エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

この手順の全体的な目標は、エレクトロポレーションされたニワトリの胚性脊髄からのすべての遺伝子とサンプルの発現レベルを評価することです。これは、最初に卵子で、初期胚の神経管の右側を孔開いて、胚を目的の段階に再インキュベートすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、RNAフリーの環境でトランスフェクションに成功した神経管の半分を解剖し、できるだけ早く溶解に進むことです。

3番目のステップは、RNAを単離し、サンプルをライブラリ調製とハイスループットシーケンシングにさらすことです。最後のステップは、データセットを処理してシーケンシングアーティファクトを削除することです。品種をゲノムにマッピングし、各遺伝子に発現レベルを割り当てます。

最終的には、対照条件と実験条件での発現レベルを比較することで、発現差のある遺伝子を示すことができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、神経管解剖として重要です。胚の操作に精通している必要があるため、手順を学ぶのは困難です。

このデモンストレーションでは、胚を神経管でGFP発現コンストラクトを使用して形質転換しました。胚ごとに1〜2マイクログラムの全RNAを収集するために、最大10個の胚に2時間取り組むことを覚悟してください。RNAの遊離条件下で、微細な解剖ハサミとSVEコレクションスプーンを使用して胚を採取し、各胚を冷たくします。

DEPC治療済み。PBSは、細いピンセットを使用して四肢の芽の間の胚の側面領域全体を除去することにより進行する神経管分離ステップのすべての溶液を使用しました。このセクションを組織の背側を上にして、新鮮な冷溶液に移します。

2本の細いガラス針を使用して、神経管とパリアル中胚葉の間の胚の各背側外側に3つのスポットを穿孔します。次に、2本のガラス針を中央のミシン目に挿入し、AP軸に沿って離します。必要に応じて各穿孔を通じてこれを行い、最終的に視差中胚葉を剥離し、この組織を取り除き、廃棄します。

次に、胚を横向きにし、神経管とリンパ節の間に2本のピンセットの先端を導入します。それらをAP軸に沿ってスライドさせて離し、構造を分割します。神経管から大きなメダー組織片を取り除き、余分な中胚葉をピンセットでつまみながらピンセットで優しく固定します。

次に、神経管を新鮮な冷たい溶液にそっと移します。手動ポンプ付きのガラスピペットを使用して、必要なすべての神経管を採取し、氷の上に置いてから作業を進めます。次に、各神経管を2つに分割します。

鋭利な先端ピンセットをルーメンに挿入し、ルーフプレートを引き裂きます。次に、ピンセットを使用して床板を切り取り、ティッシュを半分に分割します。蛍光解剖顕微鏡を使用して、エレクトロポレーションされた半分と非エレクトロポレーションされた半分を選別します。

選別した神経管の半分を新鮮な溶液を入れた1.5ミリリットルのチューブに移します。これらのチューブをフリックして、すべての組織を底まで下ろします。次に、チューブを100GSで数秒間スピンダウンします。

次に、明るい照明の下で非常に慎重に、スナットを吸引します。組織が引き出された場合は、ゆっくりと排出し、スピンを繰り返します。神経管の半分から溶液が取り除かれたら、神経管あたり70マイクロリットル、溶解バッファーの半分をチューブに追加します。

チューブをフリックして室温で15分間5分ごとにインキュベートし、チューブを激しくボルテックスしてRNAの収集を進め、RNAを精製しますシーケンシングのためには、サンプルごとに少なくとも8つの神経管の半分を用意してください。マイナス80°Cで保存されたライス神経管の他のコレクションは、コレクションにプールできます。まず氷の上で15〜30分解凍し、その後室温で解凍を完了させます。

解凍したら、すべてのサンプルを激しくボルテックスし、5分間放置します。次に、サンプルを再度ボルテックスし、15, 000 GSで1分間遠心分離します。不溶性物質を取り除くには、上清を新しいチューブに移し、抽出を続行します。

RNA単離キットを使用して、可能な限り高い濃度でRNAを回避してプロセスを完了します。このプロトコルでは、必要なスペースクォータを確保するために、GalaxyのWebサイトアカウントが必要です。まず、品質スコアがすでにShred plus 33でエンコードされていない限り、FASTQファイルをサイトにFTPアップロードします。

