Name: タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶ 酵母を用いたレポーターベースの成長アッセイでタンパク質分解速度を定量化する方法。液体培養における光密度測定と最小倍増時間の計算により、ユビキチン・プロテアソーム系によるプロテオリシスを体系的に解析できます。

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原稿を批判的にレビューしてくださったYuval Reiss博士とWilliam Breuer博士、そしてUra3-GFPスクリーニングアッセイの開発を支援してくださったOmri Alfassyに感謝します。また、プラスミドと株を提供してくださった Dr. M. Hochstrasser と Dr. R. Kulka にも感謝します。この研究は、イスラエル科学アカデミー(助成金786/08)と米国-イスラエル二国間科学財団(助成金2011253)によって資金提供されました。

1.細胞培養<ol><li> （a）は、URA3 -degron融合プラスミドの選択および維持のために、（b）は、付加的な代謝マーカーを含むプラスミドと、そのようなTry467（ 表2）のような適切な栄養要求性酵母細胞を形質転換する。 注：適切なプラスミドの例はYDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3（LYS2）（Deg1- UV）である。これはDeg1の含む融合タンパク質を含有する酵母組込みプラスミドである-酵母転写に由来しデグロン。係数MAT2 17、FLAGエピトープ-安定ERタンパク質、およびURA3 15,18（ 図3A） -イムノブロッティング、Vma12による検出。 （この研究でかつ適切なプラスミドのその他の例に用いられたプラスミドについては、表3を参照してください。） </li><li>プラスミドの選択および維持のために、アミノ酸の選択マーカーを欠いた適切な定義合成（SD）培地の下で寒天プレート内の細胞を保つ<s&gt; 19まで（例えば、Deg1 -UVは、SD-LYS選択培地で選択され、維持される）。 </li><li>定常期に達するまで、プラスミド維持のための適切な選択SD培地で30℃で細胞をO / Nを成長させる。検査されるべきサンプルの数（セクション2）に応じて、試験管内または96ウェルプレートに細胞を増殖させる。 </li></ol>分析のための2.細胞調製<ol><li>サンプル（N≤15）の少数をアッセイする場合には、細胞を希釈し、以下のように培地を交換する。 <ol><li> 96ウェルプレート（透明底）にウェルあたりSD培地150μlでO / N培養から細胞50μlを希釈する。ブランクは、培地のみを含むもので注意、最初のサンプルが指定される。 </li><li>マイクロプレートリーダーを用いて96ウェルプレート中の試料のOD 600値を決定します。 </li><li> WHから、希釈係数（×4）でOD 600読み取り値を乗算することにより、各ウェル内の実際のOD 600を計算するICH空白読書の値が減算される。ランベルト·ベールの法則に従って計算さ1cmの経路長を得るために、0.55で割ることによって得られた値を正規化する。標準的な96ウェルプレート中の細胞を200μlのOD 600を測定する際に注意し、この値は一定である。 </li><li> 0.25のOD 600を 、エッペンドルフチューブに移すために相当する量で、酵母細胞を得るために必要な正確な量を計算する。 </li><li> 1分間、高速（12000×gで）で細胞をスピンダウン。 </li><li> 0.25のOD 600を得るために、（セクション3.1を参照）上清を除去し、適切な選択培地の1ミリリットル中に細胞を懸濁します。 </li><li> 96ウェルプレート中の新しいウェルに希釈された菌株の200μlのを転送します。 </li></ol></li><li>サンプル（N&gt; 15）の多数は、試験しようとする場合、細胞を希釈し、以下のように、前のOD 600を測定することなく、培地を交換する。 <ol><li>静止細胞の10μlのを転送（セクション3.1を参照）、適切な選択培地190μlの（希釈1:20）を含む新しい96ウェルプレートに96ウェルプレートに、O / Nで増殖させた。 </li></ol></li></ol>選択条件下で液体培養3.成長動態（GILS） <ol><li>のUra3-デグロンレポーターを用いた成長測定のために、次のメディアを使用します。 <ol><li>非制限的な条件の下で酵母増殖のポジティブコントロールのための、（セクション1.2を参照）、プラスミドの選択SDメディアを使用しています。ないプラスミドの選択が必要でない場合、例えば、Deg1 -UV、必要なすべてのアミノ酸（完全なSD）を含有するSD培地として組込みプラスミドを使用するときに使用することができる。 </li><li>制限された条件下での増殖を測定する実験試料については、SD-URA培地を使用しています。 </li></ol></li><li>マルチモードマイクロプレートリーダーの設定：15分間30℃で、OD 600の測定間隔のインキュベーション温度、1分毎に7分の軌道と線形振盪サイクル&lt;BR /&gt;注：このデュアルモード揺れ、細胞の均一な分布が得られるように最適化された。しかし、他の揺れモードやさえなしに振とうも同様に動作する可能性があります。 </li><li> 30℃で細胞をインキュベートし、マイクロプレートリーダーO / Nまたは細胞が静止期（12~24時間）に達するまで。 </li><li>スプレッドシートファイルに生データをエクスポートします。 </li><li> （;詳細はセクション4を参照するための最小限の倍加時間（MDT））細胞がその人口規模を倍増するためのMDTcalc、（時間で）最小限の時間を計算し、カスタマイズされたソフトウェアプログラムを使用して、酵母の増殖速度を決定する。 </li></ol>最小限の倍加時間（MDT）4.計算：MDTcalcアルゴリズムの原則 NOTE：MDTcalcアルゴリズムの原理は、SD完全培地中で増殖させTry467酵母細胞（ 表2）の代表的なサンプルを使用して、データスプレッドシート、および成長のプロットを示し、 表1および図1に示されている、のrespectively。 <ol><li>サンプルウェルで得られた測定値のそれぞれから、それぞれのウェルにおいて得られたOD 600空白値を、減算します。 0.55によって得られた差分を分割する（96ウェルプレートの場合）の光路長を補正する。最終的な値（ 表1、トランス）プロット時間に対して実際の酵母増殖曲線（OD 600 /時間）（ 図1A）を生成する。 </li><li>非線形曲線（ 図1B）に対数増殖期に変換するために変換された値のそれぞれについてのlog 2（OD 600）を計算する。 </li><li>時間0で開始し、N &lt;10（; 図1C、表1、スロープ）まで、一度に一つの時点を移動する10の時点間隔の傾きを算出する（N = 10）。 </li><li>倍増する細胞集団に要する時間が取得する各傾きの逆数の値を計算した（ 表1、1 /勾配; 図1C）。最小限の計算MDT（; 図1C、表1、黒い四角形）を決定する1 /スロープ値。選択された時間間隔からのサンプル中の細胞（ 表1、1 /スロープ、黒い四角形）について計算MDTを抽出する（赤い矩形によって概説表1、1B、1D図 ）。 NOTE：SD-URA培地上での細胞増殖の速度は、MDTに反比例する。 </li></ol> 5. MDTcalcの使い方<ol><li>コンピュータ内の指定したフォルダに補充プログラムファイルをコピーします。 </li><li>成長データを含むスプレッドシートファイルを保存して閉じていることを確認してください。スタート画面が表示されます確認するMDTcalcアプリケーションプログラムを開きます。 <ol><li> 図2に示されているように、必要な情報を挿入します。 <ol><li> 「ファイルパス &#39;の下では、スプレッドシートファイルを検索するために右の四角形をクリックしてください。 </li><li>ここで、t &#39;シート名&#39;の下では、スプレッドシートの名前を書く生データが置かれている彼。 </li><li> 「開始位置」の下では、スプレッドシートが最初のサンプルの時間0の座標挿入します。 </li><li> 「時間列」の下では、時点カラム（時間は秒単位で提供されるべきである）の場所を定義する文字を挿入します。 </li><li> 「空白列 &#39;の下では、空欄（通常は必ずしもそうではない中で96ウェルプレートのA1）の場所を定義する文字を挿入します。 </li><li> 「OD値」の下では、MDT計算（通常は0.15〜0.25）の開始に必要な最小限の変換されたOD 600値を選択します。 MDTのみ定義さOD 600値以上に達した試料について計算されるように、この値を設定すると、過剰な希釈のラグフェーズにおける培養のためのMDTの計算を防止する。 </li></ol></li><li>最後の値が入力されると、画面の下部にある「計算」ボタンを押してください。右側のプログレスバーが徐々にgまで変化していることを確認してくださいREEN。計算プロセスの間、スプレッドシートファイルを開かないでください。 </li><li>スプレッドシートにMDT計算の完了時に画面上に自動的に表示されたデータの2セットをエクスポートします。最小限のOD値試験に合格するために、各ウェルの（a）MDT値（セクション5.2.1.6に設定されたように）とMDTを算出し、そこから間隔の（b）は、初期時点（スタート：データが含まれていることを確認時間）。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
