Name: 商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: 学ぶ 高速蛍光イメージングによる生細胞膜上の脂質・タンパク質の拡散法。TIRF顕微鏡とガウスフィッティングで分子動態を解析し、膜ダイナミクスの理解に貢献する手法を習得できます。

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この作業は、NIH-P41 P41-RRO3155およびNIH P50-GM076516(EGへの助成金)、およびFondazione Monte dei Paschi di Siena(FBへの助成金)によって部分的にサポートされています。

1。システムのキャリブレーション<ol><li>点広がり関数（PSF）のキャリブレーション<ol><li>蒸留水90μlの中で30nmの蛍光ビーズ溶液10μl（約5μM）を希釈し、次いで20分間溶液を超音波処理する。四角（1センチ×1cm）にアガロースゲル（10％）と預金ゲルの上に溶液10μlの部分をカット。 2センチメートルペトリ皿の底ガラスのゲルの一部を覆す、ガラスのドロップを絞る。 </li><li>買収の設定をオンにし、ホルダーにサンプルを入れ、カメラの露出とEMgainを設定（100ミリ1000は良いパラメータであるが、システムに応じて最適化）とクールダウンするためにカメラを待つ。 </li><li> 100ミリ秒、1000カメラEMgain、取得モードに設定し、カメラの露出はセーブの設定の転送、100反復と自動フレームに。 </li><li>ゲルの境界に接眼レンズと透過光のフォーカスを使用して、その後、ゲルの中央に目標を移動し、フォーカスとSTAを調整レーザーアライメント手順RT（LAS AFで、「TIRFのセットアップ」を選択し、オートアライメント手順に従ってください）​​。 </li><li> 100フレームを取得し、複数の単一のスポットを獲得するために、ステップを5-6回繰り返し、基準として、（通常はビーズの集合体を表していること）明るいスポットに焦点を正確に、孤立した単一のスポットを有する視野を検索します。 </li><li>データ処理プログラムに獲得したシリーズをインポートし、時間内に（ 図1A）スタックを平均化し、単一の孤立したビーズを選択します。粒子凝集を回避するために、最小のものを選択するように注意してください。 </li><li> （Matlabの中で材料におけるICS-Matlabのツールでの）コマンド「gaussfit」を使用してガウス関数で選択された強度分布（単一ビーズプロファイルの一例を図1Bに示されている）を取り付け。得られた残差を調べることによって適合度を確認します（対応する残差と当てはめられたガウス分布の例は、私が提示されているn 図1B）。 </li></ol></li><li>カメラ較正<ol><li>カメラの電源を入れ、カメラが冷えるのを待ちます。 （32×128にトリミングモード、ROIサイズにつまり 、使用したカメラのために私たちは1,000 0.5ミリ秒、カメラEMgainへの露出を設定し、取得モード、万回の繰り返し）の設定、カメラの取得を、設定し、カメラの背景の取得を開始信号。 </li><li>インポートは、データ処理プログラムにフレームシリーズを取得しました。カメラの背景は、チップの選択された領域でほぼ平坦であることを確認するために、各画素内の平均強度を計算し、検査します。カメラの背景は通常、境界線にバイアスされているため、クロップドモードでは、各フレームの最初と（ROIのサイズに応じて3から10）最後の数本の水平線を削除します。 </li><li> （Matlabのコマンド「シーッ」を使用して）スタック取得された画像に（また、デジタルレベル、DLが定義されている）値のヒストグラムを作成し、対数をプロットする（Matlabの中でsemilogyのコマンドを使用して）周波数を生じたの。カメラ背景のDL分布の一例を図2に示されている。 注：カメラがうまく機能している場合は、プロットは対数スケールで指数関数的減衰（負の傾きを持つ行が続くゼロの光子に関連付けられた値の分布を表す約ガウスピーク（対数スケールで放物線プロファイル）を表示します1）光子（ 図2）に関連付けられた値の分布を表す。指数部の減衰定数は、それぞれ単一光子をカメラによって割り当てられたDLの推定を表している、特に、中心とガウス関数の分散は、それぞれ、カメラのオフセットとの誤差を表す。 MATLABで材料をサポートするスクリプトのセクション「CalibrateCamera &quot;を使用します。 </li><li>選択したすべてのカメラEMGainとゲインのための操作を繰り返します。 </li></ol></li></ol>ラベル付き2。細胞調製<ol><li> （1,2-dioleoyl- のsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン）、脂質取り込み36に必要なリポソームを調製DOPEの別途の1mgを溶解するために、DOTAP（1,2 -ジオレオイル-3 -トリメチルアンモニウム-プロパン）1mgを、クロロホルム1ml中PPE-ATTO488 1mgの。 