商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

この手順の全体的な目標は、これを行うために、生細胞膜内の脂質とタンパク質の拡散法則を測定することです。まず、顕微鏡の点像分布機能は、ナノスコープ蛍光ビーズをイメージングすることによって較正されます。次に、蛍光標識された目的の分子を含むリポソームベースのベクターを調製し、トランスフェクションまたは直接取り込むことによって生細胞に導入します。

生細胞原形質膜の高速イメージングは、全反射蛍光顕微鏡によって行われます。最後に、相関関数が計算され、ガウスフィッティングによって分子拡散法則が抽出されます。結果のデータ。

調査中の脂質またはタンパク質の運動モードを特定します。この手法は、光漂白アプローチや従来のシングルポイント蛍光相関分光法後の従来の蛍光回収と比較した場合の主な利点は、分子拡散法則を測定できることです。私たちはシステムの優先的な知識を知っています。

また、従来の単粒子追跡方法論にも反しています。ここでは、粒子の軌跡を抽出する必要なく、壁の変位が測定されます。結果として、この金属は、例えば、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質のように、比較的見なされ、密度の高い分子と組み合わせて容易に使用することができます。

全体として、この方法は、タンパク質や脂質の動きが原形質膜の構造や機能組織をどのように調節するかなど、細胞分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます これらおよび関連する質問に対する答えは、誰もが利用できるようになります そして、市販の顕微鏡を使用するだけで、全体的な手順のデモンストレーションがzoによって行われます。 研究室の博士課程の学生。このプロトコルは、イメージングシステムの点像分布関数を較正することから始めます。まず、500マイクロリットルの遠心分離管にあらかじめ添加した90マイクロリットルの蒸留水に10マイクロリットルの蛍光ビーズ溶液を希釈します。

メスを使用してサウナケータリングバスで溶液を20分間超音波処理し、1センチ四方の3%AGAローズジェルを切り取り、ペトリ皿に入れます。希釈した蛍光ビーズ溶液10マイクロリットルをゲルの上部に沈着させます。次に、鉗子を使用して、2センチメートルのガラスシャーレでゲル片を反転させます。

再び、鉗子を使用します。ゲルを押し下げて液滴を分散させます。次に、市販の全反射蛍光顕微鏡で構成されるデータ収集セットアップをオンにします。

インキュベーターと高速E-M-C-C-Dカメラを搭載し、アプリケーションスイート、高度な蛍光ソフトウェア、および/またはSolis画像取得ソフトウェアを実行しているコンピューターに接続されています。Iピースと透過光を使用して、サンプルを顕微鏡ステージ上のホルダーに置きます。ゲルの境界に焦点を合わせます。

次に、ゲルを対物レンズの中央に配置し、焦点を調整してレーザーアライメント手順を開始する ライカアプリケーションスイート、高度な蛍光ソフトウェアで自動アライメントを選択し、自動アライメント手順に従います。レーザーがAND/またはSOLIS取得ソフトウェアで位置合わせされたら、設定ボタンをクリックします。ウィンドウが開きます。

カメラの露出を100ミリ秒に、EMゲインを1000に、繰り返しを100に設定し、フレーム転送チェックボックスをオンにします。次に、自動保存ウィンドウをクリックして、実験の名前を挿入します。孤立した 1 つのスポットがある視野を見つけます。

輝点 (通常はビーズの凝集体) に注目します。その後、100フレームを獲得します。この手順を5〜6回繰り返して、いくつかの単一スポットの画像を取得します。

取得した系列をMATLABなどのデータ処理プログラムにインポートし、スタックを時間内で平均化します。次に、測定された平均強度の画像を表示します。明るくて小さな蛍光スポットをズームし、スポットの最も明るいピクセルとして中心を大まかに識別します。

最後に、粒子の周囲に描画する関心領域のサイズ(通常は、選択した強度分布をガウス関数で適合させるために1ミクロン隣)を選択します。コマンド gause fit を選択します。得られた残差を検査して、適合度を確認します。

最後に、付属のドキュメントで説明されているようにカメラを調整します。システムのキャリブレーションが完了したら、画像取得のために細胞をラベリングします。脂質取り込みに必要なリポソームの調製は、1ミリグラムのDOPE、1ミリグラムのD-O-T-A-P、および1ミリグラムのPPE ADO 4 88をそれぞれ1ミリリットルのクロロホルムを含む別のマイクロ遠心チューブに溶解することにより

次に、DOPEおよびDOT-A-P溶液のそれぞれ0.5ミリリットルを、25マイクロリットルのPPE ATO 4 88溶液と組み合わせます。チューブを遠心蒸発器に入れ、280 gでスピンを開始します。真空ポンプを始動し、24時間回転させます。

翌日、0.5ミリリットルの20ミリモルハイスバッファーをチューブに加え、15分間ボルテックスします。次に、チューブをソニックケータリングバスに入れ、摂氏40度で15分間超音波処理します。細胞を調製するために、コンフルエントチャイニーズハムスター卵巣またはCHOK 1細胞のP 100皿を10ミリリットルのPBSで3回洗浄する。

