膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

次の実験の全体的な目標は、表面プラズマと共鳴を使用してタンパク質受容体の相互作用を実証することです。これは、ニトロ三酢酸またはNTAマトリックス上にニッケルイオンを注入することによって達成されます。次に、リガンドと呼ばれるタンパク質の1つが、ブランク注入後にセンサーチップに固定化されます。

分析物と呼ばれる2番目のタンパク質は、固定化されたリガンドに注入されます。2つのタンパク質間の相互作用を検出するために、結果は、2つのタンパク質が一過性に相互作用し、分析物が会合し、リガンドから解離することを示しています。相互作用の親和性は、測定された2つのタンパク質の解離速度と解離速度に基づいて計算できます。

プルダウン法や免疫沈降法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、生物学的に大きな影響を与えることが多い一過性または低親和性の相互作用を特定できることです。この方法は、目的のタンパク質が別のタンパク質または別の小分子に結合するかどうかなど、生化学における重要な質問に答えるのに役立ちます。相互作用の性質を決定し、親和性を測定できます。サンプルを調製するには、テキストプロトコルに記載されているように、精製したタンパク質からすべての凝集体を取り出します。

ランニングバッファーを調製し、ゼロポイント22ミクロンフィルターを使用してすべてのバッファーとタンパク質サンプルをろ過します。ランニングバッファーボトルをポンプインレットに接続する前に、フィルターがタンパク質に適合していることを事前に確認してください。ランニングバッファーの10ミリリットルを別のチューブに取っておきます。

次に、サンプルをランニングバッファーに対して希釈して、バッファーの不一致を回避します。経験則として、安定したリガンドの動員解除のためには、高リガンド濃度とは対照的に、低流量での長時間の注入で低リガンド濃度を使用します 高流量での短い注入では、濃縮されたリガンドストックをランニングバッファーに希釈し、ミリリットルあたり約20マイクログラムの最終濃度にします。最後に、分析種をランニングバッファーに希釈して、目的の濃度にします。

親和性が不明なシステムの場合、10 マイクロモルから 10 ナノモルまでの分析種濃度の範囲を 10 倍希釈で試験します。このデモンストレーションでは、オリヒスチジンタグを持つタンパク質の捕捉に適したNTA結合チップを再利用します。バッファーから保存したチップを取り出した後、二重蒸留水で十分にすすぎ、穏やかに乾燥させて、元のシースに入れます。

チップをSPR機器にドッキングするには、センサーチップのドアを開き、チップをシースに入れます。ドアを閉め、ドックチップを押します。チップセルの温度を摂氏25度に設定します。

サンプルコンパートメントを摂氏7度に設定して、実験全体を通してタンパク質を安定に保ちます。テキストプロトコルで説明されているように、ローディングとストリッピング用の溶液を調製した後、SPR装置にランニングバッファーをプライミングします。次のステップでは、流量を毎分50マイクロリットルに設定します。

流路と参照減算を定義して、ここで説明する結果を取得します。フローセル番号1、フローセル番号2、フローセル番号1のパスを設定し、フローセル番号2から減算し、適切なサンプルラックを選択した後、実験を開始する前に結果ファイルを保存して、実行中にデータが保存されるようにします。各実験はサイクルで構成されています。

各サイクルで行われた注入を明確に記録し、バッファーのブランク注入と分析種の注入をロードするリガンドを異なるサイクルに分けます。サイクル1は、切りくずの準備とニッケルの充填です。フローとパスが設定されていることを確認してから、350ミリモルのEDTAを1分間注入して、残りの分子を洗い流します。

次に、流量を毎分10マイクロリットルに設定します。次に、0.5ミリモルの塩化ニッケルを2分間注入します。現在、チップ樹脂はニッケルイオンでコーティングされています。

サイクル2はリガンドの固定化です。流量を毎分15マイクロリットルに設定し、流路をフローセルに設定します。その2、リガンドAを応答単位またはリガンド分子量の10〜20倍のRRU値に達するまで注入します。

たとえば、50キロダルトンのリガンドを501, 000ルスの間にロードします。達成された RU 値を記録します。次に、フローを毎分15マイクロリットルに設定し、フローセル番号1への流路を設定し、リガンドAと同じRU値まで制御リガンドBを注入し、減算を監視し、グラハムをオンラインで注入して注入長を制御します。

次に、流量を毎分50マイクロリットルに設定し、フローパスをフローセル番号1とフローセルに設定します。その2、ベースラインが安定するまで、システムを5〜20分間洗浄します。サイクル 3 はブランク注入です。

この注入はブランク減算に役立ちます。したがって、分析物自体を除く、分析物に注入されるすべての成分を含めます。注入時間は、平衡に達するまでの時間によって異なります。

流量を 15 マイクロリットル/分に設定し、フロー セルからフロー セル番号 1、フロー セル番号 2、およびフロー セル番号 1 を減算した流路を設定します。その2、weightコマンドを30秒間挿入して、安定したベースラインを実現します。次に、実行中のバッファーを 13 秒間挿入します。

120〜600秒待って、解離フェーズを記録します。このステップの長さは、kd によって異なります。解離が遅いほど、この手順は長くなります。

サイクル4は分析物の注入です。サイクル 3 で使用した正確な条件をコピー&ペーストして、この 2 回の注入を後で減算できるようにします。ラック内のスロットの位置を、制御溶液を保持しているスロットから分析種溶液を保持しているスロットに変更します。

予想される平衡解離定数をわずかに上回る濃度を選択します。予備知識がない場合は、1マイクロモルを出発点として選択してください。バッファー注入と分析物注入を2回目に行った後、サイクル7チップトリップオフを実行します。

流量を毎分50マイクロリットルに設定し、350ミリモルのEDTAを1分間注入します。この手順をさらに 2 回繰り返します。3分間の1回の注入はチップを損傷する可能性があるため、使用しないでください。

次に、0.25%dcal硫酸ナトリウムを1分間注入します。この手順を 2 回繰り返します。これはニッケルの負荷に続いてチップを損傷する可能性があるため、3分間の単一の注入を使用しないでください、対象のトランスポーターは、最大3、500 R rusのフローセル番号2に固定されます。

次に、同じフローと注入時間を使用して、コントロールリガンドをフローセル番号1に注入し、最初は最大3000 Rまでのみ到達して、同様のタンパク質量が両方のフローセルに固定化されるようにします。制御リガンドは、最大 3, 500 RDU の負荷を監視しながら、より短い注入でさらに負荷をかけます。階段の形状は、ここに示されている各注入がフローセル1からフローセル1を差し引いたフローセル1の質量の緩やかな増加を表しています。

その2、リガンド注入の持続時間を変えることで、負荷を均等にすることが大切です。対照的に、分析種の注入時間は、定量データを取得するために使用されるすべての濃度で一定に保つ必要があります。さまざまな濃度の分析物が注入されます。

ここに示されているのは、注入長が一定であるさまざまな分析種濃度の注入です。異なる濃度の分析物をランダムな順序で注入し、分析前にダブルブランクセンサリグラムをx軸に揃えて、親和性と速度定数を導き出します。モデルフィットが適用されます。

mod BCA相互作用について計算された平衡解離定数は、適度に速いKAと速いKDで約3倍10〜マイナス6モルであると習得します。この手法は、このビデオを見てから数時間以内に実行できます。目的のタンパク質を使用したSPR実験の設計方法と実施方法について十分に理解している必要があります。