Name: 器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ 器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録法。ラット海馬のシナプス結合ニューロン間の電気生理学的特性を解析し、最小シナプス回路の機能を詳細に研究する手法を解説します。

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有益な議論をしてくださったモンゴメリー研究所とマディソン研究所のメンバーに感謝いたします。この調査では、NFNZ、AMRF、Marsden Fund、HRC、NIHから受け取った資金に感謝します。

動物倫理に関する声明： この原稿に記載されているプロトコルは、オークランドとスタンフォード大学の大学によって確立された動物のケアのガイドラインに従ってください。 P7の仔ラットは、迅速な断頭により安楽死させた。海馬切開をその後直ちに以下に記載のように行われる。 1器官海馬スライス培養<ol><li>準備<ol><li> （脳を解剖するためにのみ使用）解剖培地を作製。 、5ミリリットルHEPES緩衝液、2ミリリットル1Mトリスストック液（pH7.2）（0.85％NaCl中各10,000単位）200ミリリットル最小必須培地、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を組み合わせ、およびフィルターは、0.22μmのフィルターを用いて滅菌する。氷のように冷たい解剖培地中で海馬解剖を行ってください。 </li><li>解剖媒体を冷却する。冷凍庫に液体が非常に寒いになるまで解剖を開始する前に約1時間を解剖メディアを配置します。大きな氷​​CRを許可しない形成するystals。必要になるまで氷上で保管してください。 </li><li> （海馬の解剖を除いてすべてのために使用される）培養液を準備します。 100ミリリットルの最小必須培地を組み合わせて、（1×濃度、液体）ハンクス塩/ W、L-グルタミン/ W、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液（0.85％NaCl中の液体、それぞれ1万台）、2.5ミリリットルのHEPES、1Mバッファソリューション、50ミリリットルハンクス液を50mlウマ血清（定義された、熱不活性化）、フィルター、0.22μmのフィルターで滅菌する。 </li><li>培養皿を準備します。 35mm培養皿あたりの培地の1ミリリットルを置き、それぞれの皿にメンブレンインサートを追加します。 1 150ミリメートルペトリ皿にこれらの料理の7まで使用すること（「プレート」と呼ぶ）。皿中の培地は、適切な温度およびpHを達成するように、解剖が始まる前に、少なくとも1時間、CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol></li><li>生後7日目のラット仔から海馬の解剖（P7） <ol><li>手順の前に、UV光の下ですべての解剖ツールを事前に滅菌する。 </li><li>迅速な断頭後、一皿に冷やした培地中に脳と場所を削除し、解剖用の湿らせた濾紙片にそれを削除します。海馬を露出させ、鈍い滑らかなプラスチックでコーティングされたミニチュアスパチュラを使用して離れて脳からの皮質をいじめる。円蓋をカットした後、静かに（ 図1A）、それを反転する海馬の下にへらを働く。 注：正常スライス培養は、P10まで動物を用いて調製することができる。 </li><li>離れて脳の残りの部分から分離された海馬をトリミング。湿らせた柔らかい絵筆を使用して冷却された解剖メディアを含む新しい皿に海馬の転送（ 例えば 、白クロテン＃4）。 </li><li>解剖時の脈絡叢の海馬の下側（ すなわち 、より平坦側）を清掃して、これらのスポンジ状、meninge様組織は、それが困難な海馬を分離するために作るように後で互いにスライス。 注：彼らは静かにからかわできない場合には所定の位置にこれらの組織のままにしておきます。 </li><li>海馬を損傷することなく、可能な限り迅速に全体解剖を行ってください。 注：慎重な解剖限り実験条件が冷えているように、高速で1よりも重要である。同時に3匹のラットからの海馬をスライス。スライスの健康は限り最初からメッキスライスはインキュベーターに行くときに合計時間が30分の下にあるように影響を受けません。 </li></ol></li><li>スライシング<ol><li>手動の組織スライサーを使用して、400μmの横断面に横方向に海馬をスライス。スライスが実施される方法は、それが組織に過度に有害ではないと（ つまり、アモンのホーンを容易に組織内に保存されるように見られている）は、容易に目に見える層状アーキテクチャと整合厚さのスライスを生成するように、重要ではありません。 </li><li>組織のステージに海馬うそ＃2ろ紙のトリプル厚さの上にチョッパー。海馬は（むしろこの時点でスライスされたパンのパンのように、 図1B全てのカットが行われたまで、 すなわち全体の海馬がチョッパーのステージ上に残っている）は、個別のスライスを削除せずに完全にスライスされている。 </li><li>次の各海馬（白クロテン＃2）に敷設ソフト絵筆を使って解剖培地に海馬を転送します。静かに海馬とその下のろ紙の間の接着を破壊する側にそれぞれ海馬を押してください。段階からそれを拾うために、各海馬の下にブラシをロールバックします。チルド解剖媒体の同じ35ミリメートルペトリ皿にすべての海馬を置きます。手動で右回りと左回りの運動を交互に料理を攪拌することにより、個別スライスに海馬を分離します。 </li><li>解剖顕微鏡下でスライスを点検し、損傷している任意のものを捨て、小さな、またははっきりと目に見える細胞を有しないものボディ層。 注：それは多くの場合、すべてのスライスが正常に、このように自分の兄弟から分離されるわけではない場合になります。この場合、それらはエッジに回し、微細鉗子の先端とそれらをつついて分離することができる。 「良い」のスライスは、その後、カットオフとファイアーポリッシュパスツールピペット（ 図1C-E）を使用して冷却された解剖培地を含む別のきれいなペトリ皿に移している。 </li></ol></li><li>ストレージ<ol><li>メンブレンフィルターインサート上に個別のスライスを配置します。パスツールピペットを使用すると、個別に培養インサートにスライスを転送し、遮断し、火が大きなボアを与えるために研磨。 注：切断·ピペットを火研磨する際に作成した穴の大きさが重要です。小さすぎるとスライスを簡単膜用ピペットを残すことはありません。大きすぎると過剰な流体は、スライスとともに、膜の表面上に配置されている。最高のボア径は、典型的には約半分DIAMですピペットのバレルのETER。切断時に、この直径は、ピペットのテーパーに適切な場所で切断することにより選択することができる。 </li><li>スライス転送<ol><li>第1の媒体とのピペットを記入してから、小さな吸引力で、単一のスライスを吸い上げる。これはピペットの開口部付近のスライスを保持し、スライスを配置し、挿入にあまりにも多くのメディアの追放を防ぐことができます。 </li><li>小さな吊り滴を形成するために、電球にわずかな圧力をかけ、スライスがその液滴に落ち着くし、その後膜にその滴をタッチし、膜上にスライス」の秋 &quot;をできるようにすることができます。一般的に3つのスライスは、各膜インサート上に配置されます。 注：流体液滴が大きすぎると、3つのスライスからの液滴が膜表面上にマージする傾向があり、スライスは、したがって、すべてのことをより困難後で電気生理学的記録のためにそれらを分離すること、膜の中心に集まる。 </li></ol></li><li>流体Removアル<ol><li>スライスに浸漬または解剖媒体のプールに囲まれないように、そのプレートの全てのスライス（1つのインサートあたり3つのスライス=プレート当たり21スライス）のための培養プレートインサートの上部から余分なメディアを吸引除去する。 </li><li>実行これはノーカットますが、ファイアーポリッシュパスツールピペットを使用することです。スライスが落ち着くし、ピペッティングの前に分間膜に付着することを許可する。アップピペットにスライスを吸うしないように注意してください。スライスが落ち着くのに十分な時間を可能にするために、最初にメッキされ挿入するための流体の除去を行う。 </li></ol></li><li>スライスストレージ<ol><li> 37℃、5.0％CO 2インキュベーターに保管してスライス培養。 図1Eにおける文化の最終配置を観察します。個別のスライスは、底部のための多孔質膜を有する培養プレートインサートに載る、このインサートは、少​​量の培地で満たされたペトリ皿内に収まる。これにより、スライスは私の中に浸漬されていませんdiumが、培養プレートインサートの下部にのみ膜を介してそれにアクセスすることができます。 </li><li>必要に応じて、培養プレートインサートを削除するか、またはスライスを含有する挿入膜の一部を切り出してもよい研究のためのいずれかのスライスを削除します。 </li></ol></li></ol></li><li>メンテナンス<ol><li>文化を作った翌日ペトリ皿に培地を交換します。移す前に少なくとも1時間インキュベーター内で平衡化される新鮮な培養培地1mlを含む新しいペトリ皿に培養プレートインサートを転送します。 </li><li>文化を行った後、三日目に同じ方法で再び培養液を交換する。 3日目に、34℃に設定したインキュベーターに文化を移す。 （3〜4日ごとに）各1週間に2回培養液を交換する。 </li><li>健全な文化を特定します。対になった全細胞記録のための健全な文化を選択します。 NOTE：健康な培養物は、明確に定義されたエッジと明確に定義された錐体細胞層を有している。文化ウィット現在または平坦化された境界線と空胞化外観時間暗（おそらく壊死性）の領域が拒否されます。これらの基準を採用し、スライス培養の通常の三分の二は、記録のために十分に健康である。 </li><li>時間のかなり小さなウィンドウ内でこれらの培養物を利用する。ニューロンはゆっくりと時間とともに悪化し、わずかにてんかん様の挙動を表示し始めるので、2週間以上培養して組織を使用しないでください。ニューロンの生存の正確な上限は知られていないが、それは培養中の錐体細胞のような後半の16週間を機能し記録することができる。 </li></ol></li></ol> 2ペア全細胞記録<ol><li> ACSFおよび細胞内ソリューション<ol><li> （単位：mm）120グルコン酸カリウム、40 HEPES、5のMgCl 2、2 NaATP、および0.3 NaGTP（;：290 mOsmで浸透圧KOHで7.2）を混合することにより、シナプス前電極液を調製します。同じ電極溶液はシナプス後ニューロンのために使用される一方、セシウム、グルコン酸（120mMの）は、典型的には、主要なシナプス後の電極中の塩に加え、5 mMのQX314として使用されます。 注：これは、シナプス後NMDAR媒介電流8-10,13を記録するために、正の電位で安定した電圧クランプを可能にします。また、ギガオームシールが行われる前に、シナプス後記録電極から流れる内部液によってシナプス前ニューロンのカリウム誘発性の過剰興奮を防ぐことができます。 </li><li> （単位：mm）を構成するシナプス後電極液120セシウムグルコン酸を準備し、40のHEPES、5のMgCl 2、5 QX314、2 NaATP、および0.3 NaGTP（CsOHを用いてpH 7.2;浸透圧：290ミリオスモル）。 5-10MΩの抵抗でガラス微小電極を引いて、濾過した内部液で満たされる。 </li><li>人工脳脊髄液（ACSF）119のNaCl、2.4のKCl、（mM単位）構成を準備し、MgSO 4 1.3、2.4のCaCl 2、1mMのNa 2 HPO 4、26.2のNaHCO 3、95％O 2、5で飽和した11グルコース、pH7.4で、 ％のCO 2。注：もしAMPAR媒介ResponsesはACSFで10μMのCNQXまたはNBQXを含む、NMDAR EPSCsの検査のためにブロックする必要がある。 </li></ol></li><li>ペア全体の細胞記録を入手<ol><li>二つの個別のニューロン間のシナプス伝達を調べるために、シナプス前ニューロンのような1つのニューロンを指定し、活動電位を誘導し、シナプス伝達を開始するために電流クランプに保持します。 </li><li>シナプス後ニューロンのように、第二のニューロンを指定して、研究者が必要とする情報に応じた電流または電圧クランプでそれを保持。 -65 mVの電圧クランプにシナプス後ニューロンを保持することにより、30 mVの6-16で調べNMDAR媒介EPSCsで調べAMPAR媒介EPSCsで、グルタミン酸作動電流の詳細な検査を取得</li><li>対になった記録を確立します。対になった記録を確立するには、シナプス前細胞全体の記録が常にシナプスconnecteあるものまで得ようとする複数の連続シナプス後ニューロンを可能にする、最初に得られ、dが得られる。シナプス可塑性の実験を行う場合には、シナプス後ニューロンにおけるLTPの誘導として最初のシナプス前ニューロンを得るために特に重要であるLTP 8,19に必要な細胞質要因の洗い出しを防止するために、全細胞の記録を得るための10分以内に開始しなければなりません。 </li><li>運動誘発性細胞損失を避けてください。対になった全細胞の記録を実行する主要な課題は、第二の記録を取得しながら、最初の全細胞記録の振動や動きによって誘発される混乱を避けている。 <ol><li>最初の全細胞記録を入手した後、確立された記録は、モニタ（ 図2A）に見えている領域の端に位置するように、x軸に顕微鏡レンズは10〜200μmを移動します。 </li><li> ACSFはまだレンズとの接触を維持することを保証しながら、顕微鏡〜5〜10ミリメートルのレンズを上げる。第二の電極をマウントし、流体メニスカス（ 図2Bに導く</s·チョン&gt;）。 </li><li>それがレンズを通る光の経路の直下にあるが、それでもかなり確立され、記録電極の上までxy平面に電極を移動します。電極は、顕微鏡下で表示されていると、先端が離れて第一の電極からのモニタの遠端にあることを確認してください。 </li><li>両方の電極が同じ焦点面になるまで、顕微鏡を中心とした順番に第二の電極を下に移動します。これは、最初の全細胞記録を破壊するように、正圧のレベルが強すぎる先端の閉塞を回避するのに十分な強さではないことが重要である。これは、最初のスライスに入る電極から2-3神経細胞の移動を誘導する正圧に変換される。 </li><li>最初のシナプス前の記録（ 図2C）と同様、焦点面におけるシナプス後パートナーを見つけます。録音は、一般に、第1、rの0〜200 mmのニューロンからCA3錐体ニューロン間のペアの録音第二全細胞を入手しているecording（ 図2C、D）。 注：これらの標準的な全細胞記録技術を使用した場合、ニューロンの対の間のシナプス伝達は、最大3〜4時間の期間にわたって安定である。 </li></ol></li></ol></li><li>シナプス可塑性：一度成功したシナプス接続された錐体細胞ペア（ 図3A、B）を取得すると、シナプス伝達と可塑性の特性を調べる。 <ol><li> LTP誘導。 <ol><li> 1分間0 mVの（ 図3C）7-9,12-14 -10にシナプス後脱分極とシナプス前活動電位（1 Hz）を組み合わせることで、LTPを誘導する。シナプス後ニューロンへの侵入の10分以内にペアリングを開始します。 注：シナプス後活動電位がシナプス前ニューロン8への電流の10ミリ秒以下の注入を誘発してLTPはまた、1分間1Hzでシナプス前とシナプス後活動電位を組み合わせることで電流クランプで開催され、両方のニューロンと誘導することができる</s&gt;アップ。 </li></ol></li><li>さらに5〜10分間（ 図3C）9 -55 mVのにシナプス後ニューロンのわずかな脱分極と組み合わせる1Hzで低頻度刺激（LFS）でLTDを誘導する。 </li></ol></li></ol>

