単一平面照明モジュールと広視野顕微鏡用マイクロキャピラリーアプローチ

この手順の全体的な目標は、倒立顕微鏡用のライトシート励起モジュールを使用して単一平面照明顕微鏡を実行し、それを3次元細胞スフェロイドに適用することです。これは、まずピペットを使用して細胞スフェロイドをマイクロタイタープレートのウェルから第2のウェルに移し、洗浄後にインキュベートすることによって達成されます。次に、Sスフェロイドを長方形の毛細管に導入します。

2番目のステップは、ライトシート照明モジュールを倒立顕微鏡位置決めテーブルのベースプレートに取り付けることです。次に、ステロイドを含むキャピラリーを顕微鏡用の特別なサンプルホルダーに入れます。最後のステップは、ライトシートと顕微鏡の対物レンズの焦点面との間の検出経路のマッチングを設定することです。

最終的には、細胞スフェロイド内の焦点面を変化させることにより、薬物の取り込みやSスフェロイドの構造に関する単一画像またはZacksの情報を得るために、3次元蛍光測定を行うことができます。既存のライトシート顕微鏡に対するこの技術の主な利点は、既存の顕微鏡に適応できるモジュールで構成され、研究の自由度が高いため、コスト効率が高く、汎用性が高いことです。この手法の意味するところは、特に治療や診断に使用される薬物や薬剤の研究にまで及び、特にマイクロ流体システムの適応により、流動条件下での迅速なプロセスの研究が可能になります。

現在、この励起法を任意の検出技術と組み合わせることで、低光量での生細胞ステロイドに関する洞察を得ることができます。また、シプロフィッシュ、アルティラ胚、光学CLE組織サンプルなどの他の生体システムにも適用できます。まず、50マイクロリットルの加熱された1.5エアロスを培地で96ウェルプレートの各ウェルに加え、1〜2時間固化させます。

次いで、調製した96ウェルプレートグロスSの各ウェルに約150MCFの7つの乳癌細胞を5〜7日間、直径約200〜300マイクロメートルのインキュベーターで5〜7日間、二酸化炭素5%および摂氏37度で播種する。次に、細胞ステロイドをアントラサイクリン系抗生物質ドキソルビシン塩酸塩と、培養中の2マイクロモルから8マイクロモルの範囲の濃度で6時間インキュベートします。培地 インキュベーション後、顕微鏡検査の前に、細胞OIDを培養液、培地、またはアールバランス塩溶液で洗浄します。

倒立顕微鏡を使用して、単平面照明顕微鏡またはSPM励起モジュールを位置決めテーブルのベースプレートに取り付けます。顕微鏡には、10倍または20倍の拡大顕微鏡対物レンズと、顕微鏡の検出経路に適切なロングパスフィルターを装備してください。次に、統合カメラを顕微鏡の検出ポートに取り付けます。

レーザーまたは励起波長が470ナノメートルのレーザーダイオードの平行な照合ビームを使用し、スピンモジュールに印加します。次に、シリンドリカルレンズを90度回転させ、ライトシートを垂直位置に移して、ライトシートのビームウエストを軸方向に調整します。蛍光色素を含む液体を含むキャピラリーをサンプルホルダーに入れます。

キャピラリー付きのサンプルホルダーを顕微鏡の位置決めテーブルに取り付けます。キャピラリーの位置を中央に合わせ、ライトシートのビームウエストにピントが合うようにします。シリンドリカルレンズ自体の軸方向位置の変化により、ビームウエストを調整します。

調整後、レンズを戻してください。細胞ステロイドを別々に、または長方形のケイ酸ホウ酸ガラス毛細血管内にグループで配置し、内部断面が600×600マイクロメートル、壁の厚さが120マイクロメートルです。これを実現するには、親指と中指で空の毛細血管を直立させ、人差し指で上部の開口部を塞ぎます。

下部の開口部を周囲の液体の細胞スフェロイドに近づけ、ステロイドを入れた状態で上部開口部の液体から人差し指を放出します。毛細管の力ですぐに染み込んでしまいます。充填されたキャピラリー内のSスフェロイドの位置を重力で調整します。

あるいは、ピペッティングでステロイドをキャピラリーに塗布します。ピペットの先端の開口部が、一方ではS回転楕円体のサイズに対して十分な大きさであり、他方ではキャピラリーの内径よりも小さいか等しいサイズであることに注意してください。次に、Sスフェロイドを含むキャピラリーを顕微鏡検査の特別なサンプルホルダーに入れます。

キャピラリー付きのサンプルホルダーを顕微鏡の位置決めテーブルに取り付け、セルステロイドの位置を中央に合わせ、焦点が合うようにします。反射鏡とシリンドリカルレンズの位置を調整して、ライトシートと顕微鏡対物レンズの焦点面を検出経路に合わせます。毛細血管に子牛胎児血清またはFCSを30分間充填して、細胞ステロイドの内面ガラス表面への細胞接着を後からサポートします。

枯渇した毛細血管に残っているFCSコーティングを、セルステロイドをFCSコーティング毛細血管に導入した後、少なくとも12時間乾燥させます。前と同様に、毛細血管をインキュベーターにさらに2〜4時間放置して、ステロイドの細胞接着を引き起こします。次に、バブルトラップを含むマイクロ流体システムのflx部分を設定します。

ペリスタルティックポンプを使用して、蛍光色素の薬物または薬剤を含む培地でチューブのflxを満たします。最初に気泡のないキャピラリーを排出チューブに固定し、次にキャピラリーの反対側をドレンチューブに固定します。ウォーターバスの液体温度を希望の値に調整します。

次に、蠕動ポンプを希望のポンプ速度に調整します。ポンプで送られた液体を、データ取得と分析のためのオープンループセットアップでレシピエントに収集します。画像取得のレーザー出力と積分時間を設定します。

ZS スタックの増分を 5 マイクロメートルから 10 マイクロメートルの値に設定します。これは、3 次元データ解析に適しています。軽いシートの厚さが約10マイクロメートルであるので、細胞ステロイド内の焦点面の変化によって単一の画像またはZacksの測定を行うに進みます。以前に 8 マイクロモルのドキソルビシンと 6 時間インキュベートした mc 7 セル ステロイドの Zack スキャンが示されています。

画像は、ドキソルビシンの細胞への取り込みと分布、およびその分解に関する詳細な情報を提供します。ステロイド赤色蛍光ドキソルビシンの外側細胞層内の生成物は主に核に局在しますが、内側のsphe roid領域では、分解生成物によって提出された緑色蛍光が細胞膜で優勢になります。天然のmc sevenヒト乳がん細胞Sにおける化学療法薬ドキソルビシンの取り込みは、spmによって選択された単一細胞層について描かれています。

フローシステム内に2マイクロモルおよび培地を適用すると、ドキソルビシンとその分解生成物の赤色および緑色の蛍光が連続的に増加した フローシステム内の培養培地に2マイクロモルのドキソルビシンを適用すると、ドキソルビシンおよびその分解生成物の赤色および緑色の蛍光が連続的に増加した。一度習得すれば、ライトシート除去モジュールの取り付けから3Dサンプルの蛍光画像の記録まで、わずか数分で完了します。流量条件を測定する際には、サンプルがキャピラリーの内面に付着していることを確認し、気泡がサンプルに到達してキャピラリーからサンプルが剥がれないようにすることが最も重要です。

このビデオを見れば、さまざまな顕微鏡に適応できる汎用性の高いモジュールを使用したライトシート照明顕微鏡についてよく理解できるはずです。