<li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+the+cell+cycle%3A+with+this+RING+I+do+thee+destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li>
<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li>
<li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica.%2C+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li>
<li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li>
<li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms%3A+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li>
<li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope%2Fendoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li>
<li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li>
<li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li>
<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
<li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li>
<li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuthrie%2C+C+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. 194, Academic Press. (1991).</li>
<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、相対的な蛋白分解速度を決定するための細胞増殖に基づくアッセイを記載し、（GILS） &#39;選択的条件下で液体培養での成長速度」と呼ばれる。 、これは、セットアップが簡単で、データ収集および解析は、簡単であり、それは非常にモジュール化されている：GILSアッセイは、いくつかの利点を有する。したがって、GILSハイスループットアプリケーションのための自動化に適応させることができる、ユーザフレンドリーなマルチウェルプレート形式で複数のサンプルを同時に適用することができる。最も重要なことは、GILSは非常に、再現性の定量的かつ堅牢なデータを提供し、陽性/陰性の増殖について選択寒天プレートに基づく成長アッセイよりも柔軟性があります。また、GILSは、関連するUPSコンポーネントまたはデグロンの活性を反映して、タンパク質分解速度または定常状態レベルの小さな変化を検出できるように非常に敏感である。最後に、GILSアッセイはgrowtと比較して有意に短い成長期（&lt;12時間）を必要とする寒天プレート上の時間アッセイ（通常は2~4日）。 GILSアッセイは、タンパク質分解を研究す...

ユビキチン - プロテアソーム分解系は、全ての真核生物におけるタンパク質恒常性の維持に関与している主要な調節機である。 UPSは、最初にポリユビキチン標識タンパク質は26Sプロテアソームによって分解された後、標的タンパク質に複数のユビキチン分子をコンジュゲート。ほとんどの場合、ユビキチン媒介性分解のための律速段階は、E2は酵素を結合させると、E3は酵素（E3リガーゼ）1を連結することによって仲介される、基質ユビキチン化である。結果的に、特定のタンパク質の細胞内安定性は、ユビキチン抱合とその同族ユビキチン化酵素の活性に対する感受性を反映している。 E3リガーゼは、UPSの主な基質認識コンポーネントです。このように、これらの酵素は、その安定した対応2で露光存在しないかのいずれかであるそれらの基質内デグロンを認識する。細胞周期mの例えば、多くの規制当局USTのために細胞周期の進行を維持するために一時的に特定の方法で合成され、分解される。これらのタンパク質の分解は、多くの細胞シグナル調節キナーゼ3,4によって媒介されるリン酸化によって制御される。一方、異常に折り畳まれたタンパク質は、不可解なデグロンを通じて認識される。これらは通常、天然の構造に隠されていると構造摂動時にさらされている領域である。このようなデグロンは、疎水性ドメイン5-7と本質的に無秩序セグメント8が含まれています。 