Name: ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶ、NucleoFector技術を用いたヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション法。90%以上の転染効率と高い細胞生存率を維持し、遺伝子ノックダウンや発現解析を可能にする。

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THP-1マクロファージの1。前分化<ol><li> CO 2中10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）および1％（v / v）ペニシリン/ストレプトマイシン/ L-グルタミン（PSG）を補充したRPMI-1640培地中でTHP-1細胞を培養（5％ 37℃）のインキュベーター。 </li><li>トランスフェクションの前に、細胞を分割し、以前のように新鮮なRPMI培地に移す。 24時間細胞を培養。 </li><li>シード1.0〜1.5×10 75 cm 2の組織培養フラスコ中に7細胞または2.5×10 7 RPMI-1640培地中の150-cm 2の組織培養フラスコへの細胞および10％（v / v）FCS、1％（容量を追加/ 48時間v）のPSG、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、1％（v / v）の非必須アミノ酸、10ng / mlのPMA、および50μMのβ-メルカプトエタノール。 </li></ol>ヌクレオの調製<ol><li> 37℃の水浴中のAccutase Iおよびすべてのメディアを置く。 </li><li>フラスコからの吸引し培地および6mlの（75 cm 2のフラスコ）または12ミリリットル（150 cm 2のフラスコ）と交換してくださいIのAccutaseと細胞の完全な剥離、37℃で30分間インキュベートする。細胞が丸い外観を有することを確認するために私のAccutase処理後の細胞の形態を観察します。いくつかの細胞は、まだ取り付けられるように表示される場合は、慎重にマイクロピペットでフラスコをすすぎやそっとの剥離を完了するために、それをタップします。これは、細胞の活力に悪影響を与えるように、セルスクレーパーを使用しないでください。 15mlチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>のAccutase I処理中に、次のメディアを準備します。 <ol><li>トランスフェクション培地を調製する：補足細胞培養培地を、1％（v / v）のPSGを、1％（v / v）の非必須アミノ酸、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、および5％（v / v）のヒト血清（プラスミドDNAの場合）、ヒト血清（siRNAの場合）または20％（v / v）の; 2つの12ウェルプレートに1つの6ウェルプレートまたは4ミリリットル/サンプルのいずれかのため3ミリリットル/試料の最終容量を準備する。 </li><li>培養培地を準備し補足培養培地を、1％（v / v）のPSGを、1％（v / v）の非必須アミノ酸の、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、および5％（v / v）のhu男性（siRNAのための）血清または20％（プラスミド用）（v / v）のヒト血清、2.5 ngの/ mlのPMA、および50μMβ-メルカプトエタノール; 2つの12ウェルプレートに1つの6ウェルプレートまたは4ミリリットル/サンプルのいずれかのため3ミリリットル/試料の最終容量を準備する。 </li></ol></li><li>室温で300×gで5分間遠心し、細胞懸濁液。 </li><li> 37℃に予め温めRPMI培地1ml中を吸引のAccutase I再懸濁細胞;細胞数を決定するために、細胞を計数。 注：高速自動細胞計数手順が使用される場合、2.4およびステップ2.5を省略してもよいし、細胞を剥離がのAccutase Iへの長期暴露が回避されることを条件直後にカウントすることができる。 </li><li>各トランスフェクションサンプルについて2.0〜2.5×10 6個の細胞を含む遠心管に分注しを準備します。 </li></ol> THP-1マクロファージの3ヌクレオ<ol><li>室温で250×gで10分間遠心操作は、すべての分量。 </li><li>ヌクレアーゼフリーでプラスミドDNAまたはsiRNAを希釈水または適当な緩衝液。可能な限り小さくプラスミドDNAまたはsiRNAの必要量を保管してください。 </li><li>各トランスフェクションのためのsiRNA1μgのか、プラスミドDNAの0.5μgのいずれかで1ヌクレオキュベットを準備します。 </li><li>一度に一つのトランスフェクションを実行します。細胞アリコートからの上清を吸引し。 </li><li> DNA / siRNAおよびヌクレオフェクター溶液100μlの全容積を得たヌクレオフェクター溶液中でペレット化した細胞を再懸濁する。最小限に純粋なヌクレオ溶液への曝露時間を維持し、露光時間が15分を超えないことを保証する。 </li><li>穏やかなタッピングによるヌクレオキュベット中に再懸濁細胞とDNA / siRNAのミックス。 </li><li>ヌクレオ2bの装置におけるプログラムY-001を実行することによって細胞をトランスフェクトする。 </li><li>使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを用いて反応バイアルにトランスフェクトされた細胞を移す。 </li><li>すぐに準備されたトランスフェクション培地500μlを加える。 </li><li>繰り返しは、各トランスフェクションサンプルに対して3.4〜3.9を繰り返します。 </li></ol><ol><li>トランスフェクトされた細胞について6ウェルまたは12ウェルプレートのどちらかを準備します。ピペット12ウェルプレートの各ウェル（1ウェル/トランスフェクション）に6ウェルプレート（1ウェル/トランスフェクション）またはトランスフェクション培地1.75mlを各ウェルにトランスフェクション培地を2.5ml。 </li><li>マイクロピペットで十分に細胞懸濁液を混ぜる。 </li><li>準備されたウェル（12ウェルプレート中の6ウェルプレートまたは2におけるつのウェルのいずれか）にトランスフェクト細胞を移す。 </li><li>加湿インキュベーター（5％CO 2、37℃）で4時間培養する。 </li><li>微視的細胞の再付着を確認してください。 注：細胞の大部分が再び付着性であるべきである。時折、1時間までの潜伏期間を延長することは不十分な再付着の場合には接着細胞の数を増加させる。 </li><li>慎重にマイクロピペットでトランスフェクション培地を吸引し、培養培地の等量交換してください。一度に吸引するだけでなく。 </li> &lt;李&gt;は、プラスミドまたはsiRNA（24〜72時）の最大効果のために必要な時間のために細胞を培養する。潜伏期間が48時間を超えた場合、48時間後に培地を交換してください。 </li><li>エフェクターと追加の治療のために（ 例えば 、サイトカイン、アゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤）は、PMAなしの無血清培地とβ-メルカプトエタノールを使用しています。時間は、プラスミドまたはsiRNAの最大効果の経時エフェクタのインキュベーション期間の終わりとは、媒体に応じて、エフェクターの追加の変化を計画しています。 24時間よりも長い間、無血清の条件下で細胞を維持しないでください。 </li></ol>

<ol><li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li>
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<li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li>
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<li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li>
</ol>

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ここで概説したプロトコルは、通常、トランスフェクションがかなり困難であるTHP-1マクロファージをトランスフェクトする信頼性の高い効率的な方法を提示します。トランスフェクションは、細胞の生命力の有意な減少なしにsiRNAの90％を超えるトランスフェクション効率を達成することができる。プラスミドについて効率は、そのサイズが少ないためであり得るが、70％程度のトランスフェクション効率は、通常、達成することができる。 siRNA媒介ノックダウンの効率は適用されたsiRNAに応じて百分の80から90まで到達することができます。このプロトコルの主な利点は、細胞分化を妨害しないことである。トランスフェクション後、細胞は、依然として12分化剤PMA（1Bと図4に図1A）に正常に応答。これはまた、トランスフェクションA後の培養のために選択された媒体に強く依存するが、加えて、そのようなIL10またはLPS /IFNγなどのサイトカインの刺激による細胞分極は、12影響を受けません図4に示す。■。 特定の要件にプロトコルを適合させるために修飾することができるプロシージャ内のいくつかのオプションがあります。 図4に示すように細胞をトランスフェクションした後、選択培地に応じて、同じIL10刺激に異なって反応する。これは培地組成が細胞挙動に強い影響を持っていることを示している。媒体によって課される効果は、さまざまな実験的な刺激のために異なるかもしれないので、それは最適な媒体が変更される可能性があることが可能であり、したがって、独立して、異なる実験のために培地の適合性を検証する必要がある。しかしながら、THP-1細胞の培養に使用されるデフォルトの媒体であるRPMI-1640培地は、細胞活力の有意な損失が観察されたように、トランスフェクション後の培養には不向きであることが証明された。さらに、プロトコルはまた、前のPMA誘導性分化せずにTHP-1単球に適用することができ、これを明らかに手順の間の細胞剥離の必要性を除去するが、残りのすべての手順を調整する必要はありません。必要に応じて、THP-1単球を、その後分化させることができる。 プロトコルの最も重要な要素は、まず、剥離および第二に、トランスフェクションのために必要な時間である。剥離が高い細胞生存率を維持するために、できるだけ穏やか行わなければならない。そこで私たちは、私のAccutaseオーバーな​​ど、トリプシン処理として非常に攻撃的な方法によって、比較的温和な酵素脱離することをお勧めします。そのようなリドカインまたはスクレーピングによる治療などのさらなる剥離法は、むしろ有害であることが判明したため、使用しないでください。のAccutase I治療の30分すべての細胞を剥離するのに十分であるべきではない場合に正しく、これは通常、誤って格納されている、または期限切れのAccutase I溶液またはあまりにも多くの凍結融解サイクルの指標である。私たちは、-20°でのAccutase私の小さなアリコートを格納することにより、良好な結果を得たCは、凍結融解サイクルの回数を減少させる。しかし不十分な剥離新鮮なのAccutaseでのAccutase私を交換するか、1時間までのインキュベーション時間を増やすのいずれかがある場合もございます。加えて、フラスコまたはプレートを穏やかにタッピングやリンスを脱離を支援することができます。