アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ
November 30th, 2014
RNA-Seq解析は、非モデル生物の適応形質の分子基盤を特定するためにますます重要になってきています。ここでは、蚊の飼育からRNAシーケンシング、RNA-Seqデータのバイオインフォマティクス解析まで、休眠時と非休眠型のAedes albopictus蚊の間で差次的に発現する遺伝子を同定するためのプロトコルについて説明します。
次の実験の全体的な目標は、光周期的休眠応答の転写成分を特定することです。非モデル蚊の80年代の肘の絵では、これは最初に、異なる写真周期的処理を介して、休眠卵と非休眠卵の生物学的に複製されたサンプルを生成することによって達成されます。第2のステップとして、各リピートからRNAを抽出し、ハイスループットのRNAシーケンシングを行います。
次に、RNA配列を計算処理してcongに組み立て、アノテーションします。最終的には、休眠を誘発する光周期と非休眠を誘発する光周期に応答する遺伝子発現の変動は、リードMAPからRNAアセンブリに推測できます。この手法がマイクロレイ解析などの既存の方法よりも優れている主な点は、ゲノム配列やマイクロアレイなどの既存の遺伝資源が、休眠状態に応じた遺伝子発現の全球的な推定値を取得する必要がないことです。
この方法は、DPOの転写基盤や非モデル生物における他の主要な生態学的適応は何かなど、エコロジカルゲノミクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな個人は、十分な量の休眠卵子と非DPO卵子を取得するのが難しく、下流のバイオインフォマティクス分析が困難になる可能性があるため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ハイスループットDNAシーケンシング技術がより手頃な価格になり、手順を開始する前に、非モデル生物の全ゲノム発現プロファイルを取得するための扱いやすい方法を提供していることに気付いたときでした。
最適な休眠表現と約80%の相対湿度のために摂氏21度でプログラム可能な照明を備えた2つの写真期間キャビネットを設定します1つのキャビネットを16 8ライトダークサイクルで非休眠誘発写真期間用にプログラムし、もう1つは8つのライトダークサイクルを誘導するダイアポーズ用で、両方のキャビネットが写真期間間の概日時間を同期させます。次に、500ミリリットルの脱イオン水に適切な数の卵紙を沈め、1ミリリットルの挽いたドッグフードとブラインシュリンプフードスラリーを追加します。コンテナをメッシュで覆い、メッシュの周りに輪ゴムを配置して所定の位置に保持します。
その後、約24時間、16 8 light、dark、長い日の写真の期間のキャビネットで卵を孵化させます。翌日、グループごとに約30匹の孵化した幼虫を、90ミリリットルの脱イオン水で満たされた10 x 10 x 2センチメートルのペトリ皿に移します。48〜72時間ごとに、幼虫を清潔な皿に移し、移すたびに生鮮食品のスラリーを与えます。
約6日後、各写真期間の処理のために3〜4つの成虫ケージの底を湿らせた濾紙で裏打ちし、濾紙を十分な脱イオン水で湿らせて、溜まった水を避けながらケージ内の局所的な湿度を高めます。写真の期間、複製番号、ケージの開始日、および実験に関連するその他の情報を、ケージの側面に油性マーカーでメモします。その後、10日間隔日で、実験に適した成体ケージに水25ミリリットルあたり50ピュイ以下のきれいな水の小さなカップにpuyを移し、ケージの上部メッシュに有機レーズンを配置して、出現した成体に砂糖を提供するために、最初の血液食事の4〜5日後に卵子の位置を刺激し、 テクスチャーのある漂白されていないペーパータオルで裏打ちされた暗い色の50ミリリットルのカップを脱イオン水で半分満たし、各ケージに1つのカップを入れて卵を集めて保管します。
各ケージの卵紙を新しい紙と交換し、最近取り外した紙をペトリ皿に入れ、卵の保管に混乱の影響を避けるために、8つの16の明るい暗い短い日の写真の期間キャビネットに保管します。収集から約48時間後、卵紙を屋外で乾燥させ、しなやかで手触りがわずかに湿っているようにしますが、紙が水で暗くなったり、孵化を刺激したりするほど濡れないようにします。休眠インシデントを測定するには、各卵紙に卵の数を記録します。
次に、個々の紙を約80ミリリットルの脱イオン水を含む90ミリリットルのペトリ皿に完全に浸します。彼らの孵化を刺激するために、約0.25ミリリットルの食品スラリーを追加し、次に24時間後に、ペトリ皿を黒い表面に移します。次に、の片側に光源を配置すると、幼虫は光から離れ、星の幼虫の最初の個体の明確な集計が可能になります。
ピペットを使用して、個数を数え直さないように、カウント後に各幼虫を取り出します。次に、卵紙を新しいペトリ皿に入れて赤く乾かします。1週間後に孵化したばかりの子ガメの2番目のバッチを数えた後、残りの孵化していない卵の紙を新しい90ミリリットルのペトリ皿に入れ、約80ミリリットルの新鮮な漂白液
を入れます。紙をドラフトの下に一晩置いてから、翌日、光学顕微鏡を使用して孵化していない卵の数を数えます。卵子が胚化されている場合、卵子はオフホワイトの色を呈し、目は背側で互いに対向する2つの小さな黒い点として表示されます。まず、RNA除染液でベンチを慎重に洗浄し、残留ヌクレアーゼを除去し、RNAの分解を回避します。
次に、ラクダの毛ブラシを使用して、発生時に発生中の胚を含む少なくとも400個の蚊の卵をブラッシングします。ガラスグラインダーへの興味のあるポイント。ドラフトに1ミリリットルのトリオールを加え、卵が完全に粉砕されるまで挽き、次にトリオールでRNA抽出を行い、続いて製造元の指示に従ってイソプロパノールを沈殿させます。
次に、製造元の指示に従って、50マイクロリットルの反応で30分間、最大10マイクログラムのRNAあたり最大1マイクロリットルのDNnsを使用します。次に、反応液を5マイクロリットルの懸濁DNA不活化試薬で室温で5分間インキュベートします。インキュベーション期間中に懸濁液を3回穏やかにボルテックスします。