網状赤血球溶解物9でのファンダメンタルズのタンパク質分解および特性のためのユビキチンシステムの独創的発見以来、酵母遺伝学は、ユビキチンシステム10の構成要素の多くを発見に尽力した。 UPSによるタンパク質分解の体系的な分析のためのモデル生物として酵母の成功は、UPSが高いという事実に主に起因しているLyは実験システムとしての従順と相まって、すべての真核生物において保存4。実際、酵母ベースのシステムは、一般的にユビキチン化機構の作用メカニズムを解読するために使用される。 生化学的手段によってタンパク質分解を研究することは、通常、細胞抽出物の調製を必要とします。動物細胞タンパク質、タンパク質相互作用及び機能を維持する比較的穏やかな条件下で抽出することができるが、酵母11ロバスト細胞壁の存在は、タンパク質の回収に影響を与える可能性がかなり厳しい破壊条件を必要とする。実際、酵母細胞破壊のための異なる手順が正しく、それらの相対的な細胞豊か​​さを表す量で完全なタンパク質を回復する能力がかなり異なる。さらに不正確さは特定のタンパク質の分解速度を決定するために使用されるメソッドの違いに固有のものである：イム続く代謝標識ベースの「パルスチェイス」実験munoprecipitation、特異的タンパク質12を単離するために、多くの場合、厳密に定量的ではない。タンパク質の分解は、この方法によって比較されたときにこのようにして、余分な注意が結果の解釈に注意すること。この欠点を回避するために、代替のシクロヘキシミド（CHX）追跡アッセイは、12を用いることができる。このアッセイでは、翻訳阻害剤は、細胞培養物に添加し、タンパク質の定常状態レベルの時間的変化は、続いてモニターされる。タンパク質合成の長期の阻害は、細胞傷害性であるようにもかかわらず、CHXの使用は、比較的短い半減期（&lt;90分）を有するタンパク質に限定される。注目すべきことに、上記のアッセイの両方が常に利用可能でないタンパク質に特異的な抗体の使用を必要とする。 これらの技術的限界を克服するために、研究者は、細胞抽出と直接タンパク質の処理を必要としないいくつかのアプローチを開発しました。 1つのアプローチは栄養要求まことにの確立に基づいています必須の代謝酵素をコードする遺伝子の欠失によって得られる目株。このような遺伝子は、OMPデカルボキシラーゼをコードHIS3、LEU2、LYS2およびTRP1、アミノ酸生合成に必要な酵素のための符号化、並びにURA3（のUra3）、ピリミジンリボヌクレオチド生合成の重要な酵素が含まれる。 URA3広くタンパク質分解の研究で使用されている。これらのアッセイでは、のUra3の構成的発現は、ウラシル欠損培地中で13 URA3細胞の増殖を救出。その結果、デグロンの融合を通してのUra3を不安定するとウラシルを欠く最小培地で細胞増殖を減少させることができる。この方法は、劣化の識別を含む、様々なタンパク質分解研究で5決定基に使用されている、E3は14リガーゼ補助ユビキチンは15因子および新規UPSのデグロン16の発見。これらの方法の全ては、アッセイの読み出しとして、寒天プレート上の細胞増殖を用いた。ただし、tは彼の成長基準（ポジティブ/ネガティブの成長）、堅牢で効率的な、ほとんどが定性的であるとデグの効力または種々の補助劣化要因の相対的寄与を評価するために重要である定量的情報を提供していませんしながら。 そこで開発され、融合系-degron URA3によるタンパク質分解の体系的かつ定量的な分析を可能にする酵母ベクターおよびスクリーニング方法を利用している。プロトコルは、選択的条件下で液体培養物（GILS）および標準的な増殖曲線の生成に成長速度を測定扱いやすいアッセイに基づいている。ラグ、指数（対数）と固定相 - 酵母増殖動態は、3つの主要な相によって特徴づけられる。のUra3-デグロンの発現のレベルによって決定される選択条件下で対数期、中酵母複製動態の計算は、公平な定量的測定oをを提供fはタンパク質の分解。この方法は、複数の株に同時に複数のUPS基質の分解速度を測定し、比較することと、様々な条件の下で適用することができる。

<table><tbody><tr><td>Difco 酵母窒素塩基 w/o アミノ酸および硫酸アンモニウム</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>SD最小培地での酵母増殖用。&nbsp;供給されるアミノ酸は次のとおりである: アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td>最高利用可能な純度&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>他の互換性のあるブランドは、</td></tr><tr><td>Cyclohexamide&nbsp;</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>C7698</td><td>ワーキングコンク0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>インフィニット 200 PRO シリーズ</td><td>テカン</td><td></td><td>酵母のインキュベーションやOD600測定用。他の互換性のある温度制御リーダーを使用できます。</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>実験用ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