24時間、真空下で一緒に0.5 DOPE溶液を加え、DOTAP溶液0.5ml、及びPPE-ATTO488溶液25μlとドライを混ぜる。 HEPES緩衝液を20mM、40℃で15分間、15分間、超音波処理のための渦の0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>セルを製造するために、PBSでコンフルエントCHO-K1（チャイニーズハムスター卵巣）のP100ディッシュを3回洗浄、5分間インキュベーター内トリプシンおよびストアの1ミリリットルを追加します。 10％のFBSを補充したDMEM / F12培地9mlを加える剥離細胞を一時停止し、同培地800μLを含むペトリ皿に細胞溶液150μlをシード。 </li><li> 37℃で24時間、5％CO 2インキュベータで保管してください。脂質取り込みのために、500細胞培地を交換してください無血清培地μL; 30分後、リポソーム溶液2μlを追加します。およびPSBで15分間洗浄した後に画像化するための新しいDMEM / F12培地を追加します。 </li><li>トランスフェクションのために、イメージングの前にインキュベーター内でのTfR-GFPプラスミドとストアの24時間を使用して、リポフェクタミンプロトコル（メーカーの指示）に従って、細胞をトランスフェクト。 </li></ol> 3。データ収集<ol><li>セットアップの準備<ol><li>顕微鏡をサーモスタットするためには、実験前の24時間は、培養器の電源をオンにします。 </li><li>最速の達成可能な取得時間を適用するためには、トリミングセンサーモードでの作業（導入を参照）、電池（カメラ2）を選択するイメージング（カメラ1）と第2のカメラのための最初のカメラを使用しています。セットアップ設定の方式は補足図S1に示す。その後、顕微鏡上の2台のカメラのターンを合わせ、カメラが冷えるまで待ちます。 </li><li>両方のカメラ透過光イメージングのためのパラメータに設定します（ つまり、 </em露光時間&gt;、20ミリ秒、EMゲインのための1）、明視野モードで顕微鏡を置く。 </li><li>ホルダーにサンプルを入れて、接眼レンズを使用して焦点を合わせる、カメラ1に光を送信し、静かにのみ細胞イメージング（ここでは32×32ピクセルのROI）に使用されるROIに光を可能にするスリットを押してください。 </li><li>その後の参照を持つために、カメラ2を制御するソフトウェアでROIを描き、選択した領域内のセルを移動し、カメラ2に光を送る。 </li></ol></li><li>イメージング（ 図3A） <ol><li>まず第一に、あなたのセットアップの手順に従って全反射レーザーの位置を合わせます。私たちのセットアップでは、「TIRFのセットアップ」を選択し、オートアライメント手順を開始します。レーザーが整列されると浸透深さ（約70℃）の70ナノメートルに設定してください。 </li><li>カメラ1とカメラ2の両方に100に70ミリ秒とEMGainに露光時間を設定します。次に、カメラ1を用いて細胞を選択し、カメラ2に光を送信し、正確に細胞膜を当てる。 CAの最小露出を設定しますメラ2、千EMGain、クロップドセンサーモード、10 5回の繰り返しとファイル（柔軟なイメージ輸送システム、容易に管理できる形式）が収まるように自動保存を設定しますが。 </li><li>画像シリーズを記録する取得を開始します。 8-10細胞を取得するために最後の2つの手順を繰り返し、その後、新しいセルを取得する前に温度安定化を可能にするためにゲインとトリミングされたモードを解除してください。 </li></ol></li></ol>イメージングから平均二乗変位の4。計算（I MSD） 注：以下のプロトコルは、直接生データに適用することができる。同時に、全体のプロトコルは、MATLABでかつSimFCSの両方でシミュレートされたデータの取得のために有効です。対応するチュートリアルへのリンクが「マテリアル」のセクションに記載されています。 <ol><li> MATLABが計算<ol><li> ImportImageSeriesスクリプトを使用してMATLABに獲得したシリーズをインポートします。共同を使用して時間内に各画像の平均輝度を計算するmmand最初の2次元上の意味と、得られたベクターを見るために、プロットを使用しています。 </li><li>光退色の10％以上が存在する場合、一連の破棄またはそれらの最初の部分を取り除く。それが低い場合は、37の前に示したように、各画像の平均輝度を減算することにより相関関数への影響を補正しようとする。 </li><li>第三の次元に平均値を用いて各ピクセルの平均強度を計算し、画像を生じた参照。 注：特に注意人工相関を避けるために必要とされる。実際、以前に同様の技術38、セルの枠線のためだけでなく、フォーカス小胞の外に示したように強い相関をもたらす可能性があります。