バイオアッセイとしてウシ腸間膜動脈と静脈の切片を分離して使用すると、小腸で血管作用をテストするために
2014年10月7日
小腸は、しばしば、血流に影響を与える負栄養吸収に影響を与える可能性が毒素に暴露される。 multimyographおよび腸間膜動脈および静脈の分離株を使用して、目的の化合物または毒素は、血管作用についてスクリーニングすることができる。
この手順の全体的な目標は、ウシ腸間膜動脈と静脈の断面をマルチメートルグラフで分離して、実験化合物の血管活性のスクリーニングを可能にすることです。これは、最初に動物から腸間膜組織サンプルを収集することによって達成されます。2番目のステップでは、サンプルを洗浄し、容器を切片化します。
次に、切片をmyoグラフトにマウントし、平衡化します。最終ステップでは、単離された容器を目的の化合物に曝露します。最終的に、この動脈および静脈バイオアッセイは、化合物の血管活性とそれらが牛腸間膜血管内の血流に及ぼす影響を評価するために使用できます。
この技術の主な利点は、in vivoでの血流測定などの既存の方法と比較すると、この技術を使用すると、1匹の動物の組織を複数の化合物に同時にさらすことができることです。この方法は、フェスク、中毒症、エルゴティズムなどの血管収縮を引き起こす可能性のある非常に特殊な動物症候群に関する洞察を提供できますが、開発中の医薬品や天然物など、研究者が関心を持つ可能性のある他のシナリオにも適用できます。さらに、それはまた、牛の血管系だけでなく、実際には他の哺乳類の種からの血管系にも適用することができます。
腸間膜組織から血管を切除した後、一対の鉗子を使用して組織サンプルを切断面に置き、氷のように冷たいクレブスヘンツェルヘンズアイテバッファーに部分的に浸します。次に、5番の宝石、鉗子、ノイズを使用して、アイリスハサミは血管の周囲の脂肪と結合組織を慎重に解剖します。動脈と静脈を分離した後、セクションの一方の端にある血管の開口部を特定し、鉗子で血管を囲む筋膜を慎重につかみます。
次に、はさみの先端を隆起した筋膜の下にスライドさせて、はさみを容器と平行にして切り込みを入れます。最初の切開後、血管の両側を切り取り、脂肪と結合組織をさらに剥離し、血管を洗浄します。洗浄した血管を新しいクレブスヘンツェルライトバッファーのチューブに入れ、チューブを摂氏4度で最大24時間保存します。
準備ができたら、ティッシュスライサーを使用して、目的の血管の一貫した断面を目的の2ミリメートルセクションに取得し、各セクションを12.5倍の倍率で検査して、各サンプルに解剖および洗浄プロセス中に獲得した異常、分岐、バルブ、または表面的な損傷がないことを確認します。許容可能なスライスされた容器切片をKrebs Henzelライトバッファーに4°Cで最大30分間浸して保管します。次に、各サンプルの内腔にサポートをそっと挿入し、マイオグラフトのマイクロポジショナーを使用して張力を徐々に上げ、血管をマイオグラフトに取り付けます。
血管を2〜3グラムの読み取り値を超えて伸ばさないように注意してください。すべてのチャンバーが覆われたら、各チャンバーからバッファーを真空にし、5ミリリットルの新鮮なバッファーを補充します。すべての容器セクションが容器を入浴させた後、1.32モルの塩化カリウムの500マイクロリットルで1グラムの安定した休息張力を達成するために1.5時間平衡化しました。
塩化カリウムに対する最大反応が治療データの正規化に使用されるため、張力を手動で調整しないでください、張力がベースライン値の1グラムに戻るまで、15分間隔で溶液を新しいクレブスヘンツェルライトバッファーに交換します。.張力がベースラインに戻ったら、実験プロトコルに従って各チャンバーに25マイクロリットルのアリコートで標準液を追加します。最後の標準が追加されたら、9分間のタイマーを開始します。
インキュベーションの終わりに、処理を含む緩衝液をチャンバーから取り出し、各チャンバーに5ミリリットルの新鮮な緩衝液を追加します。次に、完了後に2.5分のタイマーを開始し、この2.5分のすすぎを繰り返します。2回目のすすぎの終わりにもう一度、チャンバーを吸引します。
次に、新しいバッファをもう一度追加した後、1分間のタイマーを開始して、2番目の標準エディションの開始までカウントダウンします。ここに示されている9分間のインキュベーション期間で観察されたように、治療の濃度が増加すると、組織の生存率を確認するため、実験終了時の塩化カリウムの添加が不可欠であるという基準に対する反応が徐々に増加します。このバイオアッセイは、小腸に栄養素を供給する血管や、吸収された栄養素を運び去る血管上の実験化合物の血管活性を評価するために使用できます。
例えば、この実験では、5回のヒドロキシトリプタミン治療後の動脈または静脈の収縮反応に差は見られませんでした。逆に、ノルエピネフリンの濃度の増加に対する腸間膜静脈の収縮反応は、腸間膜動脈の収縮反応よりも大きかった。この手順に続いて、研究者にとって特定の関心を有するアゴニストまたはアンタゴニストをバッファーに含めるように、メソッドをさらに変更することができる。
これにより、研究者は、非常に特異的な受容体の関与と、myo実験中に観察された血管応答の背後にあるメカニズムをよりよく理解することができます。このビデオを見れば、血管の収集、処理、分離の方法についてよく理解できるはずです。私の実験のために。
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概要
本研究では、さまざまな化合物の血管活性を評価するために、ウシの腸間膜動脈および静脈の単離に焦点を当てています。マルチマイオグラフを用いることで、これらの化合物が血流や栄養吸収にどのように影響するかを評価することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 血管生物学
- 毒性学
背景
- 小腸は、血流を阻害する可能性のある毒素にしばしばさらされています。
- 血管活動を理解することは、栄養吸収を評価する上で極めて重要です。
- 腸管膜血管は、胃腸の生理機能において重要な役割を担っています。
- 実験的なスクリーニングは、潜在的な治療化合物の特定に役立ちます。
研究の目的
- 研究目的でウシの腸間膜動脈および静脈を単離すること。
- 化合物の血管作用特性をスクリーニングすること。
- これらの化合物が血流に及ぼす影響を評価すること。
使用した方法
