Name: マウス涙腺を操作する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学ぶマウス涙腺の発生解析法。胚16日齢の摘出とエクスビボ培養を用いて、シグナル伝達経路の操作とタンパク質発現変化を免疫蛍光顕微鏡で観察する技術を習得できます。

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著者は、UCSFリソース割当プログラムにより提供される資金調達を承認したいと思います。

全ての動物の作品は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨事項に厳密に従って下で行った。プロトコルは、カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）、サンフランシスコで承認された。 1.マウス胚性涙腺（LG）：収穫と顕微解剖<ol><li> 、科学研究倫理委員会のための制度の動物によって承認された手順に従うことで、適切な胚の日に収穫の胚に頸椎脱臼による確認に続いて、上昇したCO 2吸入を妊娠CD-1（またはトランスジェニック）メスを安楽死させる時限。膣栓発見E0の日を指定します。 注：涙腺（地方自治体）は以降のE14シングル蕾の段階から収穫することができる。しかし、E16（5から10つぼみ）の胚は、ex vivo培養のための最も一貫性のある結果を与える。 </li><li> Vを殺菌70％エタノールを用いてマウスの側entral。皮膚をつまんで、滅菌外科用ハサミで正中線で切開する。腹腔を露出させ、皮膚および腹膜を通って切断。冷PBS中の各子宮角と場所の上部にある子宮間膜に沿って切断することにより2子宮角を取り外し（リン酸緩衝生理食塩水）または100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを添加したDMEM F12培地。 </li><li>鉗子を使用すると（＃5）、羊膜嚢から胚を削除し、冷PBSを含む第二の滅菌ペトリ皿に置く。目や頭部領域に手を触れないように注意してください。 </li><li>透視ベースと解剖顕微鏡上に胚を置きます。 1.7 -胚が&lt;E17の場合は、 手順1.5を実行します。胚は&gt; E17であれば、これらの手順を参考に、必須ではないが、そのため1.8のステップに進むことができる。 </li><li>ちょうど下顎骨下の胴体（ステップ1、 図2）を使うから頭を断つGA滅菌メス（＃10ブレード）。下顎骨は解剖板に今あるように頭を回転させます。 （ステップ2、1 番目のカット、 図2）の約1/4の脳の背側のを除去するために頭とメスを安定させるために鉗子を使用する-軟骨がE15の周りに硬く、一度これは特に重要です。 </li><li>メスでは両目の間の鼻を突き刺すことができるように頭を向けます。目が別々の半分（ステップ2、2 番目のカット、 図2）に今あるように、頭の中心を通ってカットを行います。 </li><li> 2＃5鉗子を使用して、頭の半分を取り、余分な組織を除去する（ステップ3、 図2参照）。 （目の低い後部の角にあります）、LGがこの除去過程で失われないように頭を向けるようにしてください。過剰脳、軟骨、および周囲や目の下、鼻組織を除去する。腺は、この時点でほとんど見えているので、眼が適切に過剰な組織除去tの後に配向されていることを確認O LGの場所を失うことを避ける。 </li><li>両方の鉗子で眼の後、底の隅から肌を注意深くをつかむ。慎重にLG電子が露出するようにピンセットで開いて引っ張って皮膚を取り除きます。 LG電子を可視化を支援する組織の上下に追加の照明を使用してください。 注：LGは、暗く、凝縮された間葉内のダクト上の芽としてその外観により区別、この時点で表示されるはずです。 </li><li>慎重に、LGまたはそれに関連するダクトをつかむないように注意しながら、離れて鉗子を用いて周囲の組織から（図と画像を参照）、LGおよび関連間充織を解剖し始める。腺は、周囲の組織から自由になったら、そっとLGダクトの基部に眼の周囲の上皮を把持することによって全体の腺を取り除く。凝縮された間葉への上皮陥入として観察することができる上皮を、周囲の間充織を維持するために注意してください。 注：TISSUのいくつかの追加の除去電子メール（任意の小さな骨片、筋肉、および結合組織）は、隣接する組織からのシグナリング/成長因子を回避する必要があるかもしれない。 </li><li>培養のため、収穫4から5腺およびプレート当たりに関連する間葉（自治体が解剖直後にめっきされる）; RT-PCR 6 RNA溶解緩衝液100μl当たり14腺の最小値を収集する。 </li></ol> 2. エクスビボ培養プレートを準備しますこの手順は、発展途上唾液腺7,8のために使用されるものに基づいています。 <ol><li>ガラス底の直径50mmのマイクロウェル皿7に50μg/ mlのアスコルビン酸および50μg/ mlのホロトランスフェリンとの培養培地（100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充）したDMEM F12200μlのを追加します。 注：我々は、以前にそれが胚性唾液腺に形態形成を最大化するために見られるような、DMEM F12を選択した。 </li><li> 13mmのPOLYCARBフロートメディアの上に0.1μmの細孔を有するonateメンブレンフィルター。 </li><li>オプションのステップ：（穏やかに混合するために、200μlのピペットを使用して、泡が現れた場合、1分間遠心分離）を3mg / mlの最終濃度となるようにDMEM / F12で1：3-Dラミニン1を希釈する。この15μlのを追加しフィルタリングする3次元ラミニンを希釈した。 注：この希釈は、上皮分岐を損なうことなく、その三次元状態でLGを維持するために最適であることが見出された。しかし、LGの培養に必須ではない。 </li><li>フィルター上またはラミニンに5 LG - 4を配置します。文化自治体ex vivoで 24 - 48時間（ 図3）、または定量PCRまたは免疫染色（ 図4）によるさらなる分析のために20分間、4％PFAで固定します。胚腺組織のqPCR分析のために、Rebustini らをご参照ください。2011年。ホフマンら、（2002）、スタインバーグE：胚腺組織の免疫蛍光分析のために、以下の引用を参照してください。Tら、（2005）。 </li></ol> 3.マウス生後および成体涙腺（LG）：解剖<ol><li>適切な動物倫理委員会の基準に従って出生後、マウスを安楽死させる。生後8日目の仔歳以下の場合は、滅菌したハサミで頭部を切断することによって安楽死させる。生後8日以上の場合は、70％エタノールで毛皮をスプレー。 </li><li> LG電子の位置を確認するには、マウスを上から照明で解剖顕微鏡の下に左右横横たわっていた。注：産後と大人のLGは、頸動脈、咬筋と真皮（ 図5を参照）に隣接している。 </li><li>小さな解剖ハサミを使用して、LGが配置されるべき場所から横方向に表皮に小さな切開を行います。 </li><li>鉗子を使用して、LGを露出するために、耳に向かって表皮を開く引っ張る。 </li><li>優しく周囲の組織からのLGを緩め鉗子を使用してください。 </li><li> LGは、周囲の組織から解放されると、慎重に、ダクトによってLGを削除どこダクトと眼の周囲の上皮（ 図1）を接続することによりグリップ。 </li><li> RT-PCRのためのRNA溶解緩衝液中で自治体を置き、または免疫染色のために20分間、4％PFAで固定します。 </li></ol>