平均画像の検査がセルの枠線やフォーカス小胞の外に明らかになった場合、それ以外の買収を破棄関与する領域を除外してみてください。この不動の構造の影響を補正するために、各画素39からの平均時間的強度を差し引く。 </li><li> Tを計算する機能CalculateSTICScorrfuncを使用して、彼の時空間相関（G（ξ、χ、τ））。 Gは（ξ、χは、0）が低いため、光領域におけるショットノイズの相関は、Gを支配しているため（0,0,0）を外します。による検出器への相関が測定され、腰を大きくすることにより、τ= 0のため、G（ξ、χ、τ）を変形させることができ、露光時間の間にG（±1,0,0）、および粒子の動きを支配する（この効果はτのために消える&gt; 0）34。 </li><li>平均G（ξ、χ、τ&gt; 0）材質のサポートに「LogBinStack」機能を使用することにより、ノイズを低減してから関数を使用して結果G（ξ、χ、τ）に合うように対数時間ビンを使用して「gaussfit」の私 MSD（結果の配列の2番目の列）を回収するための材料におけるICS-Matlabのツール。 </li><li>時間の関数として得られ腰σ（τ）2（I MSD）をプロットします。データがあまりにもうるさいであれば、acquの数を増やそう赤外発光ダイオードのフレームは、一緒にレーザーパワー、平均よりG（ξ、χ、τ）を増加させる。 </li></ol></li><li> SimFCSによる計算<ol><li> BioFormatインポータープラグインを使用してImageJを、取得したファイルを開き、Tiffをシーケンスとして取得されたシリーズを保存します。 </li><li>オープンSimFCSとRICSツールと[ファイル]&gt; [インポート複数の画像（補足図S2）を選択します。 </li><li>フィットを選択し、正しい収集パラメータを挿入し、フィットウィンドウ（補足図S3）を閉じる。 </li><li>ディスプレイ&gt;平均強度&gt; CH1を選択して、（補足図S4）の光退色の存在を確認。 </li><li>光退色の10％以上が存在する場合は、シリーズを破棄するか、再びシリーズの最初の部分を除去し、画像シーケンスの可能な負荷である場合。 </li><li>それを漂白すると10％未満の[ツール]の場合&gt; 私は 、MSD&gt;パラメータの設定、左への投資効果（ROI）]パネルで設定、「使用して、移動平均」をチェック特派時間は（粒子が1μm2秒-1 10秒の時間が良い移動平均である時に移動するための）特性拡散時間よりも高いことが、移動平均気をつけて、フレームのアンバー</li><li> [ツール]&gt; [iMSD&gt; 私 MSD（補足図S5）とフィット感を計算し、メモ帳から私 MSDをエクスポート（補足図S6）。 </li></ol></li></ol> 私 MSDから拡散法第5の計算<ol><li>インターセプト（σ0 2）を外挿する最初のいくつかのポイントを取り付け（5ポイントが通常は十分ですが、より多くのポイントは、彼らが線形挙動を示す場合装着することができる）と、以前に測定されたPSF 2で、この値を比較します。それらが同等である場合、単離されたフルオロフォアのダイナミクスが守られている。これとは対照的に、σ0 2 &gt;&gt; PSF 2トライのことを確実にするために高速取得する場合は、隠れダイナミクスは34存在しない。 </li><li> （概要を参照）、式3および4を使用して、見かけの拡散係数（D アプリ ）と平均変位（R）を計算します。 </li><li> FCS 12（ 図3D）ベースのスポット変動を用いて測定されるものと同程度の拡散の法則を得るためのRの関数としてプロットD アプリ 。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

単一粒子追跡（SPT）は、分子動力学を研究するための最も一般的な戦略の1つを表し、それは粒子軌道を測定するという大きな利点を有する。これは、複雑なシステムでさえ、いくつかの標識された粒子の挙動をプロービングを可能にする。しかし、SPTは、典型的には、プローブと、非常に明るいラベルの低密度を必要とするこの利点に到達する。特に、高い時間分解能（マイクロ秒の範囲）は、無機プローブを得るためには、通常（ 例えば、量子ドット、または金属ナノ粒子）が必要です。この場合、システムへの生産、ラベル付けおよび挿入の複雑な手順が必要である。 SPTに比べて本発明の方法は、いくつかの重要な利点を示しています。まず第一に、このアプローチは、蛍光タンパク質との結合に使用することができる。このように、SPTに比べて、より高い時間分解能が光子の少ない量のおかげで34を必要とした （同じラベル上）を実現しました。より詳細には、このプロパティは、時間的レゾールを押すことができます10以下のution - 3秒もエンコード可能な蛍光タンパク質を使用する場合は、このタイムスケールは、膜構成成...