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<li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li>
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著者は開示するものは何もありません

ここでは、器官型海馬スライス培養物において成功対の全細胞記録を確立するための要件を記載している。対になった記録はまた、急性スライスおよび解離培養系26,27を含む複数の調製物中で行うことができる。ここでの焦点は、シナプス可塑性（すなわちLTP及びLTD）の長い形の誘導になって、それが器官全体細胞記録をペアにことを強調することが重要であり、急性スライスと細胞調製が短い、量子的な大きさに重要な洞察を提供してきた解離したが-TERM可塑性、シナプス前機能のほか、LTPとLTD 2,4,8,26,27。 器官型スライス方式の主な利点は、ニューロン間の接続性の増加である。急性スライス標本におけるシナプスの接続が原因スライス標本中の軸索の接続の切断に低い。われわれの経験では、シナプスconnecteから録音をペアリング急性スライス中のd CA3ニューロンは、取得したペアの録音のみ〜5％で可能であった。すなわち、対の録音の95％が未接続であった。代替案は、一次シナプス接続は26かなり高い海馬培養解離使用することです。しかし、解離培...

グルタミン酸受容体は、中枢神経系のシナプスにおける興奮性シナプス伝達の大部分を媒介する。シナプス後膜のスパインヘッドであるN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）に局在するイオンチャネル型グルタミン酸受容体の二つの主要なサブタイプおよびα-アミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチルイソオキサゾール-4 - プロピオン酸（AMPA）受容体。静止膜電位では、AMPA受容体がシナプス伝達の間にシナプス後電流の大部分を運ぶ。海馬では、NMDA受容体はシナプス後膜におけるAMPA受容体の数の変化を誘発するのに重要な役割を果たしている：「一致検出器」として作用することにより1は 、シナプス強度1の変更を開始するために、NMDA受容体はシナプスのメカニズムに関与してそれは細胞下レベルで学習と記憶を下支えすると考えられている。シナプス前伝達物質放出と平行してシナプス後ニューロンの脱分極に応答して、カルシウムは、NMDAを経由して入る受容体はAMPA受容体の挿入または取り外し2を開始する。これらの受容体の動態は、シナプス可塑性の基礎となる：シナプス強度の低下が長期抑圧4（LTD）である、シナプス強度の増大が、長期増強の2,3（LTP）である。 NMDA受容体は、その誘導を制御すると考えられているつつAMPA受容体の移動は、シナプス可塑性の発現に関与すると考えられている。 シナプス伝達と可塑性の基礎となる正確なメカニズムを決定することは、シナプスの小集団、理想的には単一のシナプスを研究する必要があります。いくつかのシナプスが、このレベルでの研究のために非常に適しているが、 例えば 、5開催の萼は、ほとんどのシナプス集団についてこれは、シナプス結合の小と拡散自然に非常に困難である。二つの主要な電気生理学的技術は、単一のシナプス結合を調べるために開発されている：最初は最小限の刺激であり、機種では電子1シナプス前繊維は細胞外刺激さと推定される。第2の技術は、シナプス接続ニューロンからの2同時ホールセル記録が行われ録音を、ペアになっています。最小限の刺激の主な利点は、それが同時にシナプス後ニューロンから記録しながら軸索管への細胞外刺激電極の配置を含む、実行するために迅速で比較的簡単であることである。この技術を用いて第一の関心事は、単セルの信頼性のある刺激はめったに裁判後に裁判を保証しないことができるということである。 過去15年間で私たちは、日常的に2シナプス接続錐体ニューロン6-17からペアリングホールセル記録を使用している。この技術の主な利点は、1つのシナプス前ニューロンが一貫して確実に刺激されることである。また、電気生理学的特性評価だけでなく、シナプス前ニューロン6,18の薬理学的操作だけではないことができます&lt;/ SUP&gt;。しかし、ニューロン間のシナプス接続の確率は、19を得るために接続されたペアが困難に低い。シナプス接続は、インビトロ、得られた接続性、さらに自然に再確立できるように、器官型脳切片培養物の使用は、この障害を回避するネイティブ脳組織20と同様である。さらに、器官培養物は可塑性にメカニズムを有効にする、対になったパルスの円滑化（PPF）とうつ病（PPD）6,22,23を含む短期シナプス可塑性のLTP、LTD 7-10,12-15,21と追加のフォームを表現ニューロンのペアで研究される。ここでは、正常にこのin vitro系でのペアの録音を達成に関わる詳細な方法論について説明します。この情報は、容易に急性スライスおよび他の脳領域を含む他の実験系に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td></td><td></td><td>Stable電動マイクロマニピュレーター&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液&nbsp;</td><td></td><td></td><td>浅いティッシュバス</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td></td><td></td><td>DICカメラ</td></tr><tr><td>1M トリス原液</td><td></td><td></td><td>アンプ</td></tr><tr><td>ハンクs Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>Computer</td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;</td><td></td><td></td><td>防振テーブル</td></tr><tr><td>プラスチックコーティングされたミニチュアヘラ</td><td></td><td></td><td>直立顕微鏡</td></tr><tr><td>ソフトペイントブラシ</td><td></td><td></td><td>データ取得・分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>手動ティッシュチョッパー</td><td></td><td></td><td>電極プーラー</td></tr><tr><td>#2 フィルターペーパー</td><td></td><td></td><td>ファラデーケージ</td></tr><tr><td>#5 鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メンブレンインサート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クラスIIフード</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録を含み、個々のニューロン間のシナプス接続の直接的な電気生理学的特性評価だけでなく、シナプス前ニューロンまたはシナプス後ニューロンの薬理学的操作も可能にします。器官型の海馬スライス培養で実施すると、2つのニューロンがシナプス的に結合している確率が有意に増加します。この調製により、細胞タイプの同定が容易になり、ニューロンは天然の脳組織と同様のシナプス機能の形態と特性を維持します。ペア全細胞記録の主な利点は、細胞外軸索刺激を利用する他のより粗雑な技術では不可能な、シナプス伝達と可塑性の特性に関する非常に正確な情報を提供できることです。ペアの全細胞記録は、実行するのが難しすぎると認識されることがよくあります。この手法には難しい側面もありますが、特定のハードウェアと方法論の基準に従えば、全細胞パッチクランプのトレーニングを受けた人なら誰でもペア録音を行うことができます。シナプス結合ペアの記録を達成する確率は、健康な器官型スライスと安定したマイクロマニピュレーションにより、シナプス前およびシナプス後の全細胞記録の独立した達成を可能にすることで大幅に増加します。CA3-CA3錐体細胞ペアは、器官型スライス海馬調製物で最も広く使用されていますが、この技術はCA3-CA1ペアでも成功しており、同じスライス調製物でシナプス的に結合している任意のニューロンに適応させることができます。この原稿では、電気生理学が装備された任意の実験室でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件を提供します。

