Name: アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学ぶRNA-seq解析プロトコルで、ヒトスジシマカの日長休眠における遺伝子発現変動を探索する。バイオインフォマティクス処理により、非モデル生物の適応特性の分子メカニズムを解明できる。

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この作業は、国立衛生研究所の助成金5R21AI081041-02とジョージタウン大学の支援を受けました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、Aのphotoperiodically誘起休眠による差次的に発現する遺伝子を発見するための方法を提示ヒトスジシマカ 。光周休眠応答に焦点を当てた人のため特に - プロトコルは、それが一意に初心者のユーザーがアクセス可能な分子生理学プログラムのすべての実験的な側面を作るために蚊の飼育とバイオインフォマティクス技術を組み合わせたことで重要である。飼育ミスを識別することがしばしば必要である - - 既存の方法は、我々の知る限り、飼育プロトコルのように、多くの詳細を提供しないでも、彼らは、下流の成功生物情報分析が可能になります飼育段階における実験計画上の洞察を提供していますか。ここで紹介する方法は、Aのために最適化されてきたヒトスジシマカ 、一般的に次の1研究室の世代から6週間かかる特に飼育方法、。しかし、将来のアプリケーションでは、この方法は控えめに適合させることができる光周休眠23を示す他の蚊種に調整。さらに、一般的な実験デザインやバイオインフォマティクスワークフローは他のpolyphenismsの研究にも適用可能である。 <...

次世代シーケンシング（NGS）技術の急速な進歩は、幅広い非モデル生物1-3における広範な遺伝的に複雑な生態学的適応の分子基盤を調査するエキサイティングな機会を提供しています。このアプローチは、特に興味深い、および/または十分に記述された生態学または進化の歴史を持つ生物、および農業害虫や病気媒介生物などの実用的な関心のある生物の集団および機能ゲノミクス研究の基礎を確立するため、非常に強力です。このように、NGS技術は生態学の分野に急速な進歩をもたらしており、急速な現代の気候変動に対する生物学的応答のメカニズムの理解4、侵入種の拡散5、宿主と病原体の相互作用6,7などの問題に対処する可能性を秘めています。
生態学および進化生物学における基本的な問題と応用的な問題に取り組むためのNGS技術の並外れた可能性は、これらのアプローチがほとんどの研究室で実現可能な中程度のコストで任意の生物に適用できるという事実によるものです。さらに、これらのアプローチは、マイクロアレイチップや完全なゲノム配列などの先験的な遺伝資源を必要とせずに、ゲノムワイドな情報を提供します。しかし、NGS実験の生産性を最大限に高めるためには、RNAサンプリングの発生タイミングや組織特異性などの問題を含む実験デザインを慎重に検討する必要があります。さらに、これらの実験によって生成される大量のデータ(多くの場合、数億のDNA配列リード)を分析するために必要な技術的スキルは、特に課題であり、NGSアプローチの広範な実装を制限してきました。
侵略的で医学的に重要な蚊であるネッタイシマカの休眠の転写基盤に関する最近のRNA-Seq研究は、NGS技術を非モデル生物の複雑な生態学的適応の分子基盤を研究するためにNGS技術を成功裏に適用するために採用できるいくつかの実験プロトコルの有用な例を提供します8–10。A. albopictusは、アジア原産の非常に侵入性の高い種ですが、最近、北アメリカ、南アメリカ、ヨーロッパ、アフリカに侵入しました11,12。多くの温帯昆虫と同様に、A. albopictusの温帯個体群は、光周期性休眠と呼ばれる一種の休眠状態に入ることにより、冬を生き延びます。A. albopictusでは、蛹と成体の雌が短い(秋の)日の長さにさらされると、胚学的発達が完了する休眠卵が産生されますが、卵の絨毛膜内のファレート幼虫は発育停止に入り、卵は孵化刺激に抵抗性になります15–17。休眠卵子は、非休眠卵子よりも乾燥抵抗性5,18であり、総脂質19を多く含んでいます。したがって、A. albopictusの光周期的休眠は、温暖な環境で冬の過酷な条件を生き抜くために不可欠な、母性制御された適応的な表現型の可塑性です。広範囲の昆虫20,21における光周期的休眠の生態学的意義はよく理解されているにもかかわらず、この重要な適応の分子基盤は、どの昆虫でも十分に特徴付けられていない22。A. albopictusのように、ファレート幼虫の段階で胚の休眠を経験する生物では、母親が受信した光周期シグナルがどのようにして子孫に伝わり、胚発生の過程で持続してファラテの幼虫の段階で停止を引き起こすのかを理解することは、特に切実な課題です。
このプロトコルは、A. albopictusの光周期的休眠の転写成分を解明するために行われるNGS実験(トランスクリプトームシーケンシング)のための蚊の飼育、実験デザイン、バイオインフォマティクス分析について説明しています。このプロトコルは、A. albopictusの休眠の追加研究に使用でき、卵の休眠23を受ける他のネッタイシマカなどの他の密接に関連する種の休眠を調査するために適応させることができ、また、より一般的には、NGSアプローチを使用して任意の昆虫の複雑な適応の転写基盤を研究することに関連しています。