トランスフェクションのための必要な時間に関する純粋なヌクレオ溶液への細胞の曝露時間は、できるだけ短くする必要があり、したがって細胞の生存に大きな影響を持っている。これを達成する最良の方法は、時間並行して（ステップ2.10から2.15）ではなく、複数のトランスフェクションでのそれぞれのトランスフェクションを行うことである。 ノックダウン効率が低い場合、これは通常、低いトランスフェクション効率によるものではないが、これは容易にフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡使用して検証し、蛍光標識siRNAまたはGFPをコードするプラスミドを標識することができる。大部分の原因は、非効率的なsiRNA又はプラスミドDNAである。これらの状況下では、（2-3μgのまで）siRNAの量を増加させるために考慮されるべきであるか（1-2μgのまで）プラスミドDNAまたは利用可能な場合は、別のsiRNAまたは発現ベクターを使用します。代替的に、満足な結果は、同じターゲットに対して向け複数の異なるsiRNAのプールを使用することによって達成され得る。さらに、経時変化実験は、正確には、通常、トランスフェクション後24〜72時間後に達した最大効果の期間を決定するために必要とされる場合があります。 別にトランスフェクションからのエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞のトランスフェクションのための更なる十分に確立された技術がある。頻繁に適用されるシステムは、貨物核酸と複合体を形成した後、細胞内への輸送を容易にすることができる化学的トランスフェクション剤である。最も一般的に使用される試薬は、異なる脂質種に基づいているか、カチオン性ポリマー3の数から選択することができる。両方が多様な選択に近づくために市販されている。これらのトランスフェクション試薬は、それらが通常であるという利点を提供使いやすく、多くの時間を必要としないため、剥離の必要性を取り除くだけでなく、接着細胞を扱う。残念ながら、マクロファージは、それらがインビトロで有意に増殖し、外来DNAの細胞質ゾル13-15に対して向けられた防御機構を持たないように、これらの方法によってトランスフェクトすることがかなり困難である。したがって、化学的トランスフェクションアプローチは、しばしば、細胞生存率の著しい減少をもたらす。しかしながら、図2に示すようにそこに成功マクロファージへのsiRNAを転送することができ、化学的トランスフェクション剤があるが、フローサイトメトリー（ 図2A）および蛍光顕微鏡（ 図2B）の分析は、それらが細胞内のsiRNAの同一の均一な分布を達成することができない示すようヌクレオにより得られた。実際には、フローサイトメトリーデータは、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団がNucleofecti後の細胞と同様の蛍光を有する集団まず、起こることを示しているオンが検出され、第二に、より強い蛍光を持つ人口があります。明確な確認がまだ必要であるが、私たちは、第一集団は、蛍光顕微鏡で第二集団は、おそらく非常に明るい凝集体を持つ細胞に相当する細胞質ゾル内の蛍光siRNAの均一な分布を示し、これらの細胞と同一であると仮定します。 図2Aに示すフローサイトメトリーのデータは、代替リポフェクション法よりも細胞あたりの少ないsiRNA中のヌクレオ結果。しかし、図3のデータは、ヌクレオとして援用するsiRNAであっても、比較的少量既に標的遺伝子の80〜90％のノックダウンのために十分であることを示している。したがって、化学的トランスフェクション後の第二の集団として援用siRNAの追加の量は非常に可能性が余剰であり、従って、更なる増加ノックダウン効率よりも望ましくない副作用を引き起こす可能性が高くなる。それとは別にこれらのsiRNA分子は、機能または遊離siRNA分子よりも少なくとも効率が低い可能性があり、オフターゲット効果を引き起こす可能性があるため、細胞内凝集体の形成は、それ自体が既に望ましくない。さらに、これらの凝集物の真の性質はまだ明らかではない。それは、これらの明るいスポットがsiRNAが細胞によって内部が、その後エンドソームからの放出されたことを示すエンドソームに失敗し、siRNAは、閉じ込められたため、効果がないまま表現している可能性があります。あるいは、スポットは、細胞内で形成される凝集体である可能性があります。化学トランスフェクションの機能評価は、したがって、ノックダウン効率に決定的な文はまだ二つの異なる集団の存在が、これはすべての結果は両集団の平均を記載していることを意味する、既に好ましくない、まだ作ることができない、保留されている、これはそのために対応していない集団のいずれか。そのためヌクレオは、優れたアプローチである。 <p clお尻は= &quot;jove_content&quot;&gt;それにもかかわらず、ここで説明トランスフェクション法には限界もあります。細胞は、ヌクレオ接着細胞が細胞に追加の応力係数を提示する、脱着する必要が懸濁液である必要があるからである。さらにプロトコル全体はかなり時間がかかります。 10実験当たり - トランスフェクションを同時に行うが、細胞の損傷を避けるために迅速に実行する必要はできないので、サンプル数は約8に制限されている。したがって、このプロトコルは、ハイスループットスクリーニングプロジェクトには適していない。高スループットのアプリケーションでは異なるヌクレオシステムが用意されています。まず、16ウェルストリップ·フォーマットを提供しています4D-ヌクレオシステムがあります。さらに大きなスループットを得るため、96ウェルシャトルシステムと384ウェルのHTヌクレオシステムがあります。しかし、これらの新しいシステムは、アルミニウム、したがって電気的条件、 すなわちプログラムやcomposの代わりに導電性ポリマー電極を用いて作業するヌクレオソリューションのitionは、それが私たちのプロトコルは、それらのシステムに転送することができるかどうかを決定する必要がある、それに応じて変更されています。 しかし、これらの制限にもかかわらず、ここに提示プロトコルは、すべての他の非ウイルス的アプローチよりも優れているTHP-1細胞の信頼性のある効果的なトランスフェクションを生じない。このプロトコルは、他のすべての面で差別化し、普通に偏光するため、可能な限りトランスフェクションの少ない副作用として表示THP-1細胞における遺伝子発現の変化の影響の調査を可能にします。

