Name: ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ。リンパ腫細胞を用いた高スループットイメージングにより、抗CD20抗体の効力を定量的に評価する方法です。動物実験前の治療抗体の前臨床評価に有用です。

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我々は、この作品[R33 CA174616-01A1]を資金調達NIHから国立癌研究所のIMATプログラムに感謝します。

1.ターゲット細胞の調製<ol><li> 37°Cの時に（10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、4nmのL-グルタミン、500 IU / mlペニシリン/ストレプトマイシンを、RPMI 1640培地）増殖培地中の標的細胞（ 例えば 、Raji細胞リンパ腫細胞）を維持5％CO 2インキュベーター中。 </li><li>遠心分離機15ミリリットルチューブに標的細胞をペレット化するためのサンプル。遠心分離時間は、異なる細胞型によって変化する。 Raji細胞のための468×gで3分間遠心する。 </li><li>最初の上清の表面に形成された気泡を吸引し、全上清を除去。 </li><li>チューブに10mlのPBSを追加します。再懸濁細胞塊を分割するには、上下に数回ソリューションをピペッティングすることにより細胞を。 </li><li>遠心分離機468×gで3分間のサンプル。 </li><li>上清の表面に形成された気泡を吸引し、全上清を除去。 </li></ol>細胞マイクロアレイの作製<ol><li> Obtain細胞付着の96ウェルプレートキットまたは単一セルアレイ8ウェルチャンバースライド（材料/試薬の表を参照）。 </li><li>キットからのDNA試薬にアクティベーターの1.2μlのを適用します。バイアルにキャップを、それを反転し、優しく溶液を混合する振る。 </li><li>ソリューションは、RTで20分間反応させる。 </li><li> （15mlチューブ中で）標的細胞ペレットを混合した溶液を塗布する。 </li><li> 500 nMの最終濃度緑色蛍光細胞質ゾル染料を追加します。 </li><li>オービタルシェーカー上でRTで30分間混合した溶液および色素で標的細胞をインキュベートする。 </li><li> 5mLのPBSで細胞を2回洗浄し、10mlの増殖培地中で細胞を再懸濁する。 </li><li>各ウェルにステップ2.7から溶液100μlを適用します。血球計算盤を用いて細胞数を数える。細胞数はウェル当たり1×10 6の細胞に5×10 4の範囲であることを確認してください。 </li><li> RTでインキュベーションの10〜15分後、静かに200から30で二回のサンプルを洗う未結合の細胞を除去する0μlの増殖培地。 注：約5-10μlの増殖培地は、洗浄後に各ウェルに残っています。 </li></ol> 3.全血細胞毒性アッセイ<ol><li>各サンプルウェルにヒト全血180μlのを追加します。 </li><li>ミリリットル/ 5mgのに抗CD20抗体溶液を得、そして作るために連続希釈を行い50、20、10、5、2,1、1.5 mlチューブ中の抗CD20抗体溶液を0.5μg/ mlであった。よく三重を作る各サンプルに抗CD20抗体の各濃度の20μlのを追加します。 </li><li>各ウェルに500 nMでの最終濃度でヨウ化プロピジウムを追加する。 </li><li> 16時間、5％CO 2、37℃で、得られたプレートをインキュベート。 </li><li>画像スライドまたは8X倍率に自動撮像システム96ウェルプレート上の細胞。 </li><li>結果を定量化するために自動撮像システムの細胞計数プログラムを使用します。 NOTE：自動撮像システムのソフトウェアは、単純な提供細胞計数のためのステップバイステップの操作。このソフトウェアを使用するプロトコルは、プロバイダのウェブサイトで見つけることができます。 </li><li>ソフトウェアのメインページから[レビュー結果]を選択します。 </li><li> [サンプルのために保存したファイル]を選択します。 </li><li>最初のゲートは、FITCその後ゲートが強度&gt; 20を意味TxRed、&gt; 50強さを意味します。 </li><li> [プレートの概要]を選択します。 </li><li> [エクスポートテーブル]を選択します。 注：プログラムのパーセンテージ細胞殺傷式を以下に示す： ％の標的細胞の死滅=（緑と赤の両方の染色された細胞の数/細胞の＃は緑色に染色）* 100％ </li></ol>