<ol><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Current+allergy+and+asthma+reports%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).</li>
<li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).</li>
<li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes%3A+relevance+in+dry+eye+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li>
<li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li>
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<li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development%3A+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li>
<li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%22">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis</a>. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).</li>
<li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).</li>
<li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10%2FFGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11(2005).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

文化への汎用性とex vivoで 、LGを操作は、その開発を研究するための重要な利点を提供します。これは、研究者の仮説と、神経、内皮およびmesencyhmal細胞は器官を形成するように相互作用する方法を、上皮評価することができる多数の摂動をテストすることができる速度を含む。このモデルを利用する場合しかし、警告の数が存在する。まず、その分離によって腺は、それらが神経や血管9,10によって送出信号と連動して動作している場合、試験されるシグナル伝達経路に影響を与える可能性が、もはや末梢血管系または神経系に接続されていない。第二に、周囲の非LG組織はLG開発4を調節する因子を提供することができる。この他の非間葉組織成分は、培養の前に除去しなければならない回避する。第三に、現時点では、我々は完全なcytodifferentのために必要な条件を提供することができません完全に機能する組織内にiation。これはex vivoで培養されたすべての臓器の場合ですと原因、機能血管と神経および/ ​​または周囲の組織からの機械的な力の欠如など、複数の理由による可能性が高い。これ...