ヒト免疫系の細胞成分の中で、マクロファージは、先天性免疫応答のために非常に重要である。彼らのタスクは多様である。彼らは、組織恒常性において重要な役割を果たし、免疫応答1を調整し、調整するために多数のサイトカインを産生し、分泌し、病原体及び壊死物質の食作用に関与している。したがって、マクロファージは、一体的に、多くの生理学的プロセスおよび病態生理学的状態に関与している。それらの作業の多様性に、マクロファージは非常に異質で多面細胞型である。これは、異なる偏光によって達成される。外部刺激のマクロファージに応じて異なる表現型2内に開発することができます。免疫応答に対するマクロファージ &#39;変動性と影響、それらは非常に興味深い研究対象にする。彼らの複雑な代謝および調節機能を解明するために、in vitroモデル内の適切なマクロファージはREQです正しくマクロファージの不均一や変動性を反映しているuired。 細胞遺伝子の発現を変更するために、プラスミドDNAベクターまたは小さな干渉RNA（siRNA）を用いた細胞のトランスフェクションは、遺伝子調節、遺伝子機能の両方を調査するための細胞生物学で広く使用される強力なツールとなっている。現在、真核細胞のトランスフェクションのための利用可能なさまざまなツールの大規模な選択があります。これらのツールは、（核酸と複合体を形成することができるポリマーまたは脂質に依存している）ウイルスベクター（例えば、遺伝子銃など）機械的方法、化学的ア ​​プローチの適用、およびセル3のエレクトロポレーションが含まれる。これらのアプローチの全ては、それぞれの長所と短所があり、特定の細胞型およびアプリケーションのためにこの広い配列から最適なを選択することが困難で時間のかかるプロセスであることができる。 マクロファージは、ほぼすべての十分に確立されたtransfeをトランスフェクションが困難であることが知られてctionアプローチは大幅にマクロファージ&#39;の生存率を低下させるか、その行動を妨害する、 すなわち分化及び特定の偏光における。したがって、ここではDNA量の減少を必要とする最適化されたエレクトロポレーションアプローチを表し、エレクトロポレーション、ヌクレオベース技術を用いてヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクトするための効率的な、非ウイルス性プロトコルを提示する。クレオは、単球やマクロファージなどの感受性細胞に非常に適している。このプロトコルは、以前に公開されたバージョン4,5を最適化したものです。 要するに、ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）は、従来siRNAまたはプラスミドDNAでのトランスフェクションに未熟マクロファージへの48時間のヒトTHP-1単球を区別するために使用される。トランスフェクションのために未分化マクロファージのAccutase I処理により酵素的に切り離されている。トランスフェクションは、細胞のエレクトロポレーションのためのヌクレオ2bの装置を用いて行われる。トランスフェクションの後、異なる必要に応じてentiationは、別の24〜48時間継続される。最後に、成熟したトランスフェクトされたマクロファージは、機能的研究のための化合物の異なる種類と共にインキュベートする。 このアプローチは、ヒトTHP-1単球およびマクロファージのような細胞株のトランスフェクションを可能にし、正常に過去6-10に適用されている。ほとんどの化学的トランスフェクションアプローチとは対照的に、未熟マクロファージを使用して私たちの修正されたヌクレオ手順は、ウイルスベクターを使用するか、または未知の副作用がさらに担体化合物を添加する必要なしに、損なわれていない細胞の生存率と組み合わせた高トランスフェクション効率をもたらす。また、マクロファージは、このように、トランスフェクション11以下のスムーズな機能の調査を可能にするそれらの完全な差別化のための可能性だけでなく、偏光を保持します。 さらに、ヌクレオ後に適用細胞培地を強くトランに続く機能的研究に影響を与えsfection;特に、偏光のためのマクロファージの能力が適用培地に依存して影響を受ける可能性がある。ここで、細胞培養培地の4つの異なるタイプが（IMDM、X-VIVO 20、LGM3およびマウスT細胞のNucleofector培地）THP-1マクロファージを用いたインターロイキン（IL）10を用いて不活性化する条件下で試験した、私たちはIL10に対する細胞の応答性があることが観察さマウスT細胞のNucleofector媒体は、上述した他の培地と比較して使用される場合、最も強い。これらの結果は、これらが大幅に実験結果を改善することができるように、すべての細胞培養条件の適切な最適化が成功したトランスフェクションundの後続の機能的研究のために必須であることを示している。 マクロファージは、さまざまなヒト疾患に関与しているように、多くの研究が、マクロファージの行動だけでなく、マクロファージによって制御マクロファージまたは順番に影響を与える規制的なメカニズムの解明に焦点を当てています。したがって、このプロトコルは、で関連性がある多くの異なった研究分野。