<table><tbody><tr><td>インキュベーター - Model 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>制御された環境室</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Thermax Scientific Productsがカスタム仕様で建設したウォークイン制御環境室です。インキュベーターのより大きな代替品。http://thermmax.com/</td></tr> <tr><td>クール蛍光灯</td><td>フィリップス</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>ペトリ皿 100 mm x 20 mm</td><td>フィッシャー</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>濾紙 20.5 cm</td><td>フィッシャー</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9.5 L バケツ</td><td>プラスチック</td><td>Bway 製品</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>ユーティリティファブリック-蚊帳ホワイト</td>ジョ<td>アン</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>整形外科用ストッキングアル</td><td>バヘルス</td><td>23650-040</td><td>製品番号081420</td></tr><tr><td>有機レーズン</td><td>ニューマンズオウン</td><td>UPC:884284040255</td><td></td></tr><tr><td>産卵カップ(茶色)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-007-52</td><td>この製品は、実際には琥珀色の125mlボトルで、上部を切り落としました。</td></tr><tr><td>再生ペーパータオル</td><td>第7世代</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>モジュラーメイツ スクエアタッパーウェアセット</td><td>タッパーウェア</td><td></td><td></td>セット</tr><tr><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items ガラスグラインダー</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>7727-2</td><td>これらのテンブルックティッシュグラインダーは、卵を割ってRNAをTRI試薬に放出します。</td></tr><tr><td>TRI試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>組織50-100mgあたり1mlのTRI試薬を塗布します。コーション &#8212;この試薬は有毒です。</td></tr><tr><td>TURBO DNAフリー</td><td>アンビオン/ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM1907</td><td>このキットは、従来のDNase処理とそれに続くフェノール/クロロホルムクリーンアップよりも大きな収率を生み出し、より簡単に使用できます。</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>ベンチの表面やRNAサンプルと接触する可能性のある機器にたっぷりと塗布してください。この溶液はわずかにアルカリ性/腐食性で、刺激を引き起こす可能性があり、飲み込むと有害です。</td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>1つのチップに最大12個のRNAサンプルを保存できます。</td></tr><tr><td>Hemotekメンブレン</td><td>フィーダーHemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>このシステムは、同時に使用できる5つの供給ステーションを提供します。PS5パワーユニットと電源コードが含まれています。5つのFUIフィーダー+ミールリザーバーとOリング。プラスチックプラグ、Hemotekコラーゲン供給膜;温度設定ツール;およびプラグ抽出ツール。同社の郵送先住所は、Hemotek Ltdです。ユニット5ユニオンコート;アラン・ラムズボトム・ウェイ;グレートハーウッド;英国ランカシャー;BB6 7FD;電話番号: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>デジタル温度計とプローブ</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>MicroT3温度計とKFUプローブ。これは、各FUI供給ユニットの温度を設定するために使用されます。</td></tr><tr><td>鶏の全血、クエン酸ナトリウム</td><td>Pel-Freezの生物製剤</td><td>33130-1</td>と非滅菌 <td>血液の500 mlを凍結し、-80 &#176で20 mlのアリコートに保存した。Cは最長1年間。血液を室温で少なくとも1時間解凍してから使用してください。</td></tr></tbody></table>

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のrna-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

光周期的な休眠は、一連の生理学的変化、特に発達停止と代謝の低下を通じて、個人が厳しい季節環境から逃れることを可能にする重要な適応です。RNA-Seqによる全球的な遺伝子発現プロファイリングは、光周期性休眠の転写メカニズムに関する重要な洞察を提供することができます。アジアのトラ蚊、ネッタイシマカは、飼育の容易さ、容易に誘発される休眠、および利用可能なゲノムリソースにより、休眠の転写基盤を研究するための優れた生物です。この原稿は、A. albopictusの休眠誘発性転写の違いを特定するための一般的な実験ワークフローを示しています。飼育技術、休眠および非休眠の発達を誘発するために必要な条件、集団の休眠率を推定する方法、および蚊のRNA抽出と完全性評価が文書化されています。IlluminaシーケンサーからのRNA-Seqデータを処理するワークフローは、差次的に発現する遺伝子のリストで最高潮に達します。代表的な結果は、このプロトコルを使用して、光周期的な違いによりA. albopictusの転写レベルで異なる制御が行われている遺伝子を効果的に同定できることを示しています。このワークフローは、わずかな調整で、他の蚊の休眠やその他の重要な生活史形質の転写基質の研究に容易に適応させることができます。

