ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

この手順の全体的な目標は、細胞内でのタンパク質発現の誘導のための修飾mRNAのin vitro合成です。これは、まずプラスミドインサートまたはコードDNA配列を増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて120チミジンのポリTテールを添加することによって達成されます。第2のステップは、生成されたDNAをポリアデニンテールを持つmRNAにin vitroで転写することです。

次に、テンプレートDNAをin vitro転写反応混合物のD'S処理により除去する。最後のステップは、生成されたmRNAの南極ホスファターゼ処理で、5つの主要なリン酸塩を除去することです。最終的に、細胞は生成されたmRNA、脂質複合体によってトランスフェクションされます。

蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリー解析は、細胞内での増強GFPの合成を示すために使用されます。この技術がウイルストランスフェクトなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、宿主細胞ゲノムへの組み込みがないため、発がんのリスクを防ぐことができることです。この方法は、細胞内で欠損または欠陥のあるタンパク質を生成するのに役立ち、遺伝性疾患のワクチン接種治療に使用できます。

また、再生医療の分野では、私の研究室の大学院生であるsteinleさんにその手順を実演していただきます。この手順の開始に先立ち、必要なコーディングDNA配列またはCDSを含むプラスミドを大腸菌で増幅し、プロトコルテキストに記載されているように単離しました。この例では、対象のCDSは、EGFPのCDSを増幅し、同時にポリディテールを付加するために、増強緑色蛍光タンパク質またはEGFPです。

プロトコルのテキストに詳述されているように、PCR混合物を調製します。PCRチューブをサーモサイクラーにセットし、プロトコルテキストに記載されているPCRサイクリングプロトコルを実行します。PCR反応が完了したら、市販のPCR精製キットを用いてPCR反応をクリーンアップし、20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を用いてDNAを希釈します。

PCR産物の品質を確認するには、DNAゲル電気泳動を行い、イメージングシステム上でDNAバンドを可視化します。約1, 100塩基対の長さの透明なDNAバンドは、in vitro転写またはIVT中に検出されるべきです。以前に生成されたDNAはmRNAに転写されます。

NTPキャップのアナログ混合物を図のように用意します。NTPキャップのアナログ混合物をボルテックスで十分に混合します。次に、この表で説明されているように、IVT反応混合物を簡単に組み立てます。

IVT反応混合物を、ピペッティングで穏やかに上下させて十分に混合します。次に、PCRチューブを短時間遠心分離して、チューブの底に混合物を回収します。IVT反応混合物を37°Cでサーモミキサーで3時間インキュベー

3時間後、IVT反応混合物に1マイクロリットルのDNAを加えて、テンプレートDNAを除去します。よく混ぜ合わせ、摂氏37度で15分間インキュベートします。RNA精製キットを使用して反応混合物を精製し、スピンカラム膜からの修飾MR NAを40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で2回希釈すると、IVTによって生成された修飾mRNAをホスファターゼで処理して、免疫活性化につながる可能性のある5つの主要な三リン酸を除去する必要があります。

この手順を開始するには、精製したmRNA溶液79マイクロリットルに9マイクロリットルの10 x Antarcticホスファターゼ反応バッファーを加えます。続いて、2マイクロリットルの南極ホスファターゼを加え、サンプルを穏やかに混合します。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。

30分後、RNA精製キットを使用して反応混合物を精製し、スピンカラムメンブレンからの修飾mRNAを50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で2回希釈します。修飾されたmRNAの濃度を測定した後、ヌクレアーゼフリー水を加えて濃度を100ナノグラム/マイクロリットルに調整します。RNAゲル電気泳動により合成した修飾mRNAの品質を確認し、UVトランスイルミネーターのラダーとmRNAの禁止を可視化します。

約1, 100塩基対の長さの透明なmRNAバンドが検出されるべきです。HEC 2 9 3細胞をトランスフェクションするために、合成した修飾mRNAを2回プレーティングして調製します。12ウェルプレートのウェルあたり5つの細胞を中央に配置し、細胞インキュベーターで摂氏37度で細胞を一晩インキュベートします 翌日、細胞は80〜90%のコンフルエンスに達しているはずです。

トランスフェクション用の脂肪神経叢を生成します。12ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクションするのに十分なトランスフェクション混合物を準備するには、2.5マイクログラムの修飾mRNA、2マイクロリットルの脂質トランスフェクション試薬、および473マイクロリットルのオプトワンが必要です。血清培地を減らします。.

ネガティブコントロールとしてピペッティングして、成分を穏やかに混合します。トランスフェクション混合物を Mr.NA せずに調製し、トランスフェクション混合物を室温で20分間インキュベートして脂肪プレプレックスを作製します。トランスフェクション用。

細胞を500マイクロリットルのDPBSで洗浄します。ウェルに500マイクロリットルのトランスフェクション混合物を12ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で4時間インキュベートし、4時間後に5%二酸化炭素でインキュベートし、トランスフェクション混合物を吸引し、1ミリリットルの完全細胞培養液を添加する。各ウェルの細胞に培地。

細胞を細胞インキュベーターで24時間インキュベートします。その後、蛍光顕微鏡を使用して細胞の蛍光顕微鏡分析を行い、フローサイトメトリー用の細胞を調製します。ウェルから細胞培養培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSのいずれかで各ウェルを洗浄します。

ウェルあたり500マイクロリットルのTRIPSIN EDTAを添加して、細胞培養プレートの表面から細胞を剥離します。続いて、ウェルあたり500マイクロリットルのトリプシン中和溶液を加えて、分離した細胞をG室温の300倍で5分間遠心分離機に不活性化します。supinate Reeseを除去した後、細胞口蓋を150マイクロリットルの細胞固定溶液に懸濁し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーチューブに移します。

EGFPを発現する細胞の割合と蛍光強度を、蛍光強度の幾何平均を用いて解析します。経時的なタンパク質発現は、プロトコルのテキストに記載されているように、トランスフェクションの1日後、2日後、および3日後にEGFP発現細胞のフローサイトメトリー分析によっても評価され、生成されたEGFP mRNAの機能性は、HEC 2 9 3細胞のトランスフェクションによって試験されました。細胞内のEGFPの産生は、トランスフェクションの24時間後に蛍光顕微鏡を用いて検出されました。

ここでは、細胞の顔のコントラスト画像が、細胞の蛍光画像の隣に示されています。細胞内のEGFP発現は、トランスフェクションの24時間後にフローサイトメトリーによっても検出されました。ピンクの線はmRNAを含まない細胞、トランスフェクション、青の線はEGFP陽性細胞を表しています。

EGFP mRNAトランスフェクション後、測定された全細胞の93.91%が陽性であり、蛍光強度の幾何平均は720.16でした。HC2 93細胞におけるタンパク質発現の持続時間を、mRNAの1日後、2日後、および3日後にEGFP発現を測定することによって評価した。トランスフェクションタンパク質の発現は、トランスフェクションの24時間後に細胞内で最も高かった。

その量は翌日ごとに1.6倍ずつ減っていましたが、3日経っても細胞にはEGFPが入っていたらマスター。この手法は、適切に実行すれば2日で実行できます。このビデオを見れば、細胞内で目的のタンパク質発現を誘導するための安定化修飾MRNAの作り方を十分に理解できるはずです。