<table><tbody><tr><td>Accutase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸、非必須</td><td>PAA</td><td>M11-003</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管 (15 ml)</td><td>TPP</td><td>TPP91015</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS 金)</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>ヒト単球ヌクレオフェクター キット</td><td>ロンザ</td><td>VPA-1007</td><td>ヌクレオフェクター溶液、キュベット、パスツールが含まれています</td></tr><tr><td>血栓からヒト血清</td>をピペットで切る <td>ロンザ</td><td>C11-020</td><td></td></tr><tr><td>イソブの修飾ダルベッコ培地 (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-グルタミン</td><td>ロンザ</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>リンパ球増殖培地 3 (LGM3)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3211</td><td></td></tr><tr><td>マウス T 細胞 ヌクレオフェクター培地</td><td>ロンザ</td><td>VZB-1001</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオフェクター 2b</td><td>ロンザ</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン / ストレプトマイシン / L-グルタミン (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685</td><td></td></tr><tr><td>ロズウェルパーク記念研究所 1640 Medium (RPMI 1640)</td><td>PAA</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>siRNA / プラスミド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 ヒト白血病単球</td><td>CLS</td><td>300356</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ (75 cm&sup2;; 150 cm&sup2;)</td><td>TPP</td><td>TPP90076/TPP90151</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート (6 ウェル; 12 ウェル)</td><td>TPP</td><td>TPP92406/TPP92012</td><td></td></tr><tr><td>チューブ (1.5 ml)</td><td>StarLab</td><td>S 1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>水 (ヌクレアーゼフリー) または適切な siRNA/プラスミドバッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20 とゲンタマイシン</td><td>ロンザ</td><td>BE04-448Q</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

ヌクレオによるヒトthp-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

マクロファージは、先天性免疫応答のキープレーヤーとして、組織の恒常性やさまざまな病状を扱う研究の焦点である。 siRNAおよびプラスミドDNAを用いたトランスフェクションは、それらの機能を研究するための効果的なツールですが、マクロファージのトランスフェクションは、些細な問題ではありません。真核細胞のトランスフェクションのための多くの異なったアプローチが利用可能であるが、わずか数は、マクロファージの信頼性と効率的なトランスフェクションが、減少した細胞の活力と頻繁に観察され、分化や偏光のために減少した能力のような深刻な改変された細胞の挙動を可能にする。従って、トランスフェクションプロトコールは、このように正常な細胞挙動の文脈におけるsiRNAの効果またはプラスミドの調査を可能にする重大な副作用を引き起こすことなく、マクロファージへのsiRNAおよびプラスミドDNAを伝達することが可能であることが要求される。ここに提示されたプロトコルは、確実かつ効率的にヒトTHP-1マクロファージおよびカをトランスフェクトするための方法を提供高い細胞活力、高いトランスフェクション効率、および細胞の挙動に最小限の影響でnocytes。このアプローチは、ヌクレオに基づいており、プロトコルは、トランスフェクション後、細胞活性化のための最大能力を維持するために最適化されている。プロトコルは、接着性剥離後の細​​胞ならびに懸濁液中の細胞のために適切であり、小型の媒体にサンプル番号のために使用することができる。このように、提示された方法は、マクロファージ分化と偏光の間に遺伝子調節の効果を調査するのに便利です。別に代替化学的方法と比較してこのプロトコルに従ってトランスフェクションしたマクロファージを特徴付ける結果を提示から、細胞の挙動上のトランスフェクション後の細胞培養培地の選択の影響も議論されている。提示されたデータは、さまざまな実験的な設定のための選択を検証することの重要性を示している。