<ol><li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li>
<li>Moreno, L., Pearson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attrition+rates+be+reduced+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Informa+healthcare%22%5BJournal%5D)">Attrition rates be reduced in cancer drug discovery.</a> Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).</li>
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<li>Eastwood, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+TGN1412+trial+failure+explained+by+species+differences+in+CD28+expression+on+CD4%2B+effector+memory+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells.</a> Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).</li>
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<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+high-content+screening+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for high-content screening and analysis.</a> J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).</li>
<li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening%3A+solution-+and+cell-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+is+more+than+genomic+medicine%3A+confusion+over+terminology+impedes+progress+towards+personalized+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22PERS+MED%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare.</a> PERS MED. 9, 85(2012).</li>
</ol>

著者は、競合する経済的利益を持っていません。

WCAは、理想的にはそのようなCDCおよびADCCアッセイ9-11、などと前臨床動物試験の前に、伝統的なターゲットの上映の後に利用され、単一細胞の解像度12-16、を用いたin vitro抗がんスクリーニングツールにおいて重要である。現在、CDCまたはADCCアッセイの一次標的スクリーニングアッセイは、すべての単純化されたメディアまたは緩衝液系中で実施される。しかしながら、これらの簡略化緩衝系において有効性を示す薬剤候補は、常に、より複雑な全血系には有効でない。したがって、WCAは、従来のターゲットスクリーニングおよび高価な動物実験の間のギャップを埋める偽陽性を減らすため、動物実験やヒト臨床試験における予防可能な障害を防ぐことができる。 WCAは、ヒト全血の内容に薬効を試験するために、前臨床試験に取り組む研究者にとって有益であろう。フローサイトメトリーを使用して死んだと生細胞をカウントすると、赤血球CEの完全な溶解を必要とする標的細胞を検出するために、LLS。フローサイトメトリー上WCA技術の利点は、赤血球の溶解なしに標的細胞を同定するこ...

製薬業界における最近の進歩は、腫瘍細胞抗体パーソナライズ癌治療の特定の識別を実現する上で関心が高まってきた。しかし、いくつかの障害は、プロセスで遭遇している。前臨床開発中の抗がん活性を有する薬剤のわずか5％がフェーズII-III試験の1,2で十分な有効性を示した後にライセンスされています。多くの例では抗腫瘍薬3-5主としてそれらの異なる血液成分にヒトおよび実験動物では異なる挙動を示すことが示されているように（in vitroおよびin vivoの両方で ）前臨床戦略は最適以下である。 抗腫瘍薬物スクリーニングプラットフォームの必要性に対処するために費用のかかる動物実験および臨床試験前のチェックポイントを提供するために、ヒト全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、より関連性の生物学的環境において抗腫瘍薬の有効性を評価するために提案されている。ザ·全血の細胞毒性アッセイは、抗体およびヒト全血の他の薬物候補への個々の細胞の応答を評価するために用いることができる。 WCAは、ハイスループットおよびハイコンテントイメージング6でハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって現像される。自動化されたイメージングシステムを利用することにより、生きている細胞および死細胞の両方の数を高精度に判定することができる。による標的細胞は、同一の焦点面上に固定されているという事実のため、WCAは、赤血球を除去することなく、リアルタイムでの定量的細胞毒性分析を提供することができる。また、自動イメージングシステムは、その指定した基準に達した場合にのみ、標的細胞（ 例えば 、蛍光標識された細胞、および細胞形態）などのいくつかの利点ゲートされ、処理さを提供する。また、一日あたり144のプレートを製造することができる。したがって、この撮像能力とスループットが高いcの実行を可能にするontentハイスループット実験を同時に。 WCAおよび自動画像化システムを組み合わせることにより、高スループット定量的細胞毒性分析は、複数の生物学的関連性環境内で達成することができる。