次に、1ミリリットルのトリプシンを加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で5分間インキュベートします。インキュベーション後、10%のFBSを添加した9ミリリットルのD-M-E-M-F 12を加えて、この細胞含有溶液の150マイクロリットルを細胞に懸濁させます。22ミリメートルのガラス底に同じ媒体の800マイクロリットルを含むペトリ皿。

細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。脂質の取り込みには、細胞培地を500マイクロリットルの無血清培地と交換し、30分間インキュベートします。インキュベーション後、2マイクロリットルのリポソーム溶液を加え、さらに15分間インキュベートします。

次に、細胞をPBSで洗浄し、新しいDM EMF 12を追加します。実験の少なくとも12時間前にイメージングする前に、顕微鏡インキュベーターの電源を入れて、顕微鏡ステージと光学部品を実験温度まで上げてください。この手順の最も難しいステップは、その取得です。

成功を確実にするためには、システムのすべての取得パラメータを最適化してください。研究中。実験当日は、顕微鏡の電源を入れ、カメラが動作温度に達するのを待ちます。

実験を行うために、2台のカメラを使用します。カメラ 1 はイメージングに使用され、カメラ 2 はセルの選択に使用されます。この構成により、ソフトウェアで達成可能な最速の収集時間が可能になります。

透過光イメージングのパラメータを設定します。20ミリ秒を入力します露光時間には、両方のカメラのEMゲインに1を入力します。次に、ソフトウェアでコントラストモードウィンドウを開き、左に進みます。

BFをクリックして、明視野オプションを選択します。サンプルをホルダーに入れながら、サンプルをアイピースを通して見ます。サンプルにピントを合わせます。

次に、手動でライトをカメラ1に送り、スリットをそっと押して、イメージングするROIのみが照らされるようにします。次に、選択した領域にセルを移動し、ソフトウェアを使用してカメラ2に光を送ります。次に、ソフトウェアでROIを描画して参照を生成します。

まず、ソフトウェアでレーザーを位置合わせするには、自動位置合わせを選択します。次に、自動位置合わせ手順を開始するには、コリメータを有効にするを選択します。次に、上部のインキュベーターを開き、レーザービームをコリメートします。

レーザーがソフトウェアウィンドウの左下隅に位置合わせされている場合は、70ボタンをクリックして、浸透深度を70ナノメートルに設定します。これは、ライカのアプリケーションスイートにおける底面ガラス上のレーザーの入射角が約70度であることに相当します。高度な蛍光ソフトウェアの露光時間テキストボックス。

[EM ゲイン] テキスト ボックスに 70 ミリ秒を入力します。カメラ 2 で同じことを行うには、1000 を入力します。設定ウィンドウを開き、対応するテキストボックスに同じ番号を入力します。

次に、ライブボタンをクリックします。蛍光はカメラ1に送信され、サンプルの画像が画面に表示されます。蛍光細胞が目的の参照領域に到達するまでサンプルを移動します。

次に、顕微鏡本体の前面にあるボタンを押して、カメラ2に光を送り、Zポジションホイールを正確に動かして、およびまたは唯一のソフトウェアで細胞膜に焦点を合わせます。設定ウィンドウを開き、達成可能な最小露光時間1000 EMゲインクロップセンサーモード10を5回目の繰り返しに設定し、自動保存オプションを設定して画像シリーズの取得を開始します。ソフトウェアのカメラアイコンをクリックし、取得が完了するのを待ちます。

次に、設定ウィンドウを開き、EMゲインを無効にして、クロップモードオプションからチェックを外します。撮影中、カメラの温度は通常約2〜3度上昇します。したがって、新しいセルから画像を取得する前に、最適な動作温度に達するまで待ちます。

ここでも、イメージングが完了したら、添付のドキュメントの指示に従ってイメージングからの平均二乗変位を計算し、目的の分子の蛍光標識バリアントを取得します。CHOK one細胞は、ADO 4 88 PPEで標識するか、受容体またはT-F-R-G-F-Pへの転写でトランスフェクションし、このビデオで説明されているようにTIRFによってイメージングされました。ここで見ることができるように、ADO 4 88 PPEの測定された拡散法則は平坦であり、T-F-R-G-F-Pによるトランスフェクション後の誘導放出枯渇蛍光、相関分光法、またはSTEAD FCS測定によって以前に示されたように、ほとんど自由拡散を示しています。T-F-R-G-F-Pの測定された拡散法則は、最初は平坦で、平均分子変位の100ナノメートル未満にとどまり、平均見かけの拡散係数は毎秒約0.7ミクロンの二乗です。

これに続いて、見かけの拡散率が毎秒0.2ミクロン二乗まで急速に減少します。通常、回折制限付きFCSで測定される値。興味深いことに、この最後の例で示されるように、本手法では、GFPのような比較的薄暗く緻密な標識を用いても、数十ナノメートルの分解能で平均分子変位を容易に測定できる。

さらに、見かけの拡散係数が減少し始める空間スケールは、膜骨格によるタンパク質の部分閉じ込めの特性サイズを約120ナノメートルに設定し、以前の推定値と一致しています。データ分析の手順を習得すると、その取得は数分で完了します。この技術により、細胞生物学や分子生物学の研究者が、生命試料中のタンパク質や脂質の拡散の時空間制御を容易かつ定量的に探求できるようになると考えています。