フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

この手順の全体的な目標は、多能性幹細胞から心筋細胞の高品質な培養物を作製し、フローサイトメトリーを使用して最終生成物を適切に特性評価することです。これを達成するために、未分化の多能性幹細胞の高品質な単層培養物が生成されます。次に、低分子を使用して風の経路を調節することにより、心筋形成が誘導されます。

次に、心筋細胞を固定し、浸透させ、各抗体に特別に最適化された条件で染色します。最後に、細胞をフローサイトメトリーで解析します。最終的には、心臓マーカーであるTNNI 3およびIRX 4に対して非常に陽性であり、心室様活動電位を示す培養を示す結果を得ることができます。

この手法の主な利点は、従業員や編組体のような既存の方法よりも優れているため、実装が比較的簡単で、費用対効果が高いことです。さらに、この技術は、他のプロトコルによって観察される内部の根本的な変動と効率がなければ、分化前の細胞品質が分化効率に大きく影響するため、この方法の視覚的なデモンストレーションが重要である心筋トロポニンI.Withあたり非常に陽性の細胞の培養を生成します。また、抗体染色前の不適切な固定と透過性は、フローサイトメトリーの結果が最適でないことを示しており、この手順は私の研究室の大学院生であるshabo bacharです。

以下の手順で最も困難な側面は、分化前に高品質の未分化多能性幹細胞を維持することです。最適ではない増殖特性を持つ細胞を使用すると、分化の効率に大きく影響します。この手順は、6つのHESC認定マトリックスコーティング皿で成長した定評のあるHPCから開始します。

顕微鏡で細胞をチェックし、細胞が均質な形態を示すことを確認します。ここに示すように、細胞が神経上皮または線維芽細胞様の形態を示す場合は、使用しないでください。細胞がウェル当たり75万個で着座したときに頑健に増殖することを確保し、それらを約3日ごとに75%コンフルエンタブルでそれらを75%コンフルエンスで、分化の開始開始前に少なくとも5回、単一細胞レベルまで解離した細胞を継代する。

細胞は最初にE 8増殖培地を吸引し、室温に予熱した4ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、各ウェルに1ミリリットルの室温セル剥離溶液を加え、セル境界が切り上げ始めるまでウェルをそのままにしておきます。これには通常3〜7分かかり、巨視的に観察し、顕微鏡を使用して確認できます。

次に、球根付きの綿栓ガラスピペットを使用して細胞を移動させ、1ミリリットルのDM EMF12培地を含む15ミリリットルの円錐管に移しました。これにより、細胞剥離溶液が不活性化されます。細胞溶液の10マイクロリットルのアリコートを取り出し、マイクロ遠心チューブ内で10マイクロリットルのトライアンブルーと混合します。

細胞を数え、それらを収集するために、130GSで15ミリリットルの円錐管を5分間遠心分離します。遠心分離中の室温で、自動ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。今後、70〜80%の生存率を期待してください。

すべての細胞番号は、生存細胞数ではなく、総細胞数に基づきます。スピン後、培地を吸引し、細胞ペレットをD-M-E-M-F 12に再懸濁し、500マイクロリットル当たり6個の細胞に10の0.75倍の最終濃度まで、各ウェルに2ミリリットルのE8培地が含まれている6ウェルプレートの各ウェルに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を添加する。岩石抑制剤を使用して、プレートを前後および左右に穏やかに揺さぶり、細胞をウェル全体に均一に分散させます。

包装後24時間後に、細胞を5%二酸化炭素、摂氏37度でインキュベーターに戻します。岩石阻害剤なしで、E 8のウェルあたり2ミリリットルを使用して、毎日培地の交換を開始します。

分化を開始する前に、100%の合流点を達成するために播種密度を最適化します。ゼロ日目には、細胞は100%コンフルエントで、コンパクトな形態と最小限の細胞破片です。E 8 培地を 2 ミリリットルの分化に置き換えることにより、分化プロセスを開始します。中程度。

1つ目は、それぞれに1.2マイクロリットルのCHIRを追加します。1日目と2日目には、40〜50%の細胞死が観察されるのが一般的です。ただし、付着した細胞はコンパクトな形態を保持します。

この間、媒体はオレンジ色になり、濁ります。過剰な細胞死を示すピンク培地が観察された場合は、トライアムブルーで細胞生存率を確認し、細胞死が70%を超えた場合は中止します。そうでない場合は、1日目に培地を2ミリリットルの新鮮な分化物に置き換えるプロセスを繰り返します。中程度。まず、各ウェルに1.2マイクロリットルのCHIRを追加し、2日目から3日目に新鮮な分化培地と交換します。