まず、NGS QC and ManipulationメニューのFASTQグルーマーツールを使用して、アップロードしたデータセットを準備します。それ以外の場合は、[属性] でファイルの種類を [FASTQ 送信者] に変更します。次に、[NGS QC and Manipulation] メニューで、FAST QC ツールを使用してデータセットの一般的な品質を分析します。

同じメニューでFASTQ品質トリマーを選択して、低品質の3つのプライムエンドを破棄します。品質スコアが 20 以上であれば、処理する必要があります。次に、同じメニューの下にあるクリップツールに移動します。

このツールを設定して、45 塩基対未満の読み取りを破棄します。アダプターのシーケンスを入力します。未知の塩基を持つリードを破棄するオプションを無効にし、クリップされたシーケンスとクリップされていないシーケンスを含める出力を選択します。

シーケンスのトリミング ツールに進みます。これを使用して、リードの最初のベースをトリミングし、FAST qc によって検出される 5 つのプライム シーケンス バイアスを削除します。次のステップは、Illumina Iゲノムサイトから最新のニワトリゲノムアセンブリをダウンロードして解凍することです。

次に、全ゲノム高速フォーマットファイルと遺伝子のアノテーションGTFフォーマットファイルをギャラクシーヒストリーにアップロードします。次に、N-G-S-R-N-A解析メニューにアクセスし、トップハット2ツールを選択して、各サンプルの読み取りをゲノムにマッピングします。Galaxy Historyからアップロードしたfastaファイルをリファレンスゲノムとして選択します。

次に、同じメニューの下にあるカフスボタンツールを選択して、予測されたトランスクリプトームを構築します。サンプルごとに、参照注釈ガイドとして使用する GTF ファイルを選択します。シーケンスデータに対して「Perform bias correction using the FASTA file」を選択し、「use multi read correction」オプションを有効にします。

次に、カフマージツールを使用して、すべてのアセンブルトランスクリプトームをマージします。このツールでは、参照アノテーションにGTFファイルを選択し、シーケンスデータにFASTAファイルを選択します。次に、各サンプルの top hat 2 によって生成された BAM ファイルを、RNA 解析メニューの下にある cuff TIFF ツールで比較します。

[transcripts]フィールドで、カフマージによって生成されたマージトランスクリプトームを選択し、オプションを有効にします。マルチリードコレクトを使用し、シーケンスデータのFASTAファイルを使用してバイアス補正を行います。次のステップは、差分テーブルを並べ替えることです Q 値列を使用して、フィルターと並べ替えメニューから並べ替えツールを選択します。

実験条件間で有意差のある配列は、列13でQ値が最小になります。次に、カバレッジグラフを見てみましょう。まず、オプションのベッドツールメニューにある変換ツールを使用してBAMファイルをベッドグラフファイルに変換し、カバレッジのない領域のレポートを無効にし、スプライシングされたエントリを個別の間隔として扱うことを選択します。

また、実験のすべてのカバレッジを正規化する係数でカバレッジをスケーリングします。次に、変換形式のメニューにあるツールを使用して、結果のベッドグラフファイルを大きなかつら形式に変換し、大きなかつらファイルをカスタムトラックとしてUCSEサーバーにアップロードします。USCSのゲノムブラウザページでは、GALの4つのアセンブリと遺伝子の検索を使用して、空のPSベクトルを発現する神経管をRNAのために採取した方法で説明されている方法を使用して、データセットを視覚的にカバーします。

これを二重に行い、得られたRNAは非常に高品質で、予想通り最適なRIN値は10でした。重複した空のベクターコントロールのトランスクリプトームの全体的な比較では、明確な差は示されず、ピアソン相関係数はポイント99でした。また、スクラッチ2のジンクフィンガードメインを発現する実験サンプルでは、スクラッチ2遺伝子配列にマッピングされたリード数が明らかに増加しました。

したがって、これらの分析法は、予測された濃縮を検出するのに十分な感度を備えていました。このビデオを見た後、胚性神経管を分離し、プロトコルのセクション4のシリコン分析手順に従って、ICデータセットを処理および比較して差次的に発現する遺伝子を見つける方法を十分に理解できるはずです。