の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

次の実験の目的は、トランスポゼースベースの技術に基づく非常に簡単で比較的高速なプロトコルで、11個の遺伝子の配列を同時に分析することです。これは、トランスポゼーゼの作用により、アダプターで直接ライゲーションされた300塩基対のDNA断片を得ることによって達成されます。特定のプローブを使用した最初のキャプチャでは、関心領域のサンプルが濃縮されます。

この手順をもう一度繰り返して、ターゲット配列のみを取得します。次に、シーケンシングするための材料を増やすためにPCR増幅を行い、シーケンシングの結果は、シーケンシングとバイオインフォマティクス解析に基づいて遺伝子の遺伝的変異を示す結果が得られます。この手法がサンガーシーケンシングのような既存の方法よりも優れている点は、11の完全な遺伝子に対する24の情熱を2週間未満で解析できるという優れた能力です。

手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるサンディです。まず、DNA濃縮キットのすべての試薬を調製します。準備ができたら、25マイクロリットルのTDバッファーを、次に5マイクロリットルのTDE1バッファーを添加することにより、96ウェルプレートの開始メンテーションの各ウェルに約50ナノグラムのゲノムDNAを添加します。

各ウェルにピペットを50マイクロリットルにセットし、全容量を10回上下に静かにピペットします。短時間遠心分離し、準備ができたらプレートをサーモサイクラーに入れます。ST溶液をボルテックスし、サンプルを含む各ウェルに15マイクロリットルを加えます。

ピペットを65マイクロリットルに設定し、全容量を静かに上下に10回ピペットで動かし、室温で5分間インキュベートしてから遠心分離します。次に、あらかじめ混合した精製磁気ビーズ52マイクロリットルを各ウェルミックスに加え、室温で10分間インキュベートしてから遠心分離します。ビーズをエタノールで洗浄した後、プレートを磁気スタンドから取り外し、22.5マイクロリットルのRSBバッファーを追加します。

混合後、プレートを磁気スタンドに置き、2分間インキュベートします。上清が完全に透明に見えることを確認します。20マイクロリットルのスナットを新しい96ウェルプレートに静かに移します。

PCR増幅の最初のラウンドを開始するには、20マイクロリットルのLP PMMと、インデックス1とインデックス2のそれぞれに5マイクロリットルを追加します。プレートをよく混ぜて、接着剤のMicros EALフィルムで覆います。遠心分離後、プレートをサーモサイクラーに入れ、プログラム1を実行します。

PCRの最初のラウンドから収量を精製して決定した後、最大12個のサンプルをプルアップして最初のハイブリダイゼーションを開始します。新しい96ウェルプレートでは、各プールの最終容量が40マイクロリットルを超えないように、NCTの1つの溶液を完全に混合し、各ウェルに50マイクロリットルを追加します。10マイクロリットルのCSOを追加した後、プレートを混合して密封します。

遠心分離後、プレートをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。2。最初のハイブリダイゼーション洗浄では、プレートをサーモサイクラーから取り外し、遠心分離機にかけます。接着剤カバーを非常に慎重に簡単に取り外します。

100マイクロリットルの反応ミックスをプレートから新しいMIDI 96ウェルプレートに移し、250マイクロリットルのウェルVortex SMB溶液を追加します。プレートを混合して密封してから、室温で30分間インキュベートします。スープナを洗浄して廃棄した後、ビーズを含むウェルに200マイクロリットルのよく混合されたWS 2溶液を加え、全ボリュームを新しい96ウェルプレートに完全にトランストランスファーして混合します。

プレートを密封し、サーモサイクラーに入れます。サーモサイクラーを摂氏42度で30分間起動します。完了したら、すぐにプレートをマグネティックスタンドに2分間置きます。

上清が完全に透明に見えることを確認します。シールをはがし、すぐにすべての上清を捨てます。プレートをマグネットスタンドから取り外します。

よく混合したWs 3溶液200マイクロリットルをビーズを含むウェルに加え、十分に混合します。仰臥位を洗浄して取り除いた後、プレートを密封し、短時間遠心分離機で残りのsupinenatantを引き下げます。プレートを磁気スタンドに2分間置きます。

残りの ?? 酸を廃棄します。.次に、マグネットスタンドからプレートを取り外します。23マイクロリットルの事前に調製した混合物を追加します。

混合後、プレートを密封し、室温で5分間放置してから遠心分離します。21マイクロリットルのセートを新しい96ウェルプレートに移した後、それぞれに4マイクロリットルのET2溶液を加えます。遠心分離の前にプレートをよく混合して密封します。

第2のハイブリダイゼーションを開始するには、接着フィルムをはがし、50マイクロリットルのNCT one 10マイクロリットルのCSOおよび15マイクロリットルのPCRグレード水を25マイクロリットルのライブラリーに加える。遠心分離後、プレートをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。2。新しい96ウェルプレートでは、前のステップから20マイクロリットルの進化を混合しました。

25マイクロリットルのT-C-P-M-Mと5マイクロリットルのPPCを使用して、混合および遠心分離後にプレートをシールします。次に、プレートをサーモサイクラーに入れ、翌日にプログラム3を実行し、プレートを遠心分離し、ビーズをエタノールで洗浄します。マグネティックスタンドからプレートを取り外し、30マイクロリットルのRSBバッファーを追加します。

プレートを混合し、2分間インキュベートします。室温で、96ウェルプレートをマグネティックスタンドに置き、5分間またはS上清が完全に透明になるまでインキュベートします。28マイクロリットルのスナットを新しい96ウェルプレートに静かに移します。

最後のステップは、フラグメントアナライザーまたはQPCRを使用してライブラリの品質を判断することです。実行中、クラスター密度はミリメートル四方あたり801, 000 Kの間である必要があります。さまざまな画像が、低密度、高密度、および完全密度に対応しています。

この技術で得られた結果は、バイオインフォマティクスを使用して、点変異またはインデル変異として非常に簡単に解釈できます。ベースの変更が示され、削除または挿入されたシーケンスが直接識別されます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3日未満で完了できます。