密封します。第2のハイブリダイゼーションを開始するには、接着フィルムをはがし、50マイクロリットルのNCT one 10マイクロリットルのCSOおよび15マイクロリットルのPCRグレード水を25マイクロリットルのライブラリーに加える。遠心分離後、プレートをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。2。新しい96ウェルプレートでは、前のステップから20マイクロリットルの進化を混合しました。25マイクロリットルのT-C-P-M-Mと5マイクロリットルのPPCを使用して、混合および遠心分離後にプレートをシールします。次に、プレートをサーモサイクラーに入れ、翌日にプログラム3を実行し、プレートを遠心分離し、ビーズをエタノールで洗浄します。マグネティックスタンドからプレートを取り外し、30マイクロリットルのRSBバッファーを追加します。プレートを混合し、2分間インキュベートします。室温で、96ウェルプレートをマグネティックスタンドに置き、5分間またはS上清が完全に透明になるまでインキュベートします。28マイクロリットルのスナットを新しい96ウェルプレートに静かに移します。最後のステップは、フラグメントアナライザーまたはQPCRを使用してライブラリの品質を判断することです。実行中、クラスター密度はミリメートル四方あたり801, 000 Kの間である必要があります。さまざまな画像が、低密度、高密度、および完全密度に対応しています。この技術で得られた結果は、バイオインフォマティクスを使用して、点変異またはインデル変異として非常に簡単に解釈できます。ベースの変更が示され、削除または挿入されたシーケンスが直接識別されます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3日未満で完了できます。

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