siRNAを用いたTHP-1マクロファージのトランスフェクションのために、このプロトコルを使用して、私たちは通常、細胞の活力を大幅に削減することなく、90％以上のトランスフェクション率を達成。 図1は、非トランスフェクトに対するsiRNAを蛍光標識して、トランスフェクション後の細胞の状態の24時間を特徴付ける代表的なデータを示しているクレオ試薬およびパルスまたはsiRNAで処理したが、トランスフェクトサンプルとして培養培地のすべての変更を受け取っていなかったコントロール、。 図1Aに細胞形態は、フローサイトメトリー測定により示されている。顕微鏡画像を図1（b）に示す1Cおよび1Dは 、アポトーシス（コントロール：1.5％;ヌクレオ：5.4％）のための低金利表す図 。：;：影響を受けた細胞の活力を示すと壊死（3.2％対照ヌクレオ2.0％）。トランスフェクトされたTHP-1マクロファージがもっとあるので壊死とアポトーシスは、トランスフェクションサンプルに対してわずかに高い着脱が増加中の細胞の損傷の確率こうして、非トランスフェクト細胞よりも取り外すのは困難。最後に、トランスフェクション効率は、 図1Eに示されている。全体のトランスフェクトされた集団は対照に対してシフトされるように、これは全ての細胞が蛍光顕微鏡像（ 図2B）によって確認されたトランスフェクトされることを示している。フローサイトメトリーデータと同様に蛍光顕微鏡画像の両方は、全ての細胞が一貫してセル間だけでなく、細胞内でのsiRNAの均一な分布をトランスフェクトすることを示している。これは、比較図2Aおよび2Bのための脂質ベースのアプローチを用いて化学トランスフェクション剤のためのそれぞれのフローサイトメトリーデータ及び蛍光顕微鏡画像を示す、多くの化学的トランスフェクション試薬とは対照的である。これらの図は、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団を検出することができることを示している。最初の人口はFolloのトランスフェクションされた細胞に似ているウイングヌクレオ。それらは、低い全体的な蛍光および細胞内のsiRNAの均一な分布によって特徴付けられる。第二の集団は、siRNAの非常に明るい細胞内凝集体に由来する、より強い蛍光でマークされています。 図2Cにおける微分干渉コントラストで示すように、細胞の形態は、両方のトランスフェクションアプローチの影響を受けません。効果的に同様の結果をプラスミドDNAの収量を用いたトランスフェクションは、例についてRobenek ら （2009）9または謝を参照してくださいら （2006）7。 トランスフェクション後の細胞培養培地の選択は、非常に関連性がある。したがって、異なる細胞培養培地は、比較して試験した。選択されたメディアは、すべてのTHP-1細胞の培養に適しており、ポストヌクレオ栽培に適用媒体としてロンザの推奨に従って選択した。 図3は、siRNAのmediatを表すedはIL10RB（インターロイキン10受容体β鎖）のmRNAに対するsiRNAを使用して、効率をノックダウン。試験したすべてのメディアのIL10RBの発現は、対照レベル（ 図3）の10〜20％に減少した。しかし、トランスフェクトされた細胞は、偏光に対するそれらの潜在的な培養培地に応じて異なる。非特異的コントロールsiRNAまたはIL10RB特異的siRNAのいずれかでトランスフェクトしたTHP-1マクロファージは、トランスフェクション後、異なる媒体で栽培し、IL10で処理した。続いて、mRNAレベルでのIL10誘導遺伝子SOCS3（3サイトカインシグナル伝達の抑制因子）の発現レベルをRT-qPCRにより測定した。培養培地との違いは、SOCS3 mRNA発現の誘導の程度に関して発生する（ 図4）、テストされたメディアのマウスT細胞のNucleofector媒体のそれぞれについて、帰納、LGM3、X-VIVO 20とIMDMであった19.5 [17.7から21.5 ]、11.5 [8.5から15.7]、8.0 [4.6から14.2]と7.2 [5.6から9.5]は、それぞれ、倍。ザ·マウスT細胞のNucleofector媒体のreforeアプリケーションが不可欠です。 IL10治療が観察した後に加えて、SOCS3発現に対するIL10RBのノックダウンの効果の違いは、SOCS3 mRNAの発現レベルは、9.5 [8.8から10.3】マウスT細胞のNucleofector媒体に折り、2.1 [1.1から4.1]倍に減少したLGM3で、4.8 [3.2から7.2、X-VIVO 20および3.3 [2.7から3.9]中折りIMDM中で折る。これらの値は、それぞれ49％、18％、60％、45％、異なる媒体におけるSOCS3の発現の減少に相当する。 IL10RB siRNAのトランスフェクション後のIL-10誘導性のSOCS3発現の減少は、トランスフェクションによるIL10RBが正常にダウンレギュレーションを確認します。 <img alt="図1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300"> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージの図1。キャラ。光学顕微鏡によって明らかにし、フローサイトメトリーは、トランスフェクトしていない共同の分析として細胞の特徴的状態が影響を受けない提示されたプロトコールに従ってトランスフェクションしたTHP-1マクロファージに対するntrol細胞。 THP-1マクロファージは、48時間10ng / mlのPMAで分化し、蛍光標識（アレクサ488）、非特異的対照siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後のいずれかの生細胞の画像は、（B）撮影された、または細胞がIのAccutase処理によって剥離し、フローサイトメトリー（A）により分析した。