器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録であり、個々のニューロン間のシナプスの正確な電気生理学的および薬理学的特性評価を可能にします。ここでは、電気生理学が装備された任意の実験室の器官型海馬スライス培養でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件について説明します。

次の実験の全体的な目標は、脳内の最小シナプス回路から電気生理学的に記録できるようにすることです。これは、プラスチック培養インサートで成長したラット海馬の器官型スライス培養物から行われた記録で達成されます。これらのスライスは、精巧でありながら適切なシナプス結合を形成し、培養の成長期間後に簡単に記録できます。

これらのスライスに記録を作成することで、2つのニューロン間でのみ形成された最小シナプス回路のシナプス活動を分離することができ、したがって、ニューロン回路の最も基本的な特性の研究が可能になります。この方法は、海馬のシナプス微小回路の機能を調べるために使用できますが、隣接するニューロンがシナプス的に接続されている脳の任意の領域に使用できます。記録方法と解剖方法の両方の視覚的なデモンストレーションは、ステップの多くが脳のランドマークとニューロンの正確な識別に依存しているため、スライスを作成する前にすべての溶液と培養プレートを準備します。

スライスを収集するための大きなプレートには、それぞれに7つの小さな皿が含まれており、それぞれに組み立て時に培地と培養インサートが付いています。エアが溜まらないように、インサートをメディアに斜めにセットします。これらのプレートをインキュベーターに保管し、構造ランドマークを使用して脳をナビゲートすることにより、損傷することなく、P 7げっ歯類の脳の各半分から海馬を慎重に取り除きます。

まず、脳を正中線に沿って分割します。次に、細かいヘラを使用して、皮質を中脳から分離します。脳を剥がすと海馬が現れます。

次に、ヘラの先端で円蓋をカットし、FIAと海馬の下にヘラを動かします。次に、海馬を脳から転がし出し、付着した組織から海馬を切り取ります。海馬をそっとすくい上げ、氷冷解剖培地に入れます。

2番目の海馬の収集を進めます。2匹のカバカンピをスライスしながら進めていきます。2つの厚さの湿ったチョッパーブロックのステージにそれらを置きます。

その2、濾紙。次に、スライスを持ち上げずに連続して400ミクロンの横スライスを作成します。その結果、スライスしたパンのようになります。

一貫した厚さと優しい取り扱いが重要です。次に、4番のアーティストの絵筆である柔らかな白いセーブルを使用して、スライスした各海馬の下にブラシをそっと転がし、ステージから持ち上げます。両方のカバカンピが移されたら、皿を覆い、激しく渦を巻く。

頻繁に方向を変えてください。目標は、スライスを分離することです。次に、解剖顕微鏡でスライスを検査し、損傷しているものや必要よりも小さいものは廃棄します。

また、セル層がはっきりと見えないスライスは、損傷の兆候でもあるため、廃棄してください。分離しなかったスライスは、端を上に向け、デュモン鉗子で突いて強制的に引き離すことができます。まず、ピペットに培地を入れます。

次に、スライスを開口部の近くに保ちながら、スライスをそっと吸い上げます。軽い圧力を使用します。先端に液滴を形成し、スライスが液滴に落ち着くのを待ちます。

次に、液滴を組織培養物の表面に触れます。挿入する。スライスがインサートにはっきりと付着したら、ピペットを引き出します。液滴が大きすぎない場合は、3つのスライスが1つの膜に収まります。挿入する。

すべてのスライスが移されたら、牧草地のピペットを使用して、各スライスの周りの培地を穏やかに吸引します。メッキされたインサートの液体除去を行います。まず、スライスが落ち着くのに十分な時間を確保します。

次に、各小さな皿を覆い、次に大きな皿を覆い、アセンブリをインキュベートします。スライスを切った翌日にスライスを給餌します。その後、切断後3日目に再びそれらを供給します。

2回目の給餌後、摂氏34度のインキュベーター(5%CO2)に移し、その後、週に2回培養物に給餌します。器官型スライスは、切断後1〜2週間で記録する準備ができています。レコーディングリグで、カルチャーインサートの底とスライスの周りをメスで完全に切り取り、個々のスライスを取り出します。

切断したプラスチックサークルをデュモン鉗子で取り外し、電気生理学リグの記録チャンバーに入れます。鉗子を使用して、スライスを記録チャンバーに移動します。次に、ステージを維持しながら、10倍、次に40倍の拡大でスライスの表面に焦点を合わせてスキャンし、CAの3セル本体層を見つけます。

標的細胞が同定されたら、対物レンズと記録チャンバー内のA CSFとの間の液体メニスカスを壊さずに、対物レンズを可能な限り持ち上げます。次に、対物レンズの下に全細胞記録電極を置き、電極がターゲットニューロンに接触するまで、電極の先端を見つけるために焦点を合わせます。電極に破片が入らないように、電極内部溶液に正圧を維持してください。

次に、電極がスライスの表面近くに来るまで、電極と対物レンズを一緒に下げます。次に、電極を組織内にさらに下げ、標的ニューロンの側面にそっと押し込みます。次に、陽圧を取り除き、内部溶液に優しく吸引を加えて、ニューロンの膜にギガオームシールを作ります。

シールが作成されたら、吸引パルスで電極の下の膜を破壊するか、1つの全細胞記録で増幅器の静電容量を過剰に補償します。対物レンズを再度持ち上げ、最初の記録を中断する動きを最小限に抑えるために2番目の電極を設定します。2番目の電極の正圧の量を低く保ちます。

適度に低い流量は、2〜3ニューロンの距離で運動を誘発します。2回目の全細胞記録が確立されると、シナプス伝達は1時間から4時間の間安定するはずです。シナプス結合性は、シナプス前ニューロンを刺激して活動電位で発火させ、その後、5ミリ秒以内にシナプス後ニューロンのモノシナプスEPCを見ることによって明らかになります。

試験したca three細胞の約3分の1は、活性結合によって別のCA three細胞にシナプス結合したモノスであった。AMPA受容体媒介電流の振幅は、1対の記録内の試験間で異なり、活性接続も異なっていた。EPCは、10ピコアンペア未満または800ピコアンペアを超える場合があります。

故障率は、標準的な誘導法を使用して大きく異なりました。LTPとLTDはどちらも、約3からCA 3のシナプスで確実に誘導でき、両方の形態の可塑性は2時間以上維持されます。ポリシナプス抑制性イベントの記録の全期間は、CAの3つのパラメタルニューロンペア間で頻繁に観察されました。

しかし、これらのイベント間の長い待ち時間のために神経シナプス電流を有意に妨げなかったため、薬理学的にブロックされませんでした。このビデオを見れば、器官型の海馬スライスの作り方や、シナプス的に接続されたニューロンのペアからデュアル全細胞記録を行うための使い方を十分に理解できるはずです。