シナプス接続は記録電極を経由して脱分極電流パルス（20ミリ用、一般に20〜50 PA）を渡すことによって、活動電位を発射するために、シナプス前ニューロンを刺激することによって明らかである。シナプス後現在のトレースは、次にシナプス前活動電位（ 図3A）のピークの後に短い（&lt;5ミリ秒）で一貫性の潜時で誘発単シナプスEPSCの有無を調べる。シナプス接続されたペアを得ることができる前に、ほとんどの実験では、複数のシナプス後ニューロンが試験される。全体的に、シナプス前CA3細胞の〜1/3がmonosynapticallyアクティブなシナプス結合（ 図3A）によってシナプス後CA3セルに結合され、CA3ニューロンの約20％は、すべてのサイレントシナプス結合6,8によって接続されている。 ベースラインAMPA受容体媒介電流の振幅は、対になった記録内の試験からの裁判に可変であり、また、独立したパイの間赤の録音（ 図3B）6,8。平均AMPAR EP...

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録であり、個々のニューロン間のシナプスの正確な電気生理学的および薬理学的特性評価を可能にします。ここでは、電気生理学が装備された任意の実験室の器官型海馬スライス培養でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件について説明します。

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

次の実験の全体的な目標は、脳内の最小シナプス回路から電気生理学的に記録できるようにすることです。これは、プラスチック培養インサートで成長したラット海馬の器官型スライス培養物から行われた記録で達成されます。これらのスライスは、精巧でありながら適切なシナプス結合を形成し、培養の成長期間後に簡単に記録できます。これらのスライスに記録を作成することで、2つのニューロン間でのみ形成された最小シナプス回路のシナプス活動を分離することができ、したがって、ニューロン回路の最も基本的な特性の研究が可能になります。この方法は、海馬のシナプス微小回路の機能を調べるために使用できますが、隣接するニューロンがシナプス的に接続されている脳の任意の領域に使用できます。記録方法と解剖方法の両方の視覚的なデモンストレーションは、ステップの多くが脳のランドマークとニューロンの正確な識別に依存しているため、スライスを作成する前にすべての溶液と培養プレートを準備します。スライスを収集するための大きなプレートには、それぞれに7つの小さな皿が含まれており、それぞれに組み立て時に培地と培養インサートが付いています。エアが溜まらないように、インサートをメディアに斜めにセットします。これらのプレートをインキュベーターに保管し、構造ランドマークを使用して脳をナビゲートすることにより、損傷することなく、P 7げっ歯類の脳の各半分から海馬を慎重に取り除きます。まず、脳を正中線に沿って分割します。次に、細かいヘラを使用して、皮質を中脳から分離します。脳を剥がすと海馬が現れます。次に、ヘラの先端で円蓋をカットし、FIAと海馬の下にヘラを動かします。次に、海馬を脳から転がし出し、付着した組織から海馬を切り取ります。海馬をそっとすくい上げ、氷冷解剖培地に入れます。2番目の海馬の収集を進めます。2匹のカバカンピをスライスしながら進めていきます。2つの厚さの湿ったチョッパーブロックのステージにそれらを置きます。その2、濾紙。次に、スライスを持ち上げずに連続して400ミクロンの横スライスを作成します。その結果、スライスしたパンのようになります。一貫した厚さと優しい取り扱いが重要です。次に、4番のアーティストの絵筆である柔らかな白いセーブルを使用して、スライスした各海馬の下にブラシをそっと転がし、ステージから持ち上げます。両方のカバカンピが移されたら、皿を覆い、激しく渦を巻く。頻繁に方向を変えてください。目標は、スライスを分離することです。