つの代表RNAサンプルの蛍光測定は、約2000塩基（ 図1A、B）2つのバンドを示した。昆虫28SリボソームRNAを容易に短時間加熱または水素結合35を破壊する薬剤によって破壊された水素結合によって一緒に保持された2つのポリヌクレオチド鎖から構成されている。得られた2つの成分​​は、18SリボソームRNAとほぼ同じ大きさである。第二のRNAサンプルは、分解（ 図1B）の高いレベルを示した。 Aの代表的なグループの光周治療レプリケート間のいくつかのバリエーション（ 表2）があったものの、 ヒトスジシマカ蚊は、長日飼育蚊における短日飼育蚊の高い休眠発生率、及び低休眠発生率をもたらした。例えば、SD2、残りの反復（ - 97.67パーセント87.18パーセント）よりも低い（80％）休眠発生率を示している複製する。この複製はまた、最小のSAMPLを持っていたメールサイズ、それは正確な結果を得るために脇休眠測定用卵（&gt; 15...

RNA-Seq解析は、非モデル生物の適応形質の分子基盤を特定するためにますます重要になってきています。ここでは、蚊の飼育からRNAシーケンシング、RNA-Seqデータのバイオインフォマティクス解析まで、休眠時と非休眠型のAedes albopictus蚊の間で差次的に発現する遺伝子を同定するためのプロトコルについて説明します。