アポトーシスおよび壊死染色、アネキシンV-フィコエリトリン（PE）（C）および7 -アミノアクチノマイシン（7-AAD）（D）を用いて行った。トランスフェクション効率（E）は、siRNAと取り付けられた蛍光標識を用いたフローサイトメトリーによって決定した。トランスフェクトした細胞（黒色）の蛍光信号は、制御信号（灰色）に対して示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width='"4インチ"' src="/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" ftp_upload> リポフェクション対ヌクレオ後のsiRNAの細胞内分布の図2の比較。THP-1細胞は、このプロトコルに従って48時間分化し、その後ヌクレオによって、またはリポフェクションのいずれかによってトランスフェクトした。提示リポフェクション結果は4のsiRNAと試薬の仕込み比で、製造業者の推奨に従ってXtremegene siRNAのキットを用いて得られた：1。トランスフェクション細胞から24時間後のいずれか、フローサイトメトリー解析のためのAccutase私で剥離または生細胞を用いて顕微鏡的に評価した。集団内の（A）トランスフェクション効率および細胞当たりのsiRNAの分布は、siRNAと取り付けられた蛍光ラベルを使用してフローサイトメトリーによって決定した、siRNAでトランスフェクトすることなく、コントロールは灰色で表示され、siRNAをトランスフェクト試料は、黒で示されている。 （B）蛍光顕微鏡siRNAの（アレクサフルオロ488）蛍光標識の細胞内分布を示す画像。スケールバーは40μmでを表します。 （C）蛍光画像に応じた微分干渉コントラスト像;スケールバーは40μmでを表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500"> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージにおけるIL10RBの図3 siRNA媒介ノックダウン。THP-1マクロファージを概説したプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をプロトコールセクションで説明したように補充し、LGM3（C）、及びX-VIVO 20（D）は、4つの異なる培養培地、すなわちマウスT細胞ヌクレオ培地（A）、IMDM（B）中で培養した。 C言語のエルどちらか非特異的対照siRNA（Ctrlキー）またはIL10RB特異的siRNA（IL10RB）でトランスフェクトした。パルス制御、 すなわち 、次のサンプルが含まれていた追加の対照として。 siRNAは（パルス）の欠如、及び媒体制御でトランスフェクションを受けた細胞、 すなわち 。培地の変更のみを受信し、それ以外は未処理のままの細胞。 24時間のトランスフェクション後に細胞をさらに24時間50ng / mlのIL10を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートした。 IL10RB発現をRT-qPCRにより測定した;図は、3つの独立した実験の平均値は、エラーバーは平均の標準誤差を表す示す。 * はp &lt;0.05; ** はp &lt;0.01; *** はp &lt;0.001対Ctrlキー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width='"500"'> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージにおけるIL10RBのノックダウン後にSOCS3の図4 IL10依存性調節。THP-1マクロファージは記載されているプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション細胞は、4つの異なる培養培地マウスT細胞ヌクレオ培地（A）、IMDM（B）で培養した後のプロトコールセクションで説明したように、LGM3（C）及びX-VIVO 20（D）を補充。細胞は、いずれの非特異的対照siRNA（Ctrlキー）またはIL10RB特異的siRNA（IL10RB）でトランスフェクトした。追加の対照として、以下のサンプルが含まれていた： すなわちパルス制御、新羅（パルス）の欠如、及び媒体制御でトランスフェクションを受けた、すなわち細胞を、。培地の変更のみを受信し、それ以外は未処理のままの細胞。 24時間のトランスフェクション後に細胞をさらに24時間50ng / mlのIL10を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートした。 SOCS3のexpressionをRT-qPCRにより測定した;図は、3つの独立した実験の平均値は、エラーバーは平均の標準誤差を表す示す。 *、＃ はp &lt;0.05; **、## はp &lt;0.01; ***、### Ctrlキー対と対のp &lt;0.001はCtrl + IL-10であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

