ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

この手順の全体的な目標は、高い細胞生存率と細胞活性化のないヒトTHP 1マクロファージを確実にトランスフェクションすることです。これは、最初にTHP 1単球を48時間事前に分化させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、時期尚早のTP 1マクロファージを切り離すことです。

3番目のステップは、lonzaの核因子技術を使用して、細胞にIRNAまたはプラスミドDNAをトランスフェクションすることです。最後のステップは、細胞を再播種し、さらに分化することです。最終的に、遺伝子のノックダウンまたは過剰発現の成功は、定量的リアルタイムPCR、ウェスタンブロットバックなどを通じて示すことができます。

この技術の主な利点は、リポフェクションなどの他のトランスフェクションアプローチと比較した場合、高いトランスフェクション効率と高い細胞生存率を達成できること、およびマイクロファージの機能と挙動を変化させないことです。残念ながら、この技術は、このプロトコルでは一度に強力なトランスフェクションを実行することができないため、高スプットアプリケーションには適していません。トランスフェクションの24時間前に、RPMI 1640でTHP 1細胞を10%FCSおよび1%ペン連鎖球菌Lグルタミンで培養し、細胞を分割して新鮮な培地を提供しました。

翌日。75平方センチメートルの組織フラスコに1000万から1500万個の細胞を播種し、補充したRPMI培地に次の添加物、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸ナトリウム、1ミリリットルあたり10ナノグラム、PMA、および50マイクロモルベータメルカプトエタノールを48時間後に播種することにより、細胞を事前に分化させ、培地を吸引し、6ミリリットルのアキュテインと交換します。1つは細胞を分離するために摂氏37度に温めました。

インキュベーション中に30分間インキュベートします。細胞の核後愛情ケアのために十分なトランスフェクション培地と培養培地を準備します。30分後、セルが分離し、周りを見回

一部の細胞がまだ付着している場合は、マイクロピペットでフラスコを静かにポンピングするか、単純な攪拌を使用してそれらを取り外してください。スクレーパーは使用しないでください。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、300Gsおよび室温で5分間遠心分離し、吸引により上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁する。

1ミリリットルのRPMIで、中温を摂氏37度に温め、細胞を数え、即時トランスフェクションのために2〜250万個の細胞を含むマイクロリストチューブアリコートを作成します。このプロトコルの迅速な実行は不可欠です。細胞死の損失を避けるために、すべての材料を事前に準備しておくようにしてください 最初の遠心分離機、すべてのトランスフェクションアリコートを250GSで10分間、室温でスピンダウンしている間、すべてのヌクレオエフェクター獣医にプラスミドDNAの半分マイクログラムまたはSI RNAの半分のマイクログラムをロードします 高濃度の希釈を使用して、獣医の最小限のボリュームを占めるようにします。

次に、細胞の1つだけから上清を吸引します aliquots resus。細胞を核因子溶液中に100マイクロリットルに懸濁します。細胞を溶液に15分以上さらさないでください。

細胞をQ vetに移し、優しくたたいて混ぜます。次に、プログラムY 0 0 1を使用して、モデル2のB核因子に細胞をトランスフェクションします。使い捨てピペットを使用して、エレクトロポレーションした細胞を反応バイアルに移し、すぐに事前に警告したトランスフェクション培地を半ミリリットル細胞に加えます。

次に、細胞の各アリコートでプロセスを1つずつ繰り返し、すべての細胞がトランスフェクションされるまで繰り返します。核の愛情注入が完了したら、細胞の各トランスフェクションを2.5ミリリットルの温かいトランスフェクション培地を含む6ウェルプレートのウェルに移します。マイクロピペットで各ウェルをよく混ぜます。

ロードしたすべてのプレートを4時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞の状態を確認します。4時間後、必要に応じてほとんどの細胞をプレートに接着する必要があります。高々。

さらに1時間のインキュベーションにより、一度に1つずつうまく機能する十分なサヘが得られます。接着した細胞からトランスフェクション培地を吸引し、同量の温かい培養培地と交換します。このステップ中にセルが剥がれないように注意してください。

次に、必要なだけ細胞をインキュベートします。必要に応じて、48時間ごとに培地を交換し、トランスフェクションされたDNAまたはRNAが効果がピークに達したときに治療が終了するように治療を適用する計画を立てます。エフェクターで細胞を処理する場合は、PMAを含まない無血清培地とベータメルカプトエタノールを含まない培地を使用してください。

血清なしで細胞を24時間以上インキュベートしないように注意してください。このプロトコルを使用してトランスフェクションを行い、IRNA細胞形態を持つTHP 1マクロファージを評価しました。フローサイトメトリー測定による。

細胞内のアポトーシスおよび壊死の速度は、トランスフェクション培養と対照培養の両方で低かった。しかし、慎重にカウントした結果、トランスフェクションされたサンプルでは、アポトーシスとネクローシスの両方がわずかに高いことが明らかになりました。これは、トランスフェクトされたTHP 1マクロファージがUNTトランスフェクトされた細胞よりもプレートから分離しにくいためである可能性があります。

全体として、トランスフェクション率はフローサイトメトリーで分析した90%を超えていました。蛍光S-I-R-N-Aを用いたトランスフェクション効率も蛍光顕微鏡で確認しました。トランスフェクションの機能性は、IL 10 RB発現の遺伝的ノックダウンによって示されました。

短い干渉RNAを使用 一度習得すると、トランスフェクションは適切に実行されれば1時間から1時間半で実行できます。この手順を試みる際には、培地がパフォーマンスにかなりの影響を与えることを覚えておくことが重要です。これは、テキストプロトコルで概説されています。