マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

この手順の全体的な目標は、血管透過性の変化を測定し、局所的なアレルギー反応を定量化することです。これは、最初に動物をOアルブミンなどのアレルゲンに感作することによって達成されます。2番目のステップは、アレルゲンの皮内注射で耳に挑戦することです。

次に、エヴァンの青い染料が尾静脈に注入されます。最後のステップは、問題のある耳を一晩インキュベートして、問題のある耳から染料を抽出することです。形態的には、アミドは最終的に分光測光法を使用して、耳に入った色素の量を定量化します。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、色素の血管外漏出が分光法によって測定されることです。これは、アッセイが観察者バイアスを受けにくいことを意味します。一般的に、この方法に不慣れな人は、皮内注射や尾静脈注射は技術的に難しく、習熟度を達成するために多くの練習が必要なため、苦労するでしょう。

まず、卵子ストック溶液のアリコートを室温に戻して使用します。室温で、卵子ストックを1 XPBSで1ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈します。5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブを使用してください。

チューブを中速でボルテックスし、完全に均質化された等量を慎重に追加します。ミョウバンを卵子溶液に滴下します。並行して、PBSに混合したミョウバンのネガティブコントロール溶液を同じ手法を使用して1対1の比率で調製します。

次に、チューブにキャップをして、渦に固定します。チューブを取り付けた状態で、ボルテックスを最低設定で30分間実行します。溶液の準備ができたら、すぐにBABマウスの感作に進みます。

卵子ミョウバンミックスを1ミリリットルのシリンジに入れます。次に、27ゲージの針で、各マウスの腹膜に100マイクロリットルを注入します。次の3週間にわたって、卵子を含まないミョウバン溶液を使用したネガティブコントロールマウスに対してこれを繰り返します。

このプロセスをマウスごとに合計3回の注射で繰り返し、最後の注射後、凍結卵子ストックから局所アナフィラキシーアッセイを実行する前に少なくとも2週間待ちます。PBSでミリリットルあたり5ミリグラムの作業溶液を作ることから始めます。5%ISOフッ素を使用して、短時間ボルテックスします。

感作マウスに麻酔をかけ、動かなくなったら、イソフッ素を3%にダイヤルダウンします次に、卵子製剤の10マイクロリットルを含む3つの10インスリン注射器をロードし、31ゲージの針でキャップし、1つのXPBSの10マイクロリットルで2番目のシリンジをロードします。次に、15ミリリットルの円錐形チューブを透明な粘着テープで粘着性のある面を外側にして解剖顕微鏡で包み、麻酔をかけたマウスの左耳の背側をチューブに固定します。PBSシリンジのベベル側の針を上にして耳の2つの葉の間に挿入し、10マイクロリットル全体をゆっくりと注入します。

血管に当たらないようにしてください。注射が成功すると、明らかな皮内ブリップが発生します。ボリューム全体を耳に注入することが重要です。

注射部位から液体が漏れた場合、動物を分析に使用することはできません。また、針が耳を完全に貫通したり、耳の表面を引っ掻いたりすると、これらの外傷が結果を右耳に混乱させるため、アッセイは無効になります。同じ方法を使用して、3分間の間に卵子を注入します。

マウスを拘束装置に移し、ヒートランプの下に置きます。次に、200マイクロリットルの0.5%エバンスブルー染料を尾静脈にゆっくりと注入します。27ゲージの針を使用すると、すべての染料が注入される前に血管が破壊されると、迅速な注入が損傷する可能性があります。

尾の反対側で注入を続けます。次に、10分待ってから、マウスを二酸化炭素で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行います。動物が安楽死したら、鉗子とはさみを使って耳を取り除きます。

注入部位に圧力をかけずに鉗子で耳の縁をつかみます。次に、耳の付け根の軟骨隆起の近くで切り込みますが、耳の付け根を越えることはありません。できるだけ多くの組織を集めます。

さて、適切な予防策を講じて、各耳に700マイクロリットルのフォームアミドをマイクロ遠心チューブに分注します。耳を各チューブに移し、乾熱ブロックで摂氏63度で一晩インキュベートすると、翌日、ほとんどの染料が抽出されますが、耳がわずかに青く見える場合があります。各サンプルの300マイクロリットルを96ウェルプレートに二重に加えます。

毛皮を移したり、ブランクに気泡を形成したりしないでください。2つのウェルに300マイクロリットルのフォームアミドをロードします。次に、620ナノメートルで吸光度を測定します。

背景から値を減算し、結果を分析します。PBS感作動物は、卵子チャレンジまたはPBSチャレンジに反応しなかった。予想通り、両耳は白いままでした。

OVAでPBSチャレンジを受けた年は、完全に白または淡い青色で、OVAチャレンジを受けた彼の耳が色素が投与されてから10分間徐々に暗くなった注射部位に局在し、IDEで処理されたPBS感作動物の耳組織は、PBSチャレンジとOVAチャレンジの両方の後に無視できる吸光度測定値を示しました。一方、卵子感作動物の場合、PBS注射は一般に平均吸光度の読み取り値を0.13にしました。逆に、50マイクログラムの卵子チャレンジでは、平均吸光度の読み取り値は0.58でした。

チャレンジに使用する卵子の量は、制限内で調整できます。たとえば、20マイクログラムのチャレンジでは、平均吸光度は0.30になりました。しかし、20マイクログラム未満のチャレンジでは、信頼性の高い結果は得られませんでした。

皮内注射や静脈注射に習熟すると難しいですが、この技術は、耳の注射と尾静脈の注射を行う2人が一緒に働くことで、約15分で1匹の動物に行うことができます。この手順は、約1時間で10匹の動物に行うことができます。このアッセイは、能動的および受動的な皮膚アナフィラキシーの両方に使用できるため、非常に汎用性があります。

また、多種多様なアレルゲンにも使用できます。イソフッ素は人間の生殖器系に悪影響を与える可能性があることを忘れないでください。換気の良い部屋でのみ使用し、妊娠中の場合は廃ガスを中和するために誘導チャンバーに清掃キャニスターを取り付けてください。

アイソフフッ素を使用する際は、カーボンフィルターマスクを着用して露出を最小限にしてください。