ユビキチン - プロテアソーム系（UPS）によるタンパク質分解は、すべての真核生物におけるタンパク質ホメオスタシスのための主要な調節機構である。細胞内タンパク質分解を決定する標準的なアプローチは、タンパク質の減少の速度論に従うための生化学的アッセイに依存している。そのような方法は、多くの場合、面倒で時間がかかり、複数の基板や劣化状態を評価することを目的とした実験に、したがって適していない。別の方法として、細胞増殖に基づくアッセイは、定量的にタンパク質レベルの相対的変化を決定することができないそれらの従来のフォーマット、エンドポイントアッセイであることが、開発されてきた。 ここでは、忠実に酵母細胞増殖速度にそれらを結合することによって、タンパク質分解速度の変化を決定する方法を説明する。この方法は、URA3のウラシル要求性酵母細胞が外因的に発現されるレポータータンパク質によって救助され-deleted確立選択システムに基づいています、本質的なURA3遺伝子および分解行列式（デグ）の間の融合から成る。レポータータンパク質は、その分解速度は、デグロンによって決定され、一方、その合成速度が一定になるように設計されている。ウラシル欠損培地における細胞増殖はUra3遺伝子の相対的なレベルに比例するように、成長速度は、レポータータンパク質の分解に完全に依存している。 この方法は、正確に細胞内タンパク質分解速度の変化を測定する。 （a）は、E2結合酵素の構造と機能は、（c）の同定と新規デグロンの特性を分析し、タンパク質分解、（b）は、既知のユビキチン結合因子の相対的寄与を評価する：これは、に適用した。それはまた、他の細胞経路の機能に関連するタンパク質レベルの変化を監視するに適合させることができるようにdegron- URA3ベースのシステムの適用は、タンパク質分解フィールドを越え。

レポーター基質の分解にDoa10経路の酵素の役割を調査する それは伝統的な分解アッセイと比較したGILS方法の妥当性をテストするには。この実験は、ER-膜の成分の相対的な寄与を評価するローカライズされたタンパク質の品質管理レポーター基質Deg1- VU（ 図3A）の分解に対して20,21複雑Doa10 E3リガーゼ。 Deg1- VUプラスミドは、 野生型細胞に、またはその後にCHXチェイスアッセイ6により決定されたE2結合酵素、UBC7（UBC7）及びタンパク質の安定性のための遺伝子を欠く細胞に組み込まれた。抗FLAGイムノブロットは、 野生型細胞 （ 図3B）には存在しなかったUBC7細胞において安定Deg1 -vuタンパク質バンドを明らかにした。 野生型細胞におけるDeg1</em...

ここでは、ユビキチン-プロテアソームシステムによるタンパク質分解の相対的な速度を定量化するための堅牢な生物学的アッセイについて説明します。アッセイの読み出しは、液体培養における酵母の増殖速度であり、これは必須代謝マーカーに融合した分解シグナルを含むレポータータンパク質の細胞レベルに依存します。

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

この手順の全体的な目標は、タンパク質分解速度の変動を液体培養における酵母増殖の動態に結合することにより、体系的な方法でタンパク質分解速度の変動を決定することです。これは、まず、代謝マーカーに結合した分解シグナルからなるレポータータンパク質を、適切な選択培地で一晩から静止相まで発現する細胞を増殖させることによって達成されます。次に、細胞の光学密度を測定して細胞の成長速度を決定し、次に、指定されたソフトウェアプログラムを使用して、成長速度論から対数期の細胞の最小倍加時間を計算します。最終的には、計算された最小倍加時間を使用して、タンパク質分解速度の変動を定義できます。この技術の主な利点は、シクラメートやパルスチェイス分解アッセイなどの既存の方法よりも簡単に設定すると、当社の技術は簡単にセットアップできます。データの取得と分析は簡単で、エッセイのデザインは非常にモジュール化されています。この方法は、ユビキチンポットシステムによるミスフォールドポットの認識に必要な要素など、ポット劣化分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、ユビキチンがサブセットから除去されるタンパク質を特定するためのスクリーニングを行いたいと思ったときでした。そこで、複数のサンプルを比較する簡単な方法を確立して、分析用の細胞を準備しました。