1つ目は、3日目から4日目にかけて、細胞は回復し、4日目には密度が増加します。各ウェルの培地を新鮮な分化剤に交換します。ミディアムナンバーワンとIWRワンの1マイクロリットル。

5日目から6日目にかけて、細胞死は最小限に抑えられ、5日目には密集した斑点が現れ始めることがあります。これは、培地を新鮮な分化物に置き換えてください。ミディアムナンバーワン、および6日目から7日目の各ウェルにIWR1の1マイクロリットルを追加し、培地を新鮮な差別化に置き換えます。ミディアムナンバーワン。

7日目から8日目までに、密集したパッチが点在するコンパクトな形態で、コンフルエントな単層が達成されます。8日目までに、細胞は自発的に収縮し始め、最初の収縮はしばしば密集したパッチに見られます。8日目に、培地を新しい差別化に交換します。中程度。

ナンバー2は、文化の期間中、一日おきに、差別化媒体ナンバー2に置き換え続けます。10日目までに、より強い収縮が観察され、その後の数日間は培養全体に広がり続けます。このビデオは 30 日目の細胞を示しており、ここでは 55 日目の細胞を示しています。

フローサイトメトリー用の細胞を採取するには、以前に行ったように細胞解離の収集とカウントを行います。この時点では、細胞を無菌状態に保つ必要はありません。細胞ペレットを穏やかにボルテックスしながら、100マイクロリットルの固定液を細胞ペレットに滴下します。

次に、チューブを氷上で15分間インキュベートします。3ミリリットルの細胞洗浄液を加え、スピン後に遠心分離で細胞を採取し、ボルテックスしながら溶液を吸引します。前回と同様に、100マイクロリットルの透過性溶液を細胞ペレットに滴下します。

次に、チューブを氷上で30分間インキュベートします。3ミリリットルの細胞洗浄液を加えます。遠心分離により細胞を回収し、溶液を吸引します。

浸透後、合計2回の洗浄を繰り返します。添付文献に記載されているように、P 1000ピペットを使用して細胞に400マイクロリットルの細胞維持溶液を注入し、ピペッティングで上下させて抗体染色を脱凝集します。次に、丸底チューブにセルストレーナーキャップを50マイクロリットルのセルメンテナンス溶液で事前に濡らします。

チューブを氷の上に置きます。セルストレーナーキャップは、細胞凝集体がフローサイトメーターを詰まらせるのを防ぎます。次に、細胞溶液を細胞ストレーナーキャップに移し、細胞懸濁液を重力で排出させます。

チューブの底をベンチトップで軽くたたいて、細胞がチューブに集められます。できるだけ早くチューブを氷に戻します。ストレーナーを250マイクロリットルの細胞維持液ですすいで、細胞の最大限の回復を確保します。

細胞を氷上に保持し、フローサイトメトリーで分析して生成された心筋細胞の品質を決定するまで、細胞を光から保護します。このプロトコルを使用して、細胞を10日間分化させ、TNNI 3 a、汎心筋細胞マーカー、TNNT 2 a横紋筋マーカー、およびIRX 4 A心室心筋細胞マーカーに対する抗体で染色しました。固定条件と透過性条件は、陽性細胞の割合を最大にするために、各抗体に対して最適化されていることに注意してください。

ヒストグラムは、ゲート細胞の99%がTNNI 3に陽性、96%がIRX 4に陽性であったことを示しています。さらに、この細胞は、TNNT 2、MLC 2 V、MLC 2など、心臓の分化の他のマーカーに対して非常に陽性でした。心筋細胞の純度と細胞同一性に関する主張は、TNNI 3とIRX 4に基づいていることに注意してください。

MC 2 VおよびMC 2 Aの染色は、発育中にチャンバーが制限されることはなく、TNNT 2は骨格筋にも見られます。ここに示されている活動電位は、全細胞パッチクランプを使用して、分化の46日目に自然に収縮した単一の心筋細胞から記録されました。活動電位プロファイルは、心室様心筋細胞が得られたことを示しています。

また、節様プロファイルのわずかな割合も観察されました。このビデオを見れば、多能性幹細胞から心筋細胞を高品質に培養する方法と、フローサイトメトリーで心筋細胞を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。一般に、この方法に不慣れな個人は、分化の開始前に幹細胞を高品質の単分子膜として維持する際に遭遇する共通の課題のために苦労します。

固定剤の取り扱いは危険で個人的なものであることを忘れないでください。この手順を実行するときは、白衣や手袋などの保護具を常に着用する必要があります。