組織学的および機能的特性：メチルニトロソ尿素（MNU）は、網膜変性·再生ゼブラフィッシュでの誘発

この手順の全体的な目標は、nメチルとニトロueaaを使用して、成体のゼブラフィッシュに網膜変性とそれに続く再生を誘発することです。これは、まず野生型ゼブラフィッシュをNメチルN亜硝酸尿素(MNU)を含む水でインキュベートすることによって達成されます。次の視覚機能は、視運動反応または OKR を測定し、さまざまな時点での視力を計算することによって定量化されます。

治療後、ゼブラフィッシュを安楽死させ、眼を核形成して組織学的検査を行い、h染色とe染色を行い、網膜組織の形態学的変化を観察します。最後に、細胞の変化は、細胞死と細胞増殖のための特異的な染色によって網膜で視覚化されます。最終的には、視力の測定と形態学的および細胞的変化の定量化を使用して、網膜Dと再生を視覚化します。

この薬理学的モデルの主な利点は、それがシンプルで高速に使用でき、成体のゼブラフィッシュで信頼性の高い局所変性と再生を誘発することです NMメチルnニトロソ尿素またはMNU治療を実施するには、乾燥MNUのリットルあたり150ミリグラムを含む水を準備することから始めます。nmメチル尿素と亜硝酸尿素は有毒であり、がん、遺伝性の遺伝的損傷または害を引き起こす可能性があるため、取り扱いには注意して進めてください。胎児は、AB型を濾過しながら、標準的な条件下で生後6ヶ月から12ヶ月のゼブラフィッシュを維持します。

ゼブラフィッシュをMNUの水に移し、室温で60分間インキュベートします。次に、真水を使用して魚をすばやくすすぎ、次にMNUを使用せずに新しい水槽に移します。実験に必要な限り、魚を標準条件下で維持します。

モーターシステムを起動して視力測定を行う準備をします。次に、メニューから[テスト]を選択し、オプションを[単純な階段]に設定します。モーターシステムの約1メートル上に500ミリリットルの水で満たされた輸液ボトルを取り付けます。

ゼブラフィッシュ1匹を診察室に入れ、輸液ボトルに接続します。次に、検査チャンバーを自動車システムに配置します。次に、測定を開始し、パソコンの画面上でリアルタイムで眼球運動を観察します。

正の応答または「はい」は、正しい方向への連続した秒数として定義され、否定的な応答または「いいえ」は、静止した格子で観察されるものと同様のランダムな眼球運動を表します。ゼブラフィッシュの目が3回以上続いて視運動反応またはOKRを示す場合は、はいを押します。そうでない場合は、[いいえ]を押します。

メニューの結果の下で、視運動刺激の空間周波数の閾値を決定することによりソフトウェアによって計算された視力を抽出し、組織学的分析を実施します。テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュを安楽死させ、核形成を行った後、目はPBS中のホルムアルデヒドの4%パワーを使用して無傷の目を摂氏4度に固定し、その後、等級付けされたアルコールシリーズを使用してサンプルを脱水し、サンプルをパラフィンに埋め込み、視神経頭またはONHを介して5マイクロメートルの切片を切断し、スライドガラスに取り付けます。次に、Alamを使用して脱炭素切片を5分間染色した後、スライドを蒸留水に2回浸し、続いて0.2%塩酸と0.8%アンモニア

スライドを水道水に少なくとも10分間移します。スライドをエタノールシリーズで洗浄および脱水した後、切片を3分間エオシンに移します。封入剤を使用してそれらを埋め込み、光学顕微鏡を使用して、末端、酸素ヌクレオチドトランスフェラーゼ、DUPT Nick n標識、またはトンネルのサンプルを観察します。

ミリリットルあたり20マイクログラムのプロナーゼKをde parize切片に添加し、室温で20分間インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水を使用して切片を3回、それぞれ5分間洗浄した後、切片に50マイクロリットルのトンネル反応混合物を加え、摂氏37度の加湿チャンバーで60分間インキュベートします。サンプルを洗浄し、5分間ずつ3回トリスした後、dappyを含む封入剤を使用して、その前のスライドを蛍光顕微鏡でマウントし、増殖細胞核抗原またはPCNA染色を行います。

サンプルを抗原賦活化、緩衝液、3分間煮沸した後、ブロッキングバッファーを使用してTB S3で1時間5分間洗浄し、サンプルを室温で1時間インキュベートします。次に、抗PC NAを1〜200希釈します。一次抗体は、TBS plus tweenでサンプルを5分間ずつ23回洗浄した後、加湿チャンバー内で摂氏4度で一晩インキュベートします。二次抗体を1〜500希釈して、サンプルを室温で1時間インキュベートします。

dpiを含む封入剤をスライドに封入した後、蛍光顕微鏡で観察します。この図は、MNU1リットルあたり150マイクログラムを適用した後の成魚のゼブラフィッシュの視力経過を示しています。1日目から、測定値は、視力の顕著な低下が3日目に最小値に達し、値の増加が明らかになりました。

ゼブラフィッシュの眼の網膜変性の組織学的分析を通じて見られるように、30日目に完全に回復しました。MNU治療後に30日間追跡されたのは、3日目から始まるONLの空洞形成によるINLの破壊が含まれ、8日目には感覚網膜のさまざまな層での陽性のトンネル染色を通じてロッドONLの最大損失が観察されました。MNU治療後の網膜変性は、3日目にONLにトンネル陽性細胞の大部分が見つかったアポトーシスによって引き起こされたことが観察されました。しかし、死にかけている細胞は、同じ時点でINLでも見られました。

このビデオを見れば、成魚のゼブラフィッシュ成魚にmとuの治療によって網膜変性を誘導する方法や、OKR測定と免疫組織化学的手順を用いて機能的および形態学的変化を定量化する方法について、十分に理解できるはずです。