次に、解剖顕微鏡でスライスを検査し、損傷しているものや必要よりも小さいものは廃棄します。また、セル層がはっきりと見えないスライスは、損傷の兆候でもあるため、廃棄してください。分離しなかったスライスは、端を上に向け、デュモン鉗子で突いて強制的に引き離すことができます。まず、ピペットに培地を入れます。次に、スライスを開口部の近くに保ちながら、スライスをそっと吸い上げます。軽い圧力を使用します。先端に液滴を形成し、スライスが液滴に落ち着くのを待ちます。次に、液滴を組織培養物の表面に触れます。挿入する。スライスがインサートにはっきりと付着したら、ピペットを引き出します。液滴が大きすぎない場合は、3つのスライスが1つの膜に収まります。挿入する。すべてのスライスが移されたら、牧草地のピペットを使用して、各スライスの周りの培地を穏やかに吸引します。メッキされたインサートの液体除去を行います。まず、スライスが落ち着くのに十分な時間を確保します。次に、各小さな皿を覆い、次に大きな皿を覆い、アセンブリをインキュベートします。スライスを切った翌日にスライスを給餌します。その後、切断後3日目に再びそれらを供給します。2回目の給餌後、摂氏34度のインキュベーター(5%CO2)に移し、その後、週に2回培養物に給餌します。器官型スライスは、切断後1〜2週間で記録する準備ができています。レコーディングリグで、カルチャーインサートの底とスライスの周りをメスで完全に切り取り、個々のスライスを取り出します。切断したプラスチックサークルをデュモン鉗子で取り外し、電気生理学リグの記録チャンバーに入れます。鉗子を使用して、スライスを記録チャンバーに移動します。次に、ステージを維持しながら、10倍、次に40倍の拡大でスライスの表面に焦点を合わせてスキャンし、CAの3セル本体層を見つけます。標的細胞が同定されたら、対物レンズと記録チャンバー内のA CSFとの間の液体メニスカスを壊さずに、対物レンズを可能な限り持ち上げます。次に、対物レンズの下に全細胞記録電極を置き、電極がターゲットニューロンに接触するまで、電極の先端を見つけるために焦点を合わせます。電極に破片が入らないように、電極内部溶液に正圧を維持してください。次に、電極がスライスの表面近くに来るまで、電極と対物レンズを一緒に下げます。次に、電極を組織内にさらに下げ、標的ニューロンの側面にそっと押し込みます。次に、陽圧を取り除き、内部溶液に優しく吸引を加えて、ニューロンの膜にギガオームシールを作ります。シールが作成されたら、吸引パルスで電極の下の膜を破壊するか、1つの全細胞記録で増幅器の静電容量を過剰に補償します。対物レンズを再度持ち上げ、最初の記録を中断する動きを最小限に抑えるために2番目の電極を設定します。2番目の電極の正圧の量を低く保ちます。適度に低い流量は、2〜3ニューロンの距離で運動を誘発します。2回目の全細胞記録が確立されると、シナプス伝達は1時間から4時間の間安定するはずです。シナプス結合性は、シナプス前ニューロンを刺激して活動電位で発火させ、その後、5ミリ秒以内にシナプス後ニューロンのモノシナプスEPCを見ることによって明らかになります。試験したca three細胞の約3分の1は、活性結合によって別のCA three細胞にシナプス結合したモノスであった。AMPA受容体媒介電流の振幅は、1対の記録内の試験間で異なり、活性接続も異なっていた。EPCは、10ピコアンペア未満または800ピコアンペアを超える場合があります。故障率は、標準的な誘導法を使用して大きく異なりました。LTPとLTDはどちらも、約3からCA 3のシナプスで確実に誘導でき、両方の形態の可塑性は2時間以上維持されます。ポリシナプス抑制性イベントの記録の全期間は、CAの3つのパラメタルニューロンペア間で頻繁に観察されました。しかし、これらのイベント間の長い待ち時間のために神経シナプス電流を有意に妨げなかったため、薬理学的にブロックされませんでした。このビデオを見れば、器官型の海馬スライスの作り方や、シナプス的に接続されたニューロンのペアからデュアル全細胞記録を行うための使い方を十分に理解できるはずです。