<table><tbody><tr><td>Cell Attachment 96ウェルプレートキット&nbsp;</td><td>Adheren</td><td>AP9601</td><td></td></tr><tr><td>サスペンション シングルセルアレイ 8ウェルチャンバースライド</td><td>Adheren</td><td>SS0801</td><td></td></tr><tr><td>Adherent シングルセルアレイ 8ウェルチャンバースライド</td><td>Adheren</td><td>SS0802</td><td></td></tr><tr><td>リンパ腫細胞株 CD20+</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Raji細胞</td></tr><tr><td>リンパ腫細胞株 CD20-ATCC</td><td></td> <td>CRL-8083</td><td>MC/CAR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 L-グルタミン</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモ</td><td>SH30070.01HI</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Cytosolic dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Cell Tracker Green</td></tr><tr><td>Rituxan (Biosimilar)&nbsp;</td><td>ユーレカセラピューティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト全血</td><td>Allcells</td><td>WB001</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>自動イメージングシステム</td><td>分子デバイス</td><td>ベンダーに連絡する</td><td>セルレポーター</td></tr><tr><td>細胞計数プログラム</td><td>分子デバイス</td><td>ベンダーに連絡する</td><td>セルレポーター</td></tr></tbody></table>

ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

全体的な細胞毒性の時間情報へのアクセスを可能にする生細胞ベースの全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、ハイスループット細胞測位技術で開発されている。標的腫瘍細胞集団は、最初の配列形式に固定化予めプログラム、および緑色蛍光の細胞質ゾル色素で標識されている。セルアレイを形成した後、抗体医薬品は、ヒト全血との組合せで添加される。ヨウ化プロピジウム（PI）は、細胞死を評価するために添加される。セル配列は、自動画像化システムを用いて分析される。細胞質ゾルの色素が標的腫瘍細胞集団にラベルを付けながら、PIは死んだ腫瘍細胞集団にラベルを付けます。従って、標的癌細胞の殺傷の割合は死んだ標的細胞の数の標的細胞の生存数を計算することによって定量することができる。この方法では、研究者は、時間依存性および用量依存性の細胞毒性の情報にアクセスすることができる。驚くべきことに、有害ラジオません化学物質が使用されている。 WCAは、ここで提示リンパ腫、白血病、および固形腫瘍細胞株を用いて試験された。したがって、WCAは研究者が、関連性の高いex vivoの状態で薬効を評価することができます。

抗CD20抗体およびリンパ腫細胞（Raji細胞およびMC / CAR）は、全血の細胞毒性アッセイ（WCA）7,8を実証するためのモデル系として選択した。 MC / CAR細胞がその膜上のCD20の低コピー数を有していたRaji細胞では、細胞表面上のCD20の高いコピー数を有していた。標的細胞は、最初に緑色蛍光細胞質色素で緑色に染色し、96ウェルプレート上に配列した。万 - 5万標的リンパ腫細胞を、各ウェル中に固定化した。新たに採取したヒト全血180μlを各ウェルに添加した。抗CD20抗体は、その後、濃度勾配を有する96ウェルプレートの各ウェルに添加した。 37℃でのインキュベーションの16時間後、細胞数を、緑色蛍光細胞および赤色蛍光細胞の数を分析することによって、自動撮像素子を介して定量的に評価した。標的リンパ腫細胞がすべて同じ焦点面に配列しているため、各細胞の蛍光もレモずに直接検出されたウェル内の血液細胞をヴィング。 図1に示すように、（生きている、死んだの両方）の標的のRajiリンパ腫細胞の検出を行った。 <strong...

