三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

この手順の全体的な目標は、3次元環境内の細胞の移動挙動を解析することです。まず、目的の細胞を3次元のコラーゲン格子に埋め込みます。次に、タイムラプスビデオ顕微鏡で細胞の動きを記録し、次に、コンピューター支援セルトラッキングによって移動パラメータを描写し、スプレッドシートソフトウェアアプリケーションを使用してセルトラッキングデータを分析します。

最終的に、この方法は、がんの文脈でがん細胞または白血球、リンパ球、幹細胞などの正常細胞の遊走を調節する因子およびシグナル伝達経路を調査するために使用できます。したがって、細胞遊走、調節因子、および関連するシグナル交差経路に関する知識は、腫瘍細胞の遊走と転移性拡散を損なうための新しい治療戦略の開発に役立つ可能性があります。移行室では、溶融パラフィンワックスの2層を迅速にブラシで塗り、ワセリン混合物をスライドガラスの中央に、カバーを追加し、パラフィンワックス、ワセリン混合物の2層でシールし、スリップします。

次に、マイグレーションチャンバーをラック内の直立位置にして、1.5ミリリットルの反応チューブに取り付けます。コラーゲン懸濁液に20マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。50マイクロリットルの10 XMEMと27マイクロリットルの7.5%重炭酸ナトリウム溶液をよく混ぜ合わせます。

次に、375マイクロリットルの液体コラーゲン懸濁液を加え、十分に混合して、pH7.5を示す薄紫色にします。次に、100マイクロリットルの最終的なコラーゲン懸濁液を50マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、コラーゲン繊維の開始に注意しながら完全に混合します。重合。pH 7.5で、混合物を移行チャンバーに移します。

マイグレーションチャンバーを軽くたたいて、コラーゲン懸濁細胞ミックスをマイグレーションチェーンチャンバーの底に均等に分配します。マイグレーションチャンバーをラックに直立させて置き、30分間インキュベートします。重合したコラーゲン格子がわずかに濁っているが、それでも薄紫色の場合は、移動チャンバーを適切な培地で満たし、移動チャンバーをパラフィンワックスで密封します。

ワセリンミックス。顕微鏡ステージヒーターを37°Cに調整し、移行チャンバーの10倍倍で調整します。視野内で約50セル以上にピントを合わせます。

マルチカメラビデオ監視ソフトウェアアプリケーションを使用して、タイムラプスモードで細胞移動を記録します。セルマイグレーションムービーを適切なファイル形式で保存します。細胞移行動画ファイルを、細胞の種類や実験条件などの裏付け情報を含むデータベースにリンクします。

次に、適切な細胞追跡ソフトウェアアプリケーションを使用して細胞遊走ムービーを解析し、偏りのない解析を行います。細胞が全体として遊走活性であるかどうかを知らずに、解析用の細胞をランダムに選択し、典型的な細胞遊走実験で細胞あたり約60のXY座標を決定します。細胞分裂の場合は、追跡する娘細胞をランダムに1つ選択します。

スプレッドシートプログラムなどの適切なソフトウェアアプリケーションを使用して細胞追跡データを解析し、細胞が移動した合計距離を計算します。数値ピクセル値の合計に補正係数を掛けて、ミクロンに変換します。25 ミクロンのしきい値より小さく移行したセルを移動しないセルとして定義し、数値をコンマで置き換えます。

次に、2つの時点間を移動した追跡された細胞集団の細胞の割合として、運動活動を計算します。また、アクティブな移動の時間を、観測期間の時間枠に対するセルの移動の合計時間の割合として計算します。次に、マンホイットニーのU検定を使用して統計的有意性を計算し、細胞移動データを表示します。

一般的なセル追跡データファイルは、各列が 1 つの追跡対象セルを表すテーブルに似ています。行には、セルの移動に関する位置情報が含まれています。時間の経過とともに、細胞の運動動作は、分析された細胞集団の平均自発運動活性と活発な運動の時間によって特徴付けることができます。

この例では、4つの独立した実験から得られた120個の細胞の遊走活動を示しています。各ひし形は、セルが少なくとも 2 つの時点間を移動したことを示します。灰色の線は、移動セルと非移動セルを区別します。

機関車の活動のパラメータは、XYダイアグラムまたはボックスプロットとして表示できます。分析された細胞集団のダイナミクスを視覚化するために、ヒストグラムは同じ細胞の活性時間を効果的に示します。MDA HER2およびM-D-A-N-E-O乳がん細胞株の遊走挙動に関するこの解析は、両方の細胞株が同様の自発運動活性を示したことを示しています。

パラメータのアクティブ時間は、M-D-A-N-O乳がん細胞と比較して、自発的に動くM-D-A-H-E-R細胞の数がわずかに多いことを明らかにしました。1ミリリットルあたり100ナノグラムのEGFによる刺激により、移動細胞の数と活発な移動時間によって測定されるMDA HER2の遊走活性が有意に増加しました。興味深いことに、M-D-A-N-E-O細胞はEGF刺激に応答して移動し、ホスホリパーゼc γ ONE阻害剤uc 3 1 22によるシフト時間活性パターン処理を示し、M-D-E-E R 2およびMDANの両方の自発的およびEGF誘発的遊走の両方を減少させた。

EEOセル。時間活性パラメータの分析により、2マイクロモルのU 7 3 1 2 2 MDAN EEO細胞の処理により、主に動かない細胞の量の増加に起因する自発運動活性が著しく減少することが明らかになりました。リンパ球と白血球の三次元コラーゲンへの移動をマスターすると、腫瘍細胞が一晩で記録される約2時間で記録できます。