この手順の全体的な目標は、高い細胞生存率と細胞活性化のないヒトTHP 1マクロファージを確実にトランスフェクションすることです。これは、最初にTHP 1単球を48時間事前に分化させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、時期尚早のTP 1マクロファージを切り離すことです。3番目のステップは、lonzaの核因子技術を使用して、細胞にIRNAまたはプラスミドDNAをトランスフェクションすることです。最後のステップは、細胞を再播種し、さらに分化することです。最終的に、遺伝子のノックダウンまたは過剰発現の成功は、定量的リアルタイムPCR、ウェスタンブロットバックなどを通じて示すことができます。この技術の主な利点は、リポフェクションなどの他のトランスフェクションアプローチと比較した場合、高いトランスフェクション効率と高い細胞生存率を達成できること、およびマイクロファージの機能と挙動を変化させないことです。残念ながら、この技術は、このプロトコルでは一度に強力なトランスフェクションを実行することができないため、高スプットアプリケーションには適していません。トランスフェクションの24時間前に、RPMI 1640でTHP 1細胞を10%FCSおよび1%ペン連鎖球菌Lグルタミンで培養し、細胞を分割して新鮮な培地を提供しました。翌日。75平方センチメートルの組織フラスコに1000万から1500万個の細胞を播種し、補充したRPMI培地に次の添加物、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸ナトリウム、1ミリリットルあたり10ナノグラム、PMA、および50マイクロモルベータメルカプトエタノールを48時間後に播種することにより、細胞を事前に分化させ、培地を吸引し、6ミリリットルのアキュテインと交換します。1つは細胞を分離するために摂氏37度に温めました。インキュベーション中に30分間インキュベートします。細胞の核後愛情ケアのために十分なトランスフェクション培地と培養培地を準備します。30分後、セルが分離し、周りを見回していることを確認します。一部の細胞がまだ付着している場合は、マイクロピペットでフラスコを静かにポンピングするか、単純な攪拌を使用してそれらを取り外してください。スクレーパーは使用しないでください。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、300Gsおよび室温で5分間遠心分離し、吸引により上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁する。1ミリリットルのRPMIで、中温を摂氏37度に温め、細胞を数え、即時トランスフェクションのために2〜250万個の細胞を含むマイクロリストチューブアリコートを作成します。このプロトコルの迅速な実行は不可欠です。細胞死の損失を避けるために、すべての材料を事前に準備しておくようにしてください 最初の遠心分離機、すべてのトランスフェクションアリコートを250GSで10分間、室温でスピンダウンしている間、すべてのヌクレオエフェクター獣医にプラスミドDNAの半分マイクログラムまたはSI RNAの半分のマイクログラムをロードします 高濃度の希釈を使用して、獣医の最小限のボリュームを占めるようにします。次に、細胞の1つだけから上清を吸引します aliquots resus。細胞を核因子溶液中に100マイクロリットルに懸濁します。細胞を溶液に15分以上さらさないでください。細胞をQ vetに移し、優しくたたいて混ぜます。次に、プログラムY 0 0 1を使用して、モデル2のB核因子に細胞をトランスフェクションします。使い捨てピペットを使用して、エレクトロポレーションした細胞を反応バイアルに移し、すぐに事前に警告したトランスフェクション培地を半ミリリットル細胞に加えます。次に、細胞の各アリコートでプロセスを1つずつ繰り返し、すべての細胞がトランスフェクションされるまで繰り返します。核の愛情注入が完了したら、細胞の各トランスフェクションを2.5ミリリットルの温かいトランスフェクション培地を含む6ウェルプレートのウェルに移します。マイクロピペットで各ウェルをよく混ぜます。ロードしたすべてのプレートを4時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞の状態を確認します。4時間後、必要に応じてほとんどの細胞をプレートに接着する必要があります。高々。さらに1時間のインキュベーションにより、一度に1つずつうまく機能する十分なサヘが得られます。接着した細胞からトランスフェクション培地を吸引し、同量の温かい培養培地と交換します。このステップ中にセルが剥がれないように注意してください。次に、必要なだけ細胞をインキュベートします。必要に応じて、48時間ごとに培地を交換し、トランスフェクションされたDNAまたはRNAが効果がピークに達したときに治療が終了するように治療を適用する計画を立てます。エフェクターで細胞を処理する場合は、PMAを含まない無血清培地とベータメルカプトエタノールを含まない培地を使用してください。血清なしで細胞を24時間以上インキュベートしないように注意してください。このプロトコルを使用してトランスフェクションを行い、IRNA細胞形態を持つTHP 1マクロファージを評価しました。フローサイトメトリー測定による。細胞内のアポトーシスおよび壊死の速度は、トランスフェクション培養と対照培養の両方で低かった。しかし、慎重にカウントした結果、トランスフェクションされたサンプルでは、アポトーシスとネクローシスの両方がわずかに高いことが明らかになりました。これは、トランスフェクトされたTHP 1マクロファージがUNTトランスフェクトされた細胞よりもプレートから分離しにくいためである可能性があります。全体として、トランスフェクション率はフローサイトメトリーで分析した90%を超えていました。蛍光S-I-R-N-Aを用いたトランスフェクション効率も蛍光顕微鏡で確認しました。トランスフェクションの機能性は、IL 10 RB発現の遺伝的ノックダウンによって示されました。短い干渉RNAを使用 一度習得すると、トランスフェクションは適切に実行されれば1時間から1時間半で実行できます。この手順を試みる際には、培地がパフォーマンスにかなりの影響を与えることを覚えておくことが重要です。これは、テキストプロトコルで概説されています。

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エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

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