次に、RNA抽出物を10, 000倍Gで1.5分間遠心分離し、上清を含むRNAであるEloquaをシーケンシング用の新鮮なチューブに入れます。最後に、リード、調製、アセンブル、アノテーションから差出せる発現解析まで得られた次世代シーケンシングデータの処理方法の詳細については、添付のテキストを参照してください。この最初の図では、2 つの代表的な RNA サンプルの蛍光測定により、約 2000 ヌクレオチドに 2 つのバンドが示されています。
昆虫の28 sリボソームRNAは、水素結合によって一緒に保持された2つのポリヌクレオチド鎖で構成されています。水素結合は、短時間の加熱または水素結合を切断する薬剤によって容易に破壊されます。得られた2つの成分は、第2のRNAサンプル中の18sリボソームRNAとほぼ同じサイズであり、この代表的な実験では高レベルの分解が観察できます。アルボピクタス蚊の代表的なグループの写真の定期的な処理は、短日飼育の蚊で高い休眠事故を引き起こし、長い日飼育の蚊で低い休眠事件をもたらしました。
反復間で多少のばらつきはありましたが、例えば、短い2日目のグループは、他の反復よりも散眠の発生率が低かった。デジタル的に正規化された読み取りのトリニティアセンブリは、平均円錐長1020 3.1と最大コンティ長20, 892の76、377のコンティをもたらしました。Conti の長さの分布は、短いコンティグに大きく偏っていることに注意してください。
これは、Denovoトランスクリプトームアセンブリの典型です。この最終的なグラフでは、卵子位置の11日後および21日後に休眠誘発条件下で飼育された胚の同様のワークフローからの差次的発現分析により、これら2つの期間の間に3,128の差次的に発現した遺伝子が明らかになりました。一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、組織生成神情報学分析から6〜8か月で完了することができます。
この手順を試行する際は、次のステップに進む前に、各ステップでの成功を確認する必要があることを覚えておくことが重要です。例えば、RNAの完全性をテストする前に、実験条件でDPAと非休眠卵子が生成されていることを確認してください。定量的R-T-P-C-Rまたは比較ゲノミクス解析などの他の方法を実施して、目的の遺伝子の組織または発生特異的な発現および/または分子進化のプロセスに関する追加の質問に答えることができます。
トリオールでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋、白衣、ヒュームフードの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この研究では、休眠状態と非休眠状態のアカアリモスキト蚊における発現差異のある遺伝子を同定するためのプロトコルを提示します。アプローチには、異なる光周期下での蚊の飼育、RNAの抽出、遺伝子発現の変動を分析するための高スループットのシーケンシングが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ゲノミクス
- 生態学
背景
- 休眠は多くの生物にとって重要な適応特性です。
- アカアリモスキトは生態学的に重要な影響を持つ非モデル生物です。
- RNA-Seqは、事前の遺伝的資源なしに遺伝子発現を研究するための強力なツールです。
- 環境刺激に対する遺伝子発現の理解は、生態学的および進化的研究に情報を提供します。
研究の目的
- 光周期休眠反応の転写構成要素を同定すること。
- 休眠状態と非休眠状態の間の遺伝子発現を比較すること。
- 非モデル生物における適応特性の理解を深めること。
使用された方法
- 休眠および非休眠卵の生物学的複製サンプルを生産しました。
- 各複製からRNAをシーケンシングのために抽出しました。
- 高スループットのRNAシーケンシングを実行しました。
- RNA配列の組み立てと注釈付けに計算処理を使用しました。
主要な結果
- 異なる光周期に対する遺伝子発現の変動が特定されました。
- この研究は、非モデル生物におけるRNA-Seqの有効性を示しました。
- 休眠の背後にある分子メカニズムについての洞察が得られました。
- 結果は、他の種における適応特性に関する将来の研究に情報を提供する可能性があります。
結論
- RNA-Seqは非モデル生物における遺伝子発現を研究するための価値ある方法です。
- この発見は、環境変化に関連する適応特性の理解に貢献します。
- このアプローチは、同様の生態学的課題に直面する他の種にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables target validation in non-model organisms by linking environmental cues to transcriptional responses, supporting mechanistic de-risking in early discovery. It provides a scalable approach for phenotypic screening of adaptive traits without requiring prior genomic resources, reducing dependency on model systems. The workflow supports predictive confidence in target identification by isolating photoperiod as an independent variable and measuring gene expression as a quantitative dependent variable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to environmental stimuli for target hypothesis testing.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying genes differentially expressed in diapause versus non-diapause states.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking photoperiodic treatment to measurable transcriptional outputs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems (diapause and non-diapause eggs) for downstream compound screening.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducible high-throughput sequencing.
- Scalability: Enables platform reuse across mosquito species and life history traits with modest protocol adjustments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase gene expression findings to phenotypic outcomes like developmental arrest and metabolic suppression.
- Mechanistic De-risking: Identifies transcriptional networks underlying diapause, informing biomarker selection for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for differential expression (e.g., 3,128 DEGs across timepoints).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly for targets involved in environmental sensing and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating photoperiod as an independent variable and measuring transcriptional changes as dependent variables.
- Screening: Enables assay readiness through standardized rearing, diapause induction, and RNA quality control steps.
- Analytics: Generates quantitative gene expression measurements (e.g., contig assembly, differential expression) that allow cross-condition comparison.
- Translational Research: Links transcriptional changes to phenotypic diapause outcomes, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable to other mosquitoes and ecological traits, promoting platform-level investment over single-use assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in environmental response pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through biologically replicated samples and standardized RNA extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening in non-model organisms without prior genome investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing transcriptional evidence for target advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito rearing, photoperiod control, and RNA handling under RNase-free conditions.
- Depends on access to Illumina sequencers and computational infrastructure for de novo transcriptome assembly and annotation.
- Necessitates cross-team standardization between entomology, molecular biology, and bioinformatics groups.
- Requires adaptation of diapause induction conditions (e.g., light:dark cycles, temperature) for different species or strains.
- Practical limitations include the time-intensive nature of diapause induction (6–8 months) and challenges in obtaining sufficient diapause egg yields.