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

これは、錐体ニューロンから電気記録を作成する目的のための器官培養における新皮質スライス標本を準備し、維持するためのプロトコルです。...

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

私たちは、GABA活性化単一チャネル電流（GABAAチャネル、GABAA受容体）とそれらが神経細胞で生成シナプスとトニック電流を測定するパッチクランプ技術を使用してください。チャネルの活性化は、健康や​​病気で神経細胞の興奮性を低下させる...

ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流

隔離された海馬から急性脳スライスだけでなく、アストロサイトとニューロンの同時電気生理学的記録の準備...

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

このビデオは、トランスフェクションされたマウス海馬の脳スライスにおけるシナプス相互作用とニューロン応答を研究するためのプロトコルを示しています。これには、長距離の感覚ニューロンを照射して活動電位をトリガーし、全細胞パッチクランプ技術を使用して記録されたニューロンに結果として生じる興奮性シナプス後電位を記録することが含まれます。...

マウス海馬切片におけるニューロンの光刺激および全細胞パッチクランプ記録

このビデオでは、シナプスの活動を記録するために、水没室に脳スライスを設置する手順を示しています。このプロセスには、レンズ紙上にスライスを固定し、人工脳脊髄液(aCSF)の連続的な流れを維持してニューロンの生存率を確保し、刺激と記録電極を特定の脳の関心領域に対して正確に配置することが含まれます。この設定により、ベースラインのシナプス活動と電気刺激の影響を正確にモニタリングできます。...

急性海馬切片における神経野興奮性シナプス後電位の記録

私たちは、水生虎サンショウウオ（から薄い網膜スライスの調製を記載...

両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。...

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。...

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

学ぶ 器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録法。ラット海馬のシナプス結合ニューロン間の電気生理学的特性を解析し、最小シナプス回路の機能を詳細に研究する手法を解説します。

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

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