- ウシ由来の腸間膜組織サンプルの採取。
- 血管の洗浄および切断。
- マルチマイオグラフへの切片の固定および平衡化。
- 単離血管に目的化合物を添加し、評価を行う。
主な結果
- 腸間膜動脈および静脈の分離に成功。
- 有意な血管作用を持つ化合物の特定。
- 血流変化を評価する本手法の有効性の実証。
- 栄養吸収ダイナミクスの理解に対する潜在的な影響。
結論
- このバイオアッセイにより、化合物の血管活性を効果的に評価できます。
- 本手法は、胃腸の健康に関する研究に寄与することが可能です。
- 今後の研究により、同定された化合物の治療への応用を探索できる可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
このin vitroバイオアッセイにより、ウシの腸間膜動脈および静脈における血管緊張に対する化合物の影響を早期段階で評価することが可能となり、胃腸薬理学におけるターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスキングを支援します。単一の個体から血管系を単離し、複数の化合物を同時にテストすることで、予測の信頼性を高め、リード化合物同定時におけるin vivoモデルへの依存度を低減します。このアプローチは、腸管血流や栄養吸収に影響を及ぼす血管活性の懸念事項や治療候補物質を評価する上で、トランスレーショナルな価値を提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期段階の発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 腸間膜循環の抵抗血管および容量血管における化合物誘発性の血管反応性を評価することにより、治療仮説を検証します。
- 運用の価値： アゴニストおよびアンタゴニストのプロファイリングを通じて、受容体介在性の血管反応を明らかにし、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 戦略的価値： 創薬の早期段階で血管作動性のリスクまたは機会を特定することで、予測の信頼性を高め、ポートフォリオの選別を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 血管切片を分離してマルチマイオグラフに装着し、リアルタイムで収縮能を測定することで、下流のスクリーニングに向けた検証済みの生物学的システムを調製します。
- 運用の価値： 標準化され再現性のある定量的出力（張力変化など）を提供し、異なる処理条件下での信頼性の高い化合物評価を可能にします。
- 戦略的価値： スクリーニングの準備態勢と拡張性を高め、1つの動物組織サンプルにつき複数の化合物の試験を可能にすることで、アッセイのスループットとリソース効率を向上させます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：小腸の求心性および遠心性供給の脈管系を用いることで、生理学的な血流ダイナミクスを反映した疾患関連システムモデリングを提供します。
- 運用的価値：組織の生存能と一貫した実験条件を維持することで、創薬から前臨床検証までの継続性を確保します。
- 戦略的価値：化合物の曝露を胃腸の健康に関連する機能的な血管アウトカムに結びつけることで、リスク調整後の進展判断を容易にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このバイオアッセイは、標的結合からリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、生理学的に適切な状況下で、分子活性と組織レベルの血管反応を橋渡しする機能的リードアウトを提供します。
- ディスカバリーバイオロジー：関心のある化合物に対する血管作動性反応を測定することで、仮説検証とパスウェイの解明を支援し、血管ターゲットのメカニズム的なリスク低減を可能にします。
- スクリーニング：アッセイの準備状況を整え、定量的な収縮能測定を提供することで、濃度間および治療群間での化合物効果の比較を可能にします。
- アナリティクス：塩化カリウムによる最大反応で標準化したリアルタイムの張力データを生成し、血管作動性の効力と有効性の標準化された比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：胃腸疾患モデルに関連する、腸管の栄養吸収および灌流に関与する血管系をモデル化することで、前臨床での継続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：さまざまな化合物、種、および受容体プロファイリングキャンペーンに適応可能な、再利用可能な血管スクリーニングプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：組織ベースの機能評価を直接行うことで、血管反応におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：マルチマイオグラフを用いた制御された固定、平衡化、および正規化手順により、標準化と再現性を促進します。
- 戦略的価値：血管活性効果を早期に特定することで、意思決定（go/no-go）に情報を与え、資本効率の向上と後期段階における生物学的リスクの低減を実現します。
- ポートフォリオへの影響：胃腸疾患における血管系への影響や治療潜在性に基づいた、リスク調整済みの化合物優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 一貫した血管の調製および固定を行うために、血管の解剖、組織の取り扱い、およびマイオグラフ操作に関する専門知識が必要です。
- マルチマイオグラフシステム、温度制御された緩衝液灌流、および張力調節のための精密マイクロポジショナーへのアクセスに依存します。
- ユーザー間の再現性を確保するため、血管の切断、平衡化時間、および化合物の投与に関するプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なる血管の種類、種、または疾患モデルに本手法を適用する際は、特にベースラインの緊張度や受容体発現に関する適応上の検討が必要です。
- 単離後の血管の生存期間に制限があるため、最適化された緩衝液保存条件下で、適時実験を行う必要があります。