まず、TRY 4 67などの適切なox萎縮性酵母細胞を、U three Deron融合を含むプラスミドと、プラスミドの選択と維持のための追加の代謝マーカーで形質転換します。プラスミドの選択と維持のために、アミノ酸選択マーカーを欠いた適切な合成定義培地の下で寒天プレート上で細胞を増殖させ、生存コロニーをパッチに移し、パッチから液体培地に細胞を移し、固定相に達するまで摂氏30度で一晩インキュベートします。次に、15サンプル以下の場合は、一晩培養した細胞の50マイクロリットルを、ウェルあたり150マイクロリットルの合成定義培地で希釈します。透明な底部の96ウェルプレートで、マイクロプレートリーダーを使用してサンプルのOD600値を決定します。次に、0.25のOD 600に相当する量で酵母細胞を得るのに必要な正確な量を計算した後、Gと室温で1分間細胞をスピンダウンし、適切な選択培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁して0.25のOD 600を取得し、希釈した株の200マイクロリットルを新しい96ウェルプレートの1つのウェルに移します15より大きい場合サンプルはテストされます。一晩成長させた静止細胞の10マイクロリットルを、190マイクロリットルの適切な選択培地を含む新しい96ウェルプレートの1つのウェルに移し、選択条件下での形質転換酵母細胞の成長動態を測定する。次に、マルチモードマイクロプレートリーダーをインキュベーション温度30°C、OD600の測定間隔を15分、軌道振とうと線形振とうサイクルを7分ごとに1分に設定します。次に、細胞をマイクロプレートリーダーで摂氏30度で12〜24時間インキュベートします。細胞が固定相に到達したら、生データをスプレッドシートファイルにエクスポートし、MDT Calcを使用して酵母の増殖速度を決定します。成長データを含むスプレッドシートファイルが保存され、閉じていることを確認します。次に、ファイルパスの下にあるMDT Calcアプリケーションプログラムを開きます。長方形をクリックして、シート名の下にスプレッドシートファイルを見つけます。生データの開始位置の下にあるスプレッドシート名を入力します。時間のスプレッドシート座標を入力し、時間列の下に最初のサンプルのゼロを入力します。空白の列の下に、時点の列の位置を定義する文字を秒単位で入力し、空白の列の位置を定義する文字を入力します。例えば、96ウェルプレートのAウェル1ウェル。次に。[OD 値] で、MDT 計算の開始に必要な変換された最小の OD 600 値を選択します。通常、定義されたD 600値以上に達するサンプルに対してのみMDTが計算されるように、0.15〜0.25です。最後の値が入力されたら、計算ボタンをクリックして、右側の進行状況バーが徐々に緑色に変わることを確認します。最後に、MDT 計算の完了時に画面に自動的に表示される 2 つのデータ セットを新しいスプレッドシートにエクスポートします。データに、最小OD値テストに合格した各ウェルのMDT値と、この代表的な実験でMDTが計算された間隔の開始時間が含まれていることを確認します。野生型と種々の変異株との間のタンパク質分解の動態の相対的な差を、最初に野生型U、BBC6、デルタ、UBC7デルタ、またはDOA10デルタ細胞を発現するD、1、VMAU、3を発現するデルタ細胞を合成定義の完全培地で増殖させた。次に、えらを測定するために、細胞を洗浄し、合成定義培地でインキュベートしました。合成定義の全培地で増殖したすべての株について、ウラシルを差し引く同様の成長曲線および計算されたMDTが観察されたが、これは、調査した遺伝子のいずれかの欠失が細胞増殖に影響を与える可能性を除いた。対照的に、合成定義培地からウラシルを除いたインキュベーションでは、野生型細胞の増殖が不十分であったのに対し、変異株ではわずかな増殖欠陥のみが観察されました。UBCセブンは、DEG 1、VMAU、3分解に絶対的に必要であり、さまざまなE 2変異体の部分的な影響さえも正確に評価することができます。したがって、活性部位変異体を有するUBC7を発現する細胞では急速な増殖速度が観察され、C89sおよびN81 A.In、間接的にDEGを阻害すると予測される2つの変異体、VMA ETHの3分解V20 5GおよびH90 4Kも野生型UBC7と比較して細胞増殖を促進することがわかった。 活性部位変異体よりも程度は低いですが。したがって、えら法は、レポーター基板の安定性に対するさまざまな劣化因子の相対的な寄与の正確な測定に使用できます。この手順を試みる際には、プロトコルがタンパク質分解速度のわずかな違いに敏感であることを覚えておくことが重要です。これは利点ですが、この手順に従って使用するDeronの設計と検証に注意を払う必要があるということも意味します。ハイスループット蛍光顕微鏡などの他の方法を実行して、レポータータンパク質の凝集傾向は何かなどの追加の質問に答えることができます。このため、レポーターにはGFPタグも含めることをお勧めします。このビデオをご覧