涙腺（LG）は、視力や健康、保守、および眼表面の細胞の保護のために重要なの水性涙液分泌を担当しています。眼の刺激、光感受性によって特徴づけられるとビジョン1を減少させ、水性欠乏ドライアイ病、：最も一般的な衰弱性眼疾患の一つでLGの機能不全をもたらす。眼表面上に5排泄ダクト預金涙 - 人間ではLGが3目の側端より上の軌道に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、単一の排泄ダクトを経由して、目に涙を浮かべて旅行する耳（眼窩）へ涙腺（LG）に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が複数の芽のラウンドとするために、ダクトの形成を受けている上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発分泌腺房とダクトの複雑な相互接続されたネットワーク（ 図1）2メートル。開発中は上皮は血管新生になるだけでなく、頻繁に翼口蓋神経節の副交感神経によって上頸神経節3から交感神経によってより少ない程度に神経支配。これらの細胞の種類すなわち神経細胞、上皮細胞、内皮細胞および間葉細胞のそれぞれとの間の相互作用は、成体組織の機能と維持に不可欠である。しかし、セル間タイプの通信は、これらのプロセスをガイドする方法と同様にLGの発達と再生を調整する基礎となる分子機構は依然として不明である。 胚のエクスビボで培養技術の出現は、複数の分岐臓器4の発達と再生経路の同定を可能にした。 ex vivoで培養する研究者を（私に臓器を操作する機能を提供しますリアルタイムでの臓器の発達および細胞 - 細胞相互作用を特徴付けるために、遺伝的または化学的）規定された条件下で同様に機械的、。マウスの眼窩LGがこの技術に非常に適していると最近の研究では、その開発2,5を規制するシグナル伝達系を定義しました。しかし、LG電子の開発と再生を支える分子手がかりを理解する必要にもかかわらず、それは現在、原因臓器を単離する技術的困難に思わ代役のまま。本稿では、分離して発生プログラムを定義するために、胚ネズミLG のex vivo文化を実行する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>HEPESなしのDMEM/F12</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>P0781</td> ウシ血清由来の<td>Sigma-Aldrich</td>アルブミン<td></td></tr><tr><td>溶液</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16% 溶液</td><td>15710</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 10x</td> <td>で 4% に希釈BP665-1</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td></tr>ック<tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 1x</td><td></td><td></td><td>10x ストックホ</td></tr><tr><td>ロ-トランスフェリンウシ</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp;水中のmg / mlストック溶液。シングルユースアリコートを-20°Cで凍結します。&deg;C. DMEM/F12培地に最終濃度50°Cまで添加します。&mu;g / mlです。</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸(ビタミンC)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp;水中のmg / mlストック溶液。シングルユースアリコートを-20°Cで凍結します。&deg;C. DMEM/F12培地に最終濃度50°Cまで添加します。&mu;g / mlです。</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm 組織培養処理済みディッシュ</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>非組織培養処理プレートも使用できます。</td></tr><tr><td>サブステージイルミネーター付き実体顕微鏡</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>透過光ベースを持つ任意の実体解剖顕微鏡を使用することができます。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡用サブステージイルミネーターベース</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン35&nbsp;mmティッシュカルチャー処理ディッシュ</td><td>353001</td><td>コーニング</td><td>非組織培養処理プレートも使用できます。</td></tr><tr><td>50mmコーティングされていないガラス底面ディッシュ</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>広視野蛍光顕微鏡</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>付属のデジタルカメラでGFP発現を低倍率でモニターするために、任意の蛍光顕微鏡(正立顕微鏡、倒立顕微鏡、立体解剖顕微鏡)を使用することができます。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>TCS SP5</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>詳細な細胞構造を見るためには、共焦点顕微鏡が必要です。どの共焦点顕微鏡でも使用できます。</td></tr><tr><td>SWISS マイクロファイン鉗子、#5 (11.2&nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>インテグラライフサイエンスコーポレーション</td><td>上皮から間葉を除去するには、細いチップが必要です。タングステン針も使用できます。</td></tr><tr><td>デュモン標準先端鉗子、#5 (11&nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td> (英語)<td>胚から腺を採取するのに最適です。</td></tr><tr><td>再利用可能なプラスチック外科用ナイフハンドル、スタイル番号3。</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml Stock Diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR)</td><td></td><td>マウスCharles River</td><td>Labs胚は14日目に採取されます(プラグ発見日を0日目と指定)。</td></tr><tr><td>Nucleoporeトラックエッチング親水性膜、0.1&nbsp;&mu;m孔径、13&nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>ジャクソン研究所</td><td>LGの位置を特定する方法を学ぶためのオプションのマウス。</td></tr></tbody></table>

マウス涙腺を操作する

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

涙腺（LG）は、角膜の構造と機能、視力に不可欠な透明な組織を維持するために必要な水性涙を分泌する。 5ダクト - 人間では、単一のLGは3を通して眼表面に涙を配信するそれぞれの目の横端上記の軌道上に存在します。マウスは、主要な眼の腺の3ペアを持って、そのほとんどが研究され、耳に眼窩外涙腺（LG）に位置し、前方および腹です。他の腺の器官と同様に、LG電子は、凝縮された間葉内の単一の上皮芽が分泌腺房とダクトの複雑な相互接続ネットワークを形成するために、つぼみとダクト形成の複数のラウンドを受けるものでは上皮の分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。この精巧なプロセスは、よくそのような膵臓および唾液腺などの多くの他の上皮の器官で文書化されています。しかし、LGはあまり検討されていると形態形成を制御するメカニズムは不完全に下です立っていた。我々は、このアンダー表現モデル系としては、見つけ解剖とLGを培養することに関連する困難の結果であることを疑う。したがって、ここでは解剖収穫胚および出生後のLGのための技術や組織のex vivo培養のための方法が記載されている。

LG電子は、上皮分岐形態形成のプロセスを経て開発しています。 E14、E15、E16、E17、およびP2で解剖胚自治体の明視野画像は、このイベントを説明する。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600"> 図1. LGは分枝形態形成上皮のプロセスを経て開発しています。新鮮にE14、E15、E16、E17およびP2で解剖胚自治体の明視野像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> サイズが上皮間葉が増加するにつれて減少する量のことに注意してください。...

涙腺（LG）は、ビジョンと眼の健康を維持するために必要な涙の水性成分を生成し、分岐器官である。ここでは、LG電子の開発に関与するシグナル伝達経路を解読するネズミLG郭清およびex vivo培養技術を説明しています。

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

次の実験の全体的な目標は、腺発達中のシグナル伝達イベントの操作と分析のために、ex vivoアプローチを使用して涙腺の発達を分析することです。これは、最初に16日目の胚の涙腺を解剖することによって達成されます。第2のステップとして、腺はフィルター上に置かれ、培養物、低分子阻害剤または涙腺の発達を変化させる成長因子を含む培地に浮遊します。24時間後、腺は固定され、目的の発生タンパク質の免疫染色が行われます。最終的に、ex vivo涙腺の発達中のタンパク質発現の変化は、免疫蛍光顕微鏡法で分析できます。この方法は、涙腺開発の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、涙腺を定義するシグナル伝達メカニズムとはどのようなものなのでしょうか?形態形成 涙腺は、初期の胚発生中に涙腺を認識するのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です それを見つけるための視覚的なガイダンスと練習が必要です。胚性マウスから涙腺を採取するには、70%エタノールを使用して、胚期の日、14〜16人の妊娠マウスの腹側を滅菌します。次に、皮膚をつまんで動物の正中線に沿って皮膚を切り取り、腹膜を露出させ、腹膜を切り抜いて腹腔と子宮内膜を露出させ、子宮内膜の両方の角を取り除き、冷たいPBSに入れます。次に、5番の鉗子を使用して、羊水嚢から胚を冷たいPBSを含む2番目の滅菌ペトリ皿に移します。下顎骨のすぐ下にある胴体から頭部を切断した後、下顎骨が解剖板上にくるように頭部を回転させます。次に、鉗子を使用して頭を安定させ、メスを使用して脳の背側の約4分の1を取り除き、メスが目の間の鼻を突き刺すことができるように頭を向け、次に頭の中心に切り込みを入れて目が別々の半分になるようにします。次に、上下の照明を使用して、目の後部下隅から皮膚をつかみ、鉗子で皮膚を慎重に引っ張って開き、涙腺を露出させます。涙腺と関連する間葉を周囲の組織から慎重に解剖し、涙腺またはそれに関連する管をつかまないように注意します。.次に、涙腺が周囲の組織から解放されたら、涙腺管の基部で目を囲む上皮をそっとつかみ、腺全体を取り除きます。上皮を囲むMeen chiは、上皮が陥入する凝縮組織として観察できます。次に、培養培地と目的の小分子阻害剤または成長因子を含むシャーレ内のフィルターあたり4〜5個の涙腺を培養し、出生後または成体のマウスから涙腺を採取するために24時間、まず眼領域に70%エタノールを噴霧します。次に、上からの照明で動物の側面を上にして、解剖顕微鏡の下に置きます。次に、小さな解剖ハサミを使用して、涙腺が位置するべき場所から表皮を横方向に切開します。次に、表皮を耳に向かって引っ張って開き、出生後および成体のマウスでは頸動脈、メイキングされた筋肉、および真皮に接している涙腺を露出させます鉗子で周囲の組織から涙腺をそっと緩め、次に涙腺が周囲の組織グリップから解放されると、 目を囲む管と上皮が接続し、腺を慎重に取り除きます。最後に、涙腺を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定してから、免疫染色を行います。目的の発生タンパク質の場合、涙腺は上皮分岐形態形成の過程を通じて発達します。これらの胚性涙腺の明視野画像は、胚期14日目、15日目、16日目、17日目、および出生後2日目に解剖されたものです。上皮のサイズが大きくなると、これらの画像に示すように間葉の量が減少することに注意してください。涙腺は、in vivo培養条件でin vivo培養と同様の方法で発達し、解剖したばかりの涙腺を固定して免疫蛍光分析を行うことができます。例えば、この画像では、上皮神経や血管の染色です。胚では、野生型CD1つの胚からの16の涙腺が出生後または成体のPACによって涙腺におけるGFPの発現を観察することができ、これらのトランスジェニック動物からの涙腺の迅速な同定および解剖を容易にする。この方法は、涙腺の発達に関する洞察を提供しますが、自己免疫疾患や放射線治療による涙腺機能障害などの他のシステムにも適用できます。このビデオを見た後、ex vivo培養分析のためにマウスの涙腺を見つけて分離する方法を十分に理解しているはずです。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、ウサギから上涙腺の眼瞼と眼窩の2つの部分を切除し、ドライアイ疾患のモデルを作成する外科的処置について説明しています。このウサギモデルは、眼表面の恒常性、病態生理学、眼科治療の研究に適しています。...

上涙腺の除去:ウサギモデルから上涙腺の眼瞼および眼窩部分を除去する外科的技術

このビデオでは、ウサギの涙液産生への影響を研究するために、ウサギモデルから大きな下涙腺を切除する外科的処置について説明します。...

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このビデオでは、上涙腺の眼窩葉にコンカナバリンAを注射することにより、ウサギモデルでドライアイ疾患を誘発する手順を説明しています。開発されたモデルは、ドライアイ疾患の治療のためのさまざまな薬剤の有効性を研究するのに役立ちます。...

上涙腺の眼窩葉への注射:ウサギモデルにおけるドライアイ疾患誘発技術

涙腺 (LG) は、α平滑筋アクチン (αSMA): 筋上皮細胞 (MECs) および周皮細胞を発現する2つの細胞型を有する。MECs は外胚葉の起源であり、多くの腺組織に見られる一方、周皮細胞は endodermal 起源の血管平滑筋細胞である。このプロトコルは、マウス LGs から MECs...

成人ネズミ涙腺および顎下腺からの筋上皮細胞の単離

この記事では、眼窩涙腺系のすべての部分にコンカナリンAを注入することによって、ウサギの急性または慢性ドライアイ病を誘発する方法の開発について説明します。この方法は、既に報告されているものよりも優れ、薬理剤の研究に適したドライアイの再現性、安定モデルを生成する。...

コンカナバリンによる涙腺への注射によって誘発される水性欠損性ドライアイ病のウサギモデル:薬物有効性研究への応用

すべての眼窩涙腺を外科的に除去することによってウサギの慢性ドライアイ病を誘発する新しいアプローチが提示される。この方法は、以前に報告されたものとは異なり、涙液生理学および病態生理学および眼科治療の研究に適した水性欠乏ドライアイの安定した、再現可能なモデルを生成する。...

ウサギにおける完全なダクリオアデネクトー切除術を用いた重症ドライアイモデルの確立

成体涙腺(LG)幹細胞の三次元無血清培養法は、LGオルガノイドの形成および腺房または腺管様細胞への分化の誘導のために十分に確立されている。...

涙腺幹細胞のための3次元、無血清培養システム

このプロトコルは、初代マウスおよびヒト組織に由来する涙腺オルガノイドを確立、維持、遺伝子改変、分化、機能的に特徴付け、および移植する方法を説明しています。...

マウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立、維持、分化、遺伝子操作、移植

ここでは、涙腺機能障害のラットモデルを確立し、水欠損ドライアイの研究の基礎を提供します。...

スコポラミンによる涙腺機能障害を有するラットドライアイモデル

ここでは、眼窩外および眼窩下涙腺を切除して水性欠損ドライアイのマウスモデルを確立し、水性欠損ドライアイの眼表面の変化を評価する方法を紹介します。...

水性欠乏性ドライアイのマウスモデルの構築

学ぶマウス涙腺の発生解析法。胚16日齢の摘出とエクスビボ培養を用いて、シグナル伝達経路の操作とタンパク質発現変化を免疫蛍光顕微鏡で観察する技術を習得できます。

マウス涙腺を操作する

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