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

次の実験の全体的な目標は、光周期的休眠応答の転写成分を特定することです。非モデル蚊の80年代の肘の絵では、これは最初に、異なる写真周期的処理を介して、休眠卵と非休眠卵の生物学的に複製されたサンプルを生成することによって達成されます。第2のステップとして、各リピートからRNAを抽出し、ハイスループットのRNAシーケンシングを行います。次に、RNA配列を計算処理してcongに組み立て、アノテーションします。最終的には、休眠を誘発する光周期と非休眠を誘発する光周期に応答する遺伝子発現の変動は、リードMAPからRNAアセンブリに推測できます。この手法がマイクロレイ解析などの既存の方法よりも優れている主な点は、ゲノム配列やマイクロアレイなどの既存の遺伝資源が、休眠状態に応じた遺伝子発現の全球的な推定値を取得する必要がないことです。この方法は、DPOの転写基盤や非モデル生物における他の主要な生態学的適応は何かなど、エコロジカルゲノミクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな個人は、十分な量の休眠卵子と非DPO卵子を取得するのが難しく、下流のバイオインフォマティクス分析が困難になる可能性があるため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ハイスループットDNAシーケンシング技術がより手頃な価格になり、手順を開始する前に、非モデル生物の全ゲノム発現プロファイルを取得するための扱いやすい方法を提供していることに気付いたときでした。最適な休眠表現と約80%の相対湿度のために摂氏21度でプログラム可能な照明を備えた2つの写真期間キャビネットを設定します1つのキャビネットを16 8ライトダークサイクルで非休眠誘発写真期間用にプログラムし、もう1つは8つのライトダークサイクルを誘導するダイアポーズ用で、両方のキャビネットが写真期間間の概日時間を同期させます。次に、500ミリリットルの脱イオン水に適切な数の卵紙を沈め、1ミリリットルの挽いたドッグフードとブラインシュリンプフードスラリーを追加します。コンテナをメッシュで覆い、メッシュの周りに輪ゴムを配置して所定の位置に保持します。その後、約24時間、16 8 light、dark、長い日の写真の期間のキャビネットで卵を孵化させます。翌日、グループごとに約30匹の孵化した幼虫を、90ミリリットルの脱イオン水で満たされた10 x 10 x 2センチメートルのペトリ皿に移します。48〜72時間ごとに、幼虫を清潔な皿に移し、移すたびに生鮮食品のスラリーを与えます。約6日後、各写真期間の処理のために3〜4つの成虫ケージの底を湿らせた濾紙で裏打ちし、濾紙を十分な脱イオン水で湿らせて、溜まった水を避けながらケージ内の局所的な湿度を高めます。写真の期間、複製番号、ケージの開始日、および実験に関連するその他の情報を、ケージの側面に油性マーカーでメモします。その後、10日間隔日で、実験に適した成体ケージに水25ミリリットルあたり50ピュイ以下のきれいな水の小さなカップにpuyを移し、ケージの上部メッシュに有機レーズンを配置して、出現した成体に砂糖を提供するために、最初の血液食事の4〜5日後に卵子の位置を刺激し、 テクスチャーのある漂白されていないペーパータオルで裏打ちされた暗い色の50ミリリットルのカップを脱イオン水で半分満たし、各ケージに1つのカップを入れて卵を集めて保管します。各ケージの卵紙を新しい紙と交換し、最近取り外した紙をペトリ皿に入れ、卵の保管に混乱の影響を避けるために、8つの16の明るい暗い短い日の写真の期間キャビネットに保管します。収集から約48時間後、卵紙を屋外で乾燥させ、しなやかで手触りがわずかに湿っているようにしますが、紙が水で暗くなったり、孵化を刺激したりするほど濡れないようにします。休眠インシデントを測定するには、各卵紙に卵の数を記録します。次に、個々の紙を約80ミリリットルの脱イオン水を含む90ミリリットルのペトリ皿に完全に浸します。彼らの孵化を刺激するために、約0.25ミリリットルの食品スラリーを追加し、次に24時間後に、ペトリ皿を黒い表面に移します。次に、の片側に光源を配置すると、幼虫は光から離れ、星の幼虫の最初の個体の明確な集計が可能になります。ピペットを使用して、個数を数え直さないように、カウント後に各幼虫を取り出します。次に、卵紙を新しいペトリ皿に入れて赤く乾かします。1週間後に孵化したばかりの子ガメの2番目のバッチを数えた後、残りの孵化していない卵の紙を新しい90ミリリットルのペトリ皿に入れ、約80ミリリットルの新鮮な漂白液を入れます。紙をドラフトの下に一晩置いてから、翌日、光学顕微鏡を使用して孵化していない卵の数を数えます。卵子が胚化されている場合、卵子はオフホワイトの色を呈し、目は背側で互いに対向する2つの小さな黒い点として表示されます。まず、RNA除染液でベンチを慎重に洗浄し、残留ヌクレアーゼを除去し、RNAの分解を回避します。次に、ラクダの毛ブラシを使用して、発生時に発生中の胚を含む少なくとも400個の蚊の卵をブラッシングします。ガラスグラインダーへの興味のあるポイント。ドラフトに1ミリリットルのトリオールを加え、卵が完全に粉砕されるまで挽き、次にトリオールでRNA抽出を行い、続いて製造元の指示に従ってイソプロパノールを沈殿させます。次に、製造元の指示に従って、50マイクロリットルの反応で30分間、最大10マイクログラムのRNAあたり最大1マイクロリットルのDNnsを使用します。次に、反応液を5マイクロリットルの懸濁DNA不活化試薬で室温で5分間インキュベートします。インキュベーション期間中に懸濁液を3回穏やかにボルテックスします。次に、RNA抽出物を10, 000倍Gで1.5分間遠心分離し、上清を含むRNAであるEloquaをシーケンシング用の新鮮なチューブに入れます。最後に、リード、調製、アセンブル、アノテーションから差出せる発現解析まで得られた次世代シーケンシングデータの処理方法の詳細については、添付のテキストを参照してください。この最初の図では、2 つの代表的な RNA サンプルの蛍光測定により、約 2000 ヌクレオチドに 2 つのバンドが示されています。昆虫の28 sリボソームRNAは、水素結合によって一緒に保持された2つのポリヌクレオチド鎖で構成されています。水素結合は、短時間の加熱または水素結合を切断する薬剤によって容易に破壊されます。得られた2つの成分は、第2のRNAサンプル中の18sリボソームRNAとほぼ同じサイズであり、この代表的な実験では高レベルの分解が観察できます。アルボピクタス蚊の代表的なグループの写真の定期的な処理は、短日飼育の蚊で高い休眠事故を引き起こし、長い日飼育の蚊で低い休眠事件をもたらしました。反復間で多少のばらつきはありましたが、例えば、短い2日目のグループは、他の反復よりも散眠の発生率が低かった。デジタル的に正規化された読み取りのトリニティアセンブリは、平均円錐長1020 3.1と最大コンティ長20, 892の76、377のコンティをもたらしました。Conti の長さの分布は、短いコンティグに大きく偏っていることに注意してください。これは、Denovoトランスクリプトームアセンブリの典型です。この最終的なグラフでは、卵子位置の11日後および21日後に休眠誘発条件下で飼育された胚の同様のワークフローからの差次的発現分析により、これら2つの期間の間に3,128の差次的に発現した遺伝子が明らかになりました。一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、組織生成神情報学分析から6〜8か月で完了することができます。この手順を試行する際は、次のステップに進む前に、各ステップでの成功を確認する必要があることを覚えておくことが重要です。例えば、RNAの完全性をテストする前に、実験条件でDPAと非休眠卵子が生成されていることを確認してください。定量的R-T-P-C-Rまたは比較ゲノミクス解析などの他の方法を実施して、目的の遺伝子の組織または発生特異的な発現および/または分子進化のプロセスに関する追加の質問に答えることができます。トリオールでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋、白衣、ヒュームフードの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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