全血細胞毒性アッセイ（WCA）は、蛍光顕微鏡および自動化された画像処理をハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって開発された細胞毒性アッセイである。ここでは、抗CD20抗体で処置したリンパ腫細胞の定量的な細胞傷害性分析を提供するために、ヒト全血中でリアルタイムに分析することができる方法について説明します。

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

この手順の目的は、ヒト全血中の標的がん細胞の細胞毒性を単一細胞分解能で測定することです まず、標的がん細胞の単一細胞アレイが生成されます。ヒトの全血を細胞配列に加え、抗体などの薬剤を塗布します。次に、細胞をプロピジウム、ヨウ化物などの細胞生存率色素とインキュベートし、ハイスループットイメージングを使用して赤く染色された死んだ標的がん細胞の数を測定し、最終的に薬物細胞毒性の有効性を提供します。この技術の主な利点は、LDHやクロムアッセイなどの既存の方法と比較して、イメージング機能を持つヒト全血でがん細胞の死滅を行うことができることです。この方法は、動物実験の前にin vitroで抗体細胞毒性を評価することができます 細胞付着96を得ることから始めます。ウェルプレートキットまたはシングルセルレート8ウェルチャンバースライドここでは、96ウェルプレートを使用します。キットのDNA試薬が入ったチューブに1.2マイクロリットルのアクチベーターを塗布し、バイアルに蓋をして反転させ、静かに振とうして溶液を混合します。溶液を室温で20分間反応させます。その間に、ターゲットセルを準備します。このデモンストレーションでは、Rajiリンパ腫細胞を標的細胞として使用します。それらを補充したRPMI 1640培地、摂氏37度のCO2インキュベーターで維持します。実験のためにターゲットのラヒ細胞を準備するには、そのうちの5〜1000万個を15ミリリットルの円錐管遠心分離機に468倍Gの3分間移します。次に、仰臥位全体を取り外して廃棄します。次に、チューブに10ミリリットルのPBSを追加します。溶液を上下に噴出して細胞塊をバラバラにして細胞を再懸濁し、遠心分離後、再度細胞を468倍Gの3分間遠心分離し、仰臥位剤の表面に形成された気泡を吸引し、キットからの活性化剤とDNA溶液を20分間インキュベートした後、前と同じように仰臥位剤全体を除去して廃棄します。混合溶液を15ミリリットルチューブ内の標的細胞palに適用します。溶液をピペットで動かして、細胞ペレットを分解します。次に、最終濃度500ナノモルの緑色蛍光細胞質染料を添加します。混合溶液と色素を含ませた標的細胞をオービタルシェーカーに置き、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、ワッシャー間で遠心分離して再懸濁します。RPMI 1640の適切な容量のセル。細胞濃度を1ミリリットルあたり6細胞の5倍10倍にするための増殖培地。次に、200マイクロリットルの細胞溶液を各ウェルに適用し、室温で10〜15分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞はスポットに愛され、ウェルプレートを軽く振ってレイズを探します。次に、ピペッティングで上下させて、結合していない細胞をやさしく洗い流し

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クロム放出アッセイ、細胞傷害性T細胞活性を検出するための一般的なアッセイは、いくつかの制限を有する。抗原特異的CD8...

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

このビデオでは、リアルタイムの電気インピーダンス測定を通じて、がん細胞に対するCAR-T細胞の活性を監視する方法を示します。インピーダンスの変化を追跡することで、CAR-T細胞ががん細胞の細胞溶解を誘導する効果を評価し、その細胞毒性能力に関する知見を得ることができます。...

CAR-T細胞の効力を評価するためのリアルタイムIn vitro細胞溶解アッセイ

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター -...

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

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この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural...

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

液体および固形腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞の効力を評価する定量的なインビトロ細胞質アッセイシステムを説明する。このプロトコルは、他の免疫エフェクター細胞、ならびに組み合わせ治療を評価するために拡張することができる。...

固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

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マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

全血ベースのイムノアッセイは、診断および研究目的で抗原特異的免疫を分析するための簡単でリソース効率の高いツールを提供します。この記事では、真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の包括的な分析のための、二重共刺激による最適化された全血ベースのプロトコルを提供します。これには、小児患者および小動物向けの少量バージョンが含まれます。...

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

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このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ。リンパ腫細胞を用いた高スループットイメージングにより、抗CD20抗体の効力を定量的に評価する方法です。動物実験前の治療抗体の前臨床評価に有用です。

ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ

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