シンガーとニコルソンによるオリジナル「流体モザイク」モデルから始めて、携帯形質膜の画像を連続的に細胞骨格と脂質ドメイン1,2の新たな役割を含めるために、過去数十年の間、更新されています。 最初の観察は、膜タンパク質のかなりの割合が不動3-5であることを発表（FRAP）の光退色後蛍光回復により得た。これらの先駆的な研究は、非常に有益なものの、FRAPのセットアップの比較的乏しい空間での分解能（ミクロン）と時間（秒）に苦しんだ。また、アンサンブル平均測定値である、FRAP、単一分子の挙動についての情報を与えることに欠けている。 この文脈において、特に非常に明るいタグ（一度に拡散工程つの分子の研究を可能にする）を有する単一の分子を標識する可能性は非常に成功している。特に、押してマイクロ秒の時間スケールへの単一粒子追跡（SPT）アプローチの時間分解能、楠見ら大幅に膜生理学6におけるアクチンベースの膜骨格の役割の認識に貢献した脂質とタンパク質ダイナミクスの未知の機能へのアクセスを獲得7。これらの知見は、脂質およびタンパク質の拡散がアクチン系骨格によって調節される、いわゆる「ピケットフェンス」モデルが、生成された。しかし、SPT多くの実験の問題によって提供される情報の膨大な量にアクセスするためにアドレス指定されなければならない。特に、標識操作は、一般的に、生産、精製、およびシステムへの標識種の導入のような多くのステップによって構成されています。さらに、大きなラベルは、量子ドット、または金属ナノ粒子のような、多くの場合、ミリ秒以下の時間スケールに達するために必要とされ、ラベルによる標的分子の架橋は、多くの場合において回避することができなかった。最後に、多くの軌跡統計的基準に適合するために記録されなければならないし、同時にラベルの低密度は、追跡を可能にするために必要とされている。 SPT、蛍光相関分光法（FCS）と比較して、これらの欠点の多くを克服し、分子動力学を研究するための非常に有望なアプローチを表す。実際には、FCSが一過性にトランスフェクションされた細胞に蛍光タンパク質タグ化分子のダイナミクスを研究するために有効に、薄暗い、緻密なラベルでもうまく動作します。また、限られた時間の中で高い統計を達することができます。最後に、ラベルの「高」密度にもかかわらず、FCSが単一分子情報を提供します。おかげで、これらすべての特性のために、FCSは非常に簡単なアプローチを表し、広範囲にモデル膜において、生細胞8-10に両方の脂質およびタンパク質のダイナミクスを研究するために適用されている。多くの異なるアプローチは、分子拡散の詳細を明らかにするためにFCSの能力を増加させるために提案されている。例えば、それはshにあっ異なるサイズの観察領域にFCSを実行することによって、一つは分子運動11,12の「FCS拡散法」啓発隠された機能を定義できることを自分自身。サイズが多様であることに加え、焦点領域も13重複した行14-20または高速カメラ21,22共役一緒に空間内を移動。これらの「時空間」相関アプローチを用いて、いくつかの膜成分の関連する生物学的パラメータを定量的にこのようにして、膜の空間的組織への洞察をもたらす、モデル膜と実際の生物学的なものの両方に記載されている。 しかし、すべてのFRAPとFCS用途でこれまでに説明した焦点領域の大きさを克服することができない空間分解能の限界を表している。いくつかの超解像画像化方法は、最近、この制限を回避するために開発されている。いくつかは、そのような確率論的光学再構築顕微鏡（STORM）として、ローカライズの精度に基づいています&lt;SUP&gt; 23,24、光活性化局在化顕微鏡（PALM）25、蛍光PALM（FPALM）26、及び単一粒子追跡PALM（sptPALM）27：各スナップショットに必要な光子の比較的大きな量が、しかしながら、時間分解能を制限する少なくとも数ミリ秒、これらの方法は、従って、インビボでのそれらの適用を妨げる。 対照的に、超解像イメージングのための有望な代替手段は、空間的に誘導放出の枯渇法（STEDまたは可逆的飽和性光学蛍光遷移（RESOLFT））28,29で蛍光発光を変調することによって開かれている。これらのアプローチは、高速走査型顕微鏡および検出システムを使用する可能性を有するだけでなく、回折限界以下の観察体積の整形を組み合わせる。蛍光変動解析と組み合わせて、STED顕微鏡を直接脂質およびpのナノスケール時空間的動態を探査することができ生細胞膜30,31中roteins。 STED顕微鏡ベースの同一の物理量は、生細胞中の蛍光標識膜タンパク質及び/又は脂質のダイナミクスを研究するのに適している改変された時空間画像相関分光法（STICS 32,33）の方法によって得ることができるや商業顕微鏡による。ここで紹介する実験プロトコルは、いくつかの手順によって構成されています。最初のものは膜上の関心領域の高速撮像を必要とします。そして、画像の得られる積層体は、平均空間 - 時間相関関数を計算するために使用される。 -平均変位プロット対 -相関関数のシリーズを嵌合することにより、分子の「拡散法は、「見かけの拡散係数（D アプリ ）の形態の撮像から直接得ることができる。このプロットは、批判的に分子によって探求、環境に依存しており、直接、実際の拡散モードを認識することができます興味のある脂質/タンパク質の。 より詳細には、先に示した34ように、取得した画像シリーズの時空間的自己相関関数は、批判的に収集された画像シリーズ内を移動する分子のダイナミクスに依存する（同じ論法がラインの取得に適用することができることに注意してください空間内のただ一つの次元が考慮されている）。特に、本発明者らは、のように、相関関数を定義する。 <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230"> （1） どこ<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50">位置xで測定された蛍​​光強度を表し、yおよび時間tにおける、 <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8">そして<img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> x方向の距離を表し、それぞれy方向、 <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10">タイムラグを表し、そして<img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20">平均を表す。この関数は、のように表すことができる。 <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230"> （2） 'N'は、観察領域内の分子の平均数を表す<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10">空間における畳み込み演算を表し、そして<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50">楽器の腰の自己相関を表しています。この後者は、光学/録画設定に単一の発光体の光子が空間に広がっているかの尺度として解釈することができる（いわゆる点広がり関数、PSF、遺伝子よくガウス関数で近似ラリー）。最後に、 <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50">距離で粒子を見つけるために確率を表す<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10">そして<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10">時間遅延の後に<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> 。私たちは、粒子が全ての方向にランダムに移動し、正味フラックスは存在せず、この関数はまた、よく分散が移動する粒子の平均二乗変位（MSD）として識別することができ、ガウス関数で近似される拡散動力学を考慮した場合。従って、相関関数（の腰とも呼ば<img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30"> ）、粒子のMSDの和楽器の腰のように定義することができ、ガウスフィットによって測定することができる各時間遅延のための相関関数のティン。測定された私 MSD移動分子の見かけの拡散係数を計算するために使用することができ<img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40">と平均変位<img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40">として： <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170"> （3） <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170"> （4） 使用された実験のセットアップには、いくつかの考慮事項は、次のセクションを通して読者を導くことができる。選択的に生細胞の基底膜上のフルオロフォアを励起するために、私たちは、商業のTIR蛍光（TIRF）顕微鏡（詳細は材料セクションを参照のこと）を使用して、全反射（TIR）照明を使用します。また、順番​​に目を収集する電子蛍光当社は高倍率の対物レンズ（100X NA 1.47、高開口数を全反射照明に必要とされる）と、EMCCDカメラ（内蔵さ16μmの画素の物理サイズ）を使用します。 100nmのピクセルサイズに到達するために、私たちは、1.6Xのさらなる拡大レンズを適用する。以下に説明するように、1ミリ秒以下の時間分解能を適切に100nm未満の速い膜脂質の動力学を記述するために必要とされるであろう。この時間分解能を達成するために、私たちは、カメラ（512×512）のチップ全体よりも小さい関心領域（ROI）を選択する必要があります。このように、カメラは、時間分解能を増加線の数の減少を読み取る。しかし、この読み出し領域でフレーム時間は、カメラの読み出しチップへの暴露からの電荷をシフトするために必要な時間によって制限されると、512×512ピクセルEMCCDミリ秒のオーダーで通常である。この制限を破ったために、新しい技術は、wは、ROIラインのみの代わりに、フレーム全体をシフトできます（私たちのEMCCDにクロップドセンサーモードと呼ばれる）が露出し、チップサイズの実用的な効果的な減少番目。この設定を有効にするには、ROIの外側のチップは、光路に取り付けられたスリットのカップルによってカバーされなければならない。時間分解能ダウン10 -4秒にこのセットアップのおかげで達成することができる。 「議論」のセクションで説明したように、このアプローチは、多くの異なった実験装置と結合することができること、しかし、注意してください。 この方法の実証は両方ATTO488を使用することにより、生きた細胞内で提供される1 -パルミトイル-2-ヒドロキシのsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン（ATTO488-PPE）及びトランスフェリン受容体のGFP標識された変異体（GFP-標識されたのTfR）。以前に30,35を報告したようにATTO488-PPEの場合、このアプローチは成功し、大部分は自由拡散を示す平均変位の関数としてほぼ一定のD アプリを回復することができます。対照的に、TfRは-GFPは減少Dを示している<su>6を示唆して平均変位の関数としてb&gt;のアプリ。また、後者の場合には、ローカル拡散定数と膜面上の多数のミクロンを超える平均閉じ込め領域を定量化することが可能である。 </su>

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 ラベル付き PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850725</tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc. (英語)</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals ソフトウェアは</td><td></td><td>ここからダウンロードできます: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr> <tr><td>DMI6000 TIRF 係数付き</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>リポフェクタミン</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C末端GFPタグ付き トランスフェリン受容体</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>ラテックスビーズ、蛍光黄緑色、30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>SONICA超音波</td><td>クリーナーSOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Format importer for Matlab</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/ ICS-MatLabツール</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td></tr><tr><td>シミュレーション by Matlab チュートリアル</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td></tr><tr><td>シミュレーション by SimFCS チュートリアル</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

それは、空間分布および脂質やタンパク質のような膜成分の動きが多くの細胞機能の調節に重要な因子であることがますます明らかになった。ただし、高速ダイナミクスと関係する小さな構造に起因し、非常に高い時空間的分解能は、分子の実際の行動をキャッチするために必要とされている。ここでは、高時空間分解能で生きた細胞内の蛍光標識形質膜タンパク質や脂質のダイナミクスを研究するための実験プロトコルを提示する。注目すべきことに、このアプローチは、各分子を追跡する必要がないが、それは、膜の所定の領域内のすべての分子を用いて母集団の挙動を計算する。出発点は、膜上の所定の領域の高速撮像である。その後、完全な空間時間的自己相関関数は、例えば、それぞれ2個、3個、nは繰り返しの時間遅延を増加させるで取得された画像を相関計算される。それは、幅があることを証明することができます空間的自己相関関数のピークの拡散による粒子移動の関数として増加する時間遅延で増加する。そのため、自己相関関数の一連のフィッティング（iMSD）を画像化するから、正方形の変位を意味し、実際のタンパク質を抽出することができ、ここでは平均変位対見掛け拡散係数の形で提示。これは、ナノメートルの精度で単一分子の平均ダイナミクスの定量的な見解が得られます。標識されたトランスフェリン受容体（TfRは）及びATTO488のGFPタグ付き変異体を用いて、1 -パルミトイル-2 -ヒドロキシ- のsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン（PPE）は、上のタンパク質および脂質拡散の時空間レギュレーションを観察することが可能であるマイクロ対ミリ秒の時間範囲の程度の大きさの膜領域を含む。

楽器の腰を較正するために、単一の蛍光ナノビーズの画像は、プロトコルのステップ1.1に記載のように措置することができる。これらのビーズの典型的な蛍光画像を図1に示されている。2Dガウス関数による強度分布のフィッティングは、バック良い残差を提供し、270 nmでの楽器のウエストを測定することを可能にする。この値は、レイリーの式で推定し、予想される回折限界とよく一致している。この較正は、粒子のダイナミクスを測定するために必要ではないが、それは、見かけの粒径を測定する必要がある。 カメラの背景の典型的な周波数分布は約180 DLのピークは全く光子に対するカメラの応答によるものである。 図2に提示され、それはアナログデジタル（AD）変換器の寄与を表す。この寄与は、オフセットを推定するためのガウス分布および分散のように近似することができる信号記録によって導入。 200 DLの上にデジタルレベル分布は指数（対数スケールにおけるリニア）になると、単一光子に対する平均のカメラ応答を表す。指数分布でこの部分をフィッティングすると、各単...

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

この手順の全体的な目標は、これを行うために、生細胞膜内の脂質とタンパク質の拡散法則を測定することです。まず、顕微鏡の点像分布機能は、ナノスコープ蛍光ビーズをイメージングすることによって較正されます。次に、蛍光標識された目的の分子を含むリポソームベースのベクターを調製し、トランスフェクションまたは直接取り込むことによって生細胞に導入します。生細胞原形質膜の高速イメージングは、全反射蛍光顕微鏡によって行われます。最後に、相関関数が計算され、ガウスフィッティングによって分子拡散法則が抽出されます。結果のデータ。調査中の脂質またはタンパク質の運動モードを特定します。この手法は、光漂白アプローチや従来のシングルポイント蛍光相関分光法後の従来の蛍光回収と比較した場合の主な利点は、分子拡散法則を測定できることです。私たちはシステムの優先的な知識を知っています。また、従来の単粒子追跡方法論にも反しています。ここでは、粒子の軌跡を抽出する必要なく、壁の変位が測定されます。結果として、この金属は、例えば、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質のように、比較的見なされ、密度の高い分子と組み合わせて容易に使用することができます。全体として、この方法は、タンパク質や脂質の動きが原形質膜の構造や機能組織をどのように調節するかなど、細胞分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます これらおよび関連する質問に対する答えは、誰もが利用できるようになります そして、市販の顕微鏡を使用するだけで、全体的な手順のデモンストレーションがzoによって行われます。 研究室の博士課程の学生。このプロトコルは、イメージングシステムの点像分布関数を較正することから始めます。まず、500マイクロリットルの遠心分離管にあらかじめ添加した90マイクロリットルの蒸留水に10マイクロリットルの蛍光ビーズ溶液を希釈します。メスを使用してサウナケータリングバスで溶液を20分間超音波処理し、1センチ四方の3%AGAローズジェルを切り取り、ペトリ皿に入れます。希釈した蛍光ビーズ溶液10マイクロリットルをゲルの上部に沈着させます。次に、鉗子を使用して、2センチメートルのガラスシャーレでゲル片を反転させます。再び、鉗子を使用します。ゲルを押し下げて液滴を分散させます。次に、市販の全反射蛍光顕微鏡で構成されるデータ収集セットアップをオンにします。インキュベーターと高速E-M-C-C-Dカメラを搭載し、アプリケーションスイート、高度な蛍光ソフトウェア、および/またはSolis画像取得ソフトウェアを実行しているコンピューターに接続されています。Iピースと透過光を使用して、サンプルを顕微鏡ステージ上のホルダーに置きます。ゲルの境界に焦点を合わせます。次に、ゲルを対物レンズの中央に配置し、焦点を調整してレーザーアライメント手順を開始する ライカアプリケーションスイート、高度な蛍光ソフトウェアで自動アライメントを選択し、自動アライメント手順に従います。レーザーがAND/またはSOLIS取得ソフトウェアで位置合わせされたら、設定ボタンをクリックします。ウィンドウが開きます。カメラの露出を100ミリ秒に、EMゲインを1000に、繰り返しを100に設定し、フレーム転送チェックボックスをオンにします。次に、自動保存ウィンドウをクリックして、実験の名前を挿入します。孤立した 1 つのスポットがある視野を見つけます。輝点 (通常はビーズの凝集体) に注目します。その後、100フレームを獲得します。この手順を5〜6回繰り返して、いくつかの単一スポットの画像を取得します。取得した系列をMATLABなどのデータ処理プログラムにインポートし、スタックを時間内で平均化します。次に、測定された平均強度の画像を表示します。明るくて小さな蛍光スポットをズームし、スポットの最も明るいピクセルとして中心を大まかに識別します。最後に、粒子の周囲に描画する関心領域のサイズ(通常は、選択した強度分布をガウス関数で適合させるために1ミクロン隣)を選択します。コマンド gause fit を選択します。得られた残差を検査して、適合度を確認します。最後に、付属のドキュメントで説明されているようにカメラを調整します。システムのキャリブレーションが完了したら、画像取得のために細胞をラベリングします。脂質取り込みに必要なリポソームの調製は、1ミリグラムのDOPE、1ミリグラムのD-O-T-A-P、および1ミリグラムのPPE ADO 4 88をそれぞれ1ミリリットルのクロロホルムを含む別のマイクロ遠心チューブに溶解することにより開始します。次に、DOPEおよびDOT-A-P溶液のそれぞれ0.5ミリリットルを、25マイクロリットルのPPE ATO 4 88溶液と組み合わせます。チューブを遠心蒸発器に入れ、280 gでスピンを開始します。真空ポンプを始動し、24時間回転させます。翌日、0.5ミリリットルの20ミリモルハイスバッファーをチューブに加え、15分間ボルテックスします。次に、チューブをソニックケータリングバスに入れ、摂氏40度で15分間超音波処理します。細胞を調製するために、コンフルエントチャイニーズハムスター卵巣またはCHOK 1細胞のP 100皿を10ミリリットルのPBSで3回洗浄する。次に、1ミリリットルのトリプシンを加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で5分間インキュベートします。インキュベーション後、10%のFBSを添加した9ミリリットルのD-M-E-M-F 12を加えて、この細胞含有溶液の150マイクロリットルを細胞に懸濁させます。22ミリメートルのガラス底に同じ媒体の800マイクロリットルを含むペトリ皿。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。脂質の取り込みには、細胞培地を500マイクロリットルの無血清培地と交換し、30分間インキュベートします。インキュベーション後、2マイクロリットルのリポソーム溶液を加え、さらに15分間インキュベートします。次に、細胞をPBSで洗浄し、新しいDM EMF 12を追加します。実験の少なくとも12時間前にイメージングする前に、顕微鏡インキュベーターの電源を入れて、顕微鏡ステージと光学部品を実験温度まで上げてください。この手順の最も難しいステップは、その取得です。成功を確実にするためには、システムのすべての取得パラメータを最適化してください。研究中。実験当日は、顕微鏡の電源を入れ、カメラが動作温度に達するのを待ちます。実験を行うために、2台のカメラを使用します。カメラ 1 はイメージングに使用され、カメラ 2 はセルの選択に使用されます。この構成により、ソフトウェアで達成可能な最速の収集時間が可能になります。透過光イメージングのパラメータを設定します。20ミリ秒を入力します露光時間には、両方のカメラのEMゲインに1を入力します。次に、ソフトウェアでコントラストモードウィンドウを開き、左に進みます。BFをクリックして、明視野オプションを選択します。サンプルをホルダーに入れながら、サンプルをアイピースを通して見ます。サンプルにピントを合わせます。次に、手動でライトをカメラ1に送り、スリットをそっと押して、イメージングするROIのみが照らされるようにします。次に、選択した領域にセルを移動し、ソフトウェアを使用してカメラ2に光を送ります。次に、ソフトウェアでROIを描画して参照を生成します。まず、ソフトウェアでレーザーを位置合わせするには、自動位置合わせを選択します。次に、自動位置合わせ手順を開始するには、コリメータを有効にするを選択します。次に、上部のインキュベーターを開き、レーザービームをコリメートします。レーザーがソフトウェアウィンドウの左下隅に位置合わせされている場合は、70ボタンをクリックして、浸透深度を70ナノメートルに設定します。これは、ライカのアプリケーションスイートにおける底面ガラス上のレーザーの入射角が約70度であることに相当します。高度な蛍光ソフトウェアの露光時間テキストボックス。[EM ゲイン] テキスト ボックスに 70 ミリ秒を入力します。カメラ 2 で同じことを行うには、1000 を入力します。設定ウィンドウを開き、対応するテキストボックスに同じ番号を入力します。次に、ライブボタンをクリックします。蛍光はカメラ1に送信され、サンプルの画像が画面に表示されます。蛍光細胞が目的の参照領域に到達するまでサンプルを移動します。次に、顕微鏡本体の前面にあるボタンを押して、カメラ2に光を送り、Zポジションホイールを正確に動かして、およびまたは唯一のソフトウェアで細胞膜に焦点を合わせます。設定ウィンドウを開き、達成可能な最小露光時間1000 EMゲインクロップセンサーモード10を5回目の繰り返しに設定し、自動保存オプションを設定して画像シリーズの取得を開始します。ソフトウェアのカメラアイコンをクリックし、取得が完了するのを待ちます。次に、設定ウィンドウを開き、EMゲインを無効にして、クロップモードオプションからチェックを外します。撮影中、カメラの温度は通常約2〜3度上昇します。したがって、新しいセルから画像を取得する前に、最適な動作温度に達するまで待ちます。ここでも、イメージングが完了したら、添付のドキュメントの指示に従ってイメージングからの平均二乗変位を計算し、目的の分子の蛍光標識バリアントを取得します。CHOK one細胞は、ADO 4 88 PPEで標識するか、受容体またはT-F-R-G-F-Pへの転写でトランスフェクションし、このビデオで説明されているようにTIRFによってイメージングされました。ここで見ることができるように、ADO 4 88 PPEの測定された拡散法則は平坦であり、T-F-R-G-F-Pによるトランスフェクション後の誘導放出枯渇蛍光、相関分光法、またはSTEAD FCS測定によって以前に示されたように、ほとんど自由拡散を示しています。T-F-R-G-F-Pの測定された拡散法則は、最初は平坦で、平均分子変位の100ナノメートル未満にとどまり、平均見かけの拡散係数は毎秒約0.7ミクロンの二乗です。これに続いて、見かけの拡散率が毎秒0.2ミクロン二乗まで急速に減少します。通常、回折制限付きFCSで測定される値。興味深いことに、この最後の例で示されるように、本手法では、GFPのような比較的薄暗く緻密な標識を用いても、数十ナノメートルの分解能で平均分子変位を容易に測定できる。さらに、見かけの拡散係数が減少し始める空間スケールは、膜骨格によるタンパク質の部分閉じ込めの特性サイズを約120ナノメートルに設定し、以前の推定値と一致しています。データ分析の手順を習得すると、その取得は数分で完了します。この技術により、細胞生物学や分子生物学の研究者が、生命試料中のタンパク質や脂質の拡散の時空間制御を容易かつ定量的に探求できるようになると考えています。

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