Name: ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ修飾mRNAのインビトロ合成法。プラスミド増幅、ポリTテール付加、転写、DNA除去、ホスファターゼ処理の各ステップを解説。HEK293細胞へのトランスフェクションとEGFP発現解析により、遺伝子治療やワクチン開発への応用可能性を示します。

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このプロジェクトは、バーデン·ヴュルテンベルク、ドイツに欧州社会基金によって資金を供給された。

必須のDNAコード配列を含むプラスミドの1増強（CDS） <ol><li>前加温室温への変換キットに含まれているSOC培地中、37℃で、100μg/ mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート。 42℃に水浴を平衡化する。 </li><li>化学的に部品Eの1バイアルを解凍氷上で大腸菌 。 </li><li>化学的に部品Eのバイアルに、CDSを含むプラスミドの1-5液（100 ngのには10pg）を追加大腸菌とは穏やかに混合。ピペッティングにより細胞を混在させないでください。プラスミドを追加した後、静かにチューブをタップして混ぜる。 </li><li>氷上で30分間混合物をインキュベートする。 </li><li>熱ショックE.振盪せずに水浴中で42℃で30秒間大腸菌 。 </li><li> 2分間氷上にバイアルを置きます。 </li><li> Eに予め温めSOC培地250μlを添加するcoliおよび細菌インキュベーター中で37℃で1時間、300rpmで水平に細菌を振る。 </li><li><html> 、予め温めたLB寒天プレート上に形質転換混合物からの100μlの150μLを広げ、プレートを反転させ、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>コロニーが見えるようにした後、100μg/ mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地を含む15ml容の培養チューブに各プレートからの単一コロニーを接種する。文化が遅れてログまたは定常期になるまで、300 rpmで振盪しながら37℃で一晩、それらをインキュベートする。 </li><li>形質転換されたE.の長期保存のためにコリ、ピペットクライオバイアルへの100％のグリセロール75μlの。細菌培養（冷凍ストックは25％グリセロールを含有するであろう）の225μl加え、よく混ぜ、-80℃で凍結バイアルを格納します。 </li><li>製造元の説明書に従って、プラスミド精製キットを使用して必要なCDSを含むプラスミドを単離する。 </li><li>分光光度計を用いてプラスミド濃度を決定する。 </li><li> 20μlの一定分量を準備し、長時間-20℃で保管してください。 </li></ol>_title &quot;&gt; 2。プラスミドインサートの増幅およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ポリTテールを追加する<ol><li> NOTE：in vitro転写 （IVT）用のDNA鋳型を得るために、関心のCDSは、ここでeGFPを、PCRを用いて増幅される。同時に、120チミジン（T）のポリTテールはT 120拡張子を持つリバースプライマーを用いてインサートに加えられる。これにより、生成されたmRNAは、IVTの後に定義された長さを持つポリAテールを得る。 </li><li> 表1に詳述するようにPCR混合物を準備します。 </li><li>徹底的に反応ミックスを混ぜる。注：PCR産物が4-5 IVT反応に使用することができる。 IVTのためのDNAテンプレートの量を増加させるために、PCR混合物の全体積を増加させることができる。いくつかのPCRチューブはそれぞれ含む100μlのPCR混合物をPCR産物の十分な収量を得るために使用することができる。 </li><li>サーモPCRチューブを配置し、PCRサイクリング·プロトコル（ 表2）を用いたPCRを実行します。 </li><li> Pは、クリ​​ーンアップCR反応は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを使用し、20μlのヌクレアーゼフリー水を用いてDNAを溶出する。 </li><li>分光光度計を用いてDNAの濃度を測定する。注記：検出されたDNAの濃度は、約300μgの/ mlである。このように、予想される合計金額は、〜6μgのでなければなりません。他のタンパク質のためのDNAの量は、CDS、PCR、プライマーのアニーリング温度のために使用されるプラスミドの量は、サイクル数の長さに応じて異なり得る。 </li><li>長い間、-20℃でDNAを凍結またはIVTのためにそれを直接使用しています。 </li></ol> 3.コントロールステップ：PCR産物の品質<ol><li> DNAゲル電気泳動によってPCR産物の品質を確認する。 </li><li>フラスコ内の1x TBEアガロース所望の量を混ぜる。 1％アガロースゲルは、1×TBE 50mlにアガロースを0.5g加える。 </li><li>アガロースまでマイクロ波が溶解する。それは沸騰させないでください。アガロースが完全に溶液中にあることを確認してください。 </li><li> 50ミリリットルのアガロースゲルに5μlの核酸ゲル染色を追加します。 </li><li>アガロースゲルボックスにゲルを注ぎ、コームを設定し、ゲルが固化するまで約1時間待ち。 </li><li>コー​​ムを取り外し、ゲルトレイにゲルボックスを配置します。 </li><li> 12μlの総容量2μlの6Xローディングバッファーと80-10,000 bpのDNA-ラダー2μlの（200 ng）をPCR産物200ngの各を混ぜる。 </li><li>慎重にアガロースゲルのウェルにDNAサンプルをロードします。 </li><li>ランニングバッファーとして1×TBEを使用して、1時間、100Vでアガロースゲルを実行します。 </li><li>画像化システム（ 図2）上のDNAのバンドを可視化。 </li></ol> 4. in vitro転写 （IVT） <ol><li>注：PCRの後、プラスミドインサートを増幅されたポリTテールが付加される。 IVTの間に、遺伝情報はDNAからRNAに転写される。生成されたmRNA転写物は、細胞内でタンパク質を産生するために使用される。 </li><li>アーゼdで作業領域とピペットをきれいにecontaminationソリューション。使用のRNaseと混合反応の汚染を最小限に抑えるために手袋を変更し、PCRクリーンで滅菌デュアルフィルターピペットチップと頻繁に。 </li><li> 表3に記載したように、NTP /キャップアナログ混合物を準備します。 </li><li>ボルテックスで徹底的にNTP /キャップアナログの混合物を混合し、手短にスピンダウン。 </li><li> 表4に記載するようにIVT反応混合物を組み立てる。 </li><li>優しくピペッティングにより完全にIVT反応混合物を混ぜる。次に、チューブの底に混合物を収集するために簡単にPCRチューブを遠心する。 </li><li>サーモで3時間、37℃でインキュベートする。 注：最適なインキュベーション時間は、指定されたテンプレートの挿入や転写効率の長さに依存する。短いインサート（&lt;500塩基）については、より長いインキュベーション時間は、有利であり得る。時間経過実験は、最大収率のための最適なインキュベーション時間を決定するために行うことができる。したがって、examplため、IVT反応をセットアップする電子、1、2、3、4、6時間、および一晩のインキュベーションのためにおよびmRNAの量を決定する。 eGFPのmRNAの生成のためのインビトロ転写の動態は、 図3に示されている。 </li><li> 、テンプレートDNAを除去IVT反応混合物にDNアーゼを1μl（2U /μl）を追加するには、よく混ぜ、37℃で15分間インキュベートする。 </li><li> manufacturer&#39;s指示に従ってRNA精製キットを用いて反応混合物を精製する。 40μlのヌクレアーゼフリー水で二回スピンカラム膜から修正されたmRNAを溶出する。注記：検出RNA濃度は約1,500μg/ mlのである。このように、予想される総量は〜120μgのでなければなりません。他のタンパク質のために合成されたmRNAの量は、CDSの長さとIVTに使用されるPCR産物の量に応じて異なることができる。 </li></ol>南極ホスファターゼで精製mRNAの5。治療<ol><li>注：生成されたmRNAは、5 &#39;トリ除去するホスファターゼで処理さ免疫活性化にRIG-Iによって認識され、リードすることができるリン酸塩、。さらに、ホスファターゼ処理は、セルフライゲーション反応で再環状化を防止する。 </li><li>精製mRNA溶液を79μlに10倍南極ホスファターゼ反応バッファーの9を添加する。その後、南極ホスファターゼ（5U /μl）を2μlのを追加して、静かにサンプルを混ぜる。 30分間37℃で反応混合物をインキュベートする。 </li><li> manufacturer&#39;s指示に従ってRNA精製キットを用いて反応混合物を精製する。 50μlのヌクレアーゼフリー水で二回スピンカラム膜から修正されたmRNAを溶出する。 </li><li>分光光度計を使用して修正するmRNAの濃度を測定する。チェックを260nm / 280nmでの吸光度の比（280分の260）が ≥1.8と260の比率/ 230は純度を示し、これ2.0であること。 注：予想される総収量はsufficie約90μgの、あるべきNT約36 mRNAのトランスフェクションのために。 </li><li>ヌクレアーゼフリー水を添加して100 ng /μLでのmRNAの濃度を調整します。 </li><li> -80℃でのトランスフェクションや店舗に必要な使い捨てのアリコートに変更されたmRNAを分注し。複数の凍結融解サイクルを避ける。適切に準備し、mRNAは、長年にわたって安定して保存され。作業中は、常に氷上に変更されたmRNAを保つ。 </li></ol> 6.コントロールステップ：合成修正mRNAの品質<ol><li> RNAゲル電気泳動によって変更されたmRNAの品質を確認してください。 </li><li>フラスコ内の1x TBEアガロース所望の量を混ぜる。 1％アガロースゲルは、1×TBE 50mlにアガロースを0.5g加える。 </li><li>アガロースまでマイクロ波が溶解する。それは沸騰させないでください。アガロースが完全に溶液中にあることを確認してください。 </li><li> 50ミリリットルのアガロースゲルに5μlの核酸ゲル染色を追加します。 </li><li>アガロースゲルボックスにゲルを注ぎ、コームを設定し、ゲルがソリになるまで約1時間を待つdified。 </li><li>コー​​ムを取り外し、ゲルトレイにゲルボックスを配置します。 </li><li> 0.5〜10キロバイトセンスRNAラダーと10μlの総体積で7μlのローディングバッファーを用いて合成されたmRNA修正200ngの各3μlの（3μgの）を混ぜる。ローディング緩衝液の組成を表5に記載されている。 </li><li> 70℃で10分間ラダーおよびmRNA試料を変性。 </li><li>丁寧に1％アガロースゲル上でラダーとmRNAサンプルをロードします。 </li><li>ランニングバッファーとして1×TBEを使用して1時間、100Vで電気泳動を行います。 </li><li>ゲルドキュメンテーションシステム（ 図4）を使用して、UVトランスイルミネーターと写真にはしごやmRNAのバンドを可視化。 </li></ol> 7.トランスフェクションのための細胞の準備<ol><li> 12ウェルプレートのウェル当たりプレート2×10 5細胞（HEK293細胞）。 </li><li>細胞インキュベーター中で37℃で一晩細胞をインキュベートする。注：トランスフェクションの日に、細胞は、REACを持つべき80〜90％のコンフルエンスにHED。 </li></ol>細胞のmRNAのトランスフェクションの実行8. <ol><li>修正されたmRNAを解凍する。 </li><li>トランスフェクションのためのリポプレックスを生成します。 </li><li>修正されたmRNAの25μlの（2.5μgの）を追加し、473μlののOpti-MEM（最小必須培地）へのカチオン性脂質トランスフェクション試薬2μlの私は12ウェルプレートの1ウェルのトランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を生成するために、血清培地を減少させた。トランスフェクトされる井戸の数に応じてボリュームをスケールアップ。陰性対照として、mRNAをすることなく、トランスフェクション混合物を準備します。 </li><li>ピペッティングにより穏やかに成分を混合。トランスフェクションのためのリポプレックスを生成するために20分間室温でトランスフェクション混合物をインキュベートする。 注：トランスフェクション混合物には抗生物質が含まれていません。このように、細胞の処理中に無菌性を確保するために注意してください。 </li><li> /ウェル500μlのDPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 12ウェルPLAの1つのウェルに500μlのトランスフェクション混合物を追加します。TE。 </li><li> 37℃で4時間、細胞をインキュベートし、5％CO 2。 </li><li>トランスフェクション混合物を吸引し、細胞を1ミリリットルの完全な細胞培養培地を加える。 </li><li>細胞インキュベーター中で24時間細胞をインキュベートする。 </li><li>蛍光顕微鏡を実行すると、蛍光顕微鏡（ 図5）を使用して分析します。注：eGFPの他のmRNAは、mRNAをコードするトランスフェクションによって産生される細胞中の他のタンパク質の発現を調べるために、細胞をカバーガラス上で培養することができる。次いで、トランスフェクションを行うことができ、細胞を適切な抗体で染色し、蛍光顕微鏡によって分析することができる。 </li></ol>細胞におけるEGFP発現9.フローサイトメトリー解析<ol><li>井戸からの細胞培養培地を除去し、1mlのDPBS（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で各ウェルを洗う。細胞培養プレートの表面から細胞を剥離するために、ウェル当たり500μlのトリプシン/ EDTAを追加します。その後、500を追加トリプシンを不活性化するウェルあたりμlのTNS。 </li><li>室温で300×gで5分間分離した細胞を遠心します。唯一のペレットを残して上清を取り除きます。 150μlの細胞固定液中に細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> eGFPを発現する細胞の割合およびジオ平均（蛍光強度の幾何平均）（ 図6）を用いて蛍光強度を分析する。 </li></ol>タンパク質発現の10測定時間オーバー<ol><li>更に、ステップ8で説明したように、12ウェルプレートの3ウェル中の細胞のmRNAのトランスフェクションを行うのmRNAを添加せずに、トランスフェクション混合物を有するHEK293細胞の3つのウェルをインキュベートする。 </li><li> eGFPの1,2の発現を測定し、トランスフェクションの3日後、タンパク質発現（ 図7）の持続時間を評価する。 </li></ol>

<ol><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+%26%2334%3Bgene+therapy%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &#34;gene therapy&#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li>
<li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+Optimized+Wilms%26%2334%3B+Tumor+1+%28WT1%29+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Design of an Optimized Wilms&#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).</li>
<li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized%2C+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li>
<li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+drug+discovery+%26+development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

mRNAの治療は、再生医療の分野では、疾患及びワクチン接種の治療において大きな可能性を有している。このビデオでは、細胞におけるタンパク質発現の誘導のための安定化された、修飾されたmRNAの産生を実証する。このプロトコルを使用して、他の所望のmRNAを生成することができる。修飾されたmRNAのインビトロ合成は、所望のmRNAの細胞のトランスフェクションは、標的タンパク質の発現を誘導することができる。外的にデリバリーmRNAが完全に分解されるまで、それによって、所望のタンパク質は、生理的条件下で一過的に発現されている。 このビデオでは、eGFPの発現は、eGFPのmRNAとHEK293細胞の単一トランスフェクション後3日間、示された。他のタンパク質をコードするmRNA分子は、短いタンパク質発現期間につながる可能性がある。タンパク質の発現は、外因的に送達されたmRNAの分解を減少させる。 SOMのためのこの技術のため、制限電子メールアプリケーションは、タンパク質発現の一過性誘導かもしれない。したがって、より長い期間、細胞中のタンパク質発現を維持するために、mRNAの再...

細胞では、メッセンジャーRNAの転写（mRNA）のおよび所望のタンパク質へのmRNAの翻訳は以下の細胞の適切な機能を確保する。遺伝性または後天性の遺伝性疾患は、タンパク質の不十分や機能不全の合成につながり、深刻な病気を引き起こす可能性があります。したがって、存在しないか、または欠陥のあるタンパク質の産生を誘導するための新しい治療的アプローチは、所望のタンパク質をコードする細胞への合成修飾されたmRNAの外因性送達である。これにより、細胞は、それらが正常に作り出すことができない、または天然必要はありません機能性タンパク質を合成するためにトリガされます。このアプローチを用いて、遺伝的障害は、欠陥または欠落タンパク質1をコードするmRNAを導入することによって補正することができる。 mRNAの療法は、腫瘍細胞または病原体により発現されるタンパク質抗原を、synthetizeするワクチン接種のために使用することができる。それによって、宿主免疫系を効果的に腫瘍細胞を排除またはinfeを防止するために活性化することができるctions 2,3。また、近年では、mRNAは、正常に誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）を作製した。この目的のために、線維芽細胞は、再プログラミングの発現が4~6因子誘導し、再生医療において大きな可能性を有するiPS細胞でそれらを変換するためにmRNAをトランスフェクトした。 以前は、従来のmRNAの使用は、低い安定性および強力な免疫原性と関連していた。このように、従来のmRNAの臨床応用は限られていた。しかし、Karikoと同僚によるmRNA分子内の5-メチルシチジン及びシュードウリジンによるシチジンおよびウリジンの置換は、生物学的液体中の安定したmRNA分子をレンダリングし、劇的に今修正されたmRNAの臨床適用性を可能にする免疫活性化7-10、減少した。 合成的に生成された変更されたmRNAを用いて、所望の遺伝子の転写物は、一時的に、生体内 11 で送達することができるまたはインビトロでタンパク質発現を誘導した。導入されたmRNAは細胞翻訳機構によって、生理的条件下で翻訳される。によるウイルス遺伝子治療ベクターと比較して、宿主細胞ゲノムへの組込みの欠如のために、腫瘍形成のリスクが12,13を防止することができる。このようにして、変性合成mRNAを用いた治療は、将来の良好な臨床受け入れを取得します。 ここでは、変更されたmRNA（ 図1）、mRNAおよびトランスフェクトされた細胞におけるタンパク質発現の評価を用いた細胞のトランスフェクションを製造するための詳細なプロトコールを記載する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">細胞培養</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td> カルシウムとマグネシウムを含まない<td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% トリプシン / 0.03% EDTA&nbsp;</td><td>プロモセル</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>プロモセル</td><td>C-41120</td><td>トリプシン中和液、0.1%BSA HEK-293細胞中の0.05%トリプシン阻害剤</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, 12-well&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNaseおよびRNaseフリー1.5 ml滅菌微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR クリーンで滅菌済みの epT.I.P.S. デュアルフィルター ピペット チップ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>10 & マイクロ;L:022491202;100 & マイクロ;L:022491237;1,000 & マイクロ;l:022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>細菌培養用14mlポリプロピレン丸底チューブ&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">プラスミド増幅および精製</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFPプラスミド&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>ワンショット Top10 化学成分 大腸菌&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水 (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>25 g L-1 滅菌水に溶解します。</td></tr><tr><td>LB寒天培地(Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>L-1 40 g 滅菌水に溶解します。</td></tr><tr><td>アンピシリン レディメイド ソリューション</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mRNA production</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity ポリメラーゼキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 キット&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-メチルシチジン-5&acute;-triphosphate&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>シュードウリジン-5&acute;-triphosphate&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>擬似UTP</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G RNAキャップ構造アナログ&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>リボロックRNase阻害剤</td>サー<td>モサイエンティフィック</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro;l&nbsp;</td></tr><tr><td>ターボDNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&micro;l (MEGAscript T7 Kitより)</td></tr><tr><td>南極ホスファターゼ&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyミニキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap ソリューション&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfection</strong</td></tr><tr><td>>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>カチオン性脂質トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元型血清培地&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>改良型ミニマルエッセンシャルメディウム(MEM)により、ウシ胎児血清(FBS)の補充を減らすことができます&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>ゲル化核酸ゲル染色</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x in water&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLDシリーズミックス DNA-ラダー&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow cytometry analyses</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrate&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">インサート増幅およびポリ(T)テールPCR用プライマー</td></tr><tr><td>Forward Primer(HPLCグレード)10 &micro;M</td><td>エラ バイオテック</td><td></td><td>5&acute;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&acute;</td></tr><tr><td>リバースプライマー(HPLCグレード)10 &micro;M</td><td>エラ バイオテック</td><td></td><td>5&acute;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&acute;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cellインキュベータ</td>ー<td>バインダーCO</td><td></td><td>2(5%)およびO2(20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>CASYセルカウンター&nbsp;</td><td>Sch&auml;rfeシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ワークベンチ&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バクテリアインキュベーター&nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop分光光度計&nbsp;</td><td>分析用イエナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRサーモサイクラー&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動用ゲル装置&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel ドキュメンテーションシステム&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan システム&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmrnaのインビトロ合成における

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

所望の細胞におけるタンパク質合成を誘導するための合成メッセンジャーRNA（mRNA）をコードする外因性送達は、再生医療、基本的な細胞生物学、疾患の治療、および細胞の再プログラミングの分野で大きな可能性を有している。ここでは、フローサイトメトリーにより誘導されるタンパク質の発現の減少した免疫活性化の可能性と安定性の増加、産生されたmRNAの品質管理、細胞のトランスフェクションされたmRNAと、検証と修正されたmRNAの生成のためのステップバイステップのプロトコルを記述する。 eGFPのmRNAを持つ単一のトランスフェクション後3日までに、トランスフェクトHEK293細胞のeGFPを生産。このビデオの記事では、eGFPのmRNAの合成を例に挙げて説明する。しかし、この手順は、他の所望のmRNAの産生に適用することができる。 mRNAを変性合成を使用して、細胞が一過性に、彼らは通常は発現しないと所望のタンパク質を発現するように誘導することができる。

eGFPのCDSを含むのpcDNA 3.3プラスミドを用いて、修正されたeGFPのmRNAの合成（ 図1）が設立された。 PCRによるインサートの増幅およびポリT-テーリングの後、約1100塩基対の長さの明確なバンド（ 図2）が検出される。 IVT時間を増加させると、mRNAの収率（ 図3）を増補。 IVTの後、約1100塩基対の長さを有する透明なmRNAのバンドが製造されるのeGFP mRNAの長さ（ 図4）に対応する検出された。 生成されたeGFP mRNAの機能は、HEK293細胞のトランスフェクションによって試験した。この目的のために、トランスフェクション複合体（リポプレックス）は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して生成された。トランスフェクションは、12ウェルプレートのウェルあたり2×10 5個の細胞を用いて行った。細胞におけるeGFPの製造はFigu（蛍光顕微鏡を用...

このビデオの記事では、細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNA のインビトロ合成を記載する。

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

この手順の全体的な目標は、細胞内でのタンパク質発現の誘導のための修飾mRNAのin vitro合成です。これは、まずプラスミドインサートまたはコードDNA配列を増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて120チミジンのポリTテールを添加することによって達成されます。第2のステップは、生成されたDNAをポリアデニンテールを持つmRNAにin vitroで転写することです。次に、テンプレートDNAをin vitro転写反応混合物のD'S処理により除去する。最後のステップは、生成されたmRNAの南極ホスファターゼ処理で、5つの主要なリン酸塩を除去することです。最終的に、細胞は生成されたmRNA、脂質複合体によってトランスフェクションされます。蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリー解析は、細胞内での増強GFPの合成を示すために使用されます。この技術がウイルストランスフェクトなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、宿主細胞ゲノムへの組み込みがないため、発がんのリスクを防ぐことができることです。この方法は、細胞内で欠損または欠陥のあるタンパク質を生成するのに役立ち、遺伝性疾患のワクチン接種治療に使用できます。また、再生医療の分野では、私の研究室の大学院生であるsteinleさんにその手順を実演していただきます。この手順の開始に先立ち、必要なコーディングDNA配列またはCDSを含むプラスミドを大腸菌で増幅し、プロトコルテキストに記載されているように単離しました。この例では、対象のCDSは、EGFPのCDSを増幅し、同時にポリディテールを付加するために、増強緑色蛍光タンパク質またはEGFPです。プロトコルのテキストに詳述されているように、PCR混合物を調製します。PCRチューブをサーモサイクラーにセットし、プロトコルテキストに記載されているPCRサイクリングプロトコルを実行します。PCR反応が完了したら、市販のPCR精製キットを用いてPCR反応をクリーンアップし、20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を用いてDNAを希釈します。PCR産物の品質を確認するには、DNAゲル電気泳動を行い、イメージングシステム上でDNAバンドを可視化します。約1, 100塩基対の長さの透明なDNAバンドは、in vitro転写またはIVT中に検出されるべきです。以前に生成されたDNAはmRNAに転写されます。NTPキャップのアナログ混合物を図のように用意します。NTPキャップのアナログ混合物をボルテックスで十分に混合します。次に、この表で説明されているように、IVT反応混合物を簡単に組み立てます。IVT反応混合物を、ピペッティングで穏やかに上下させて十分に混合します。次に、PCRチューブを短時間遠心分離して、チューブの底に混合物を回収します。IVT反応混合物を37°Cでサーモミキサーで3時間イ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。...

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

哺乳類システムによる組換えタンパク質の発現は、構造生物学のためのタンパク質複合体を生成するための魅力的な方法になりつつあります。ここでは、浮遊増殖した哺乳類細胞を使用して構造研究のためのタンパク質複合体を精製する、シンプルでありながら高効率な発現システムを紹介します。...

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

適切な翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質の実験室規模での生産は、大きな障壁を表しています。ここでは、哺乳類の発現システムを使用したタンパク質発現の迅速な確立とターンアラウンドを実現する堅牢なプロトコールをご紹介します。このシステムは、選択的アミノ酸、タンパク質の選択的標識、および糖鎖組成の低分子モジュレーターをサポートします。...

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA...

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

RNA を対象とした小分子の存在下で興味の mRNA シーケンスの二次構造を決定するプライマー拡張 (形状) を用いて分析両方生体外でそして細胞の選択的...

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。...

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。...

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

自己組織化ペプチドポロキサミンナノ粒子(PP-sNp)は、イン ビトロ転写 メッセンジャーRNAをカプセル化および送達するためにマイクロ流体混合装置を使用して開発される。記載されたmRNA/PP-sNpは、...

ペプチドポロキサミンナノ粒子を用いた培養細胞における in vitro 転写mRNAの効率的なトランスフェクション

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。...

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

学ぶ修飾mRNAのインビトロ合成法。プラスミド増幅、ポリTテール付加、転写、DNA除去、ホスファターゼ処理の各ステップを解説。HEK293細胞へのトランスフェクションとEGFP発現解析により、遺伝子治療やワクチン開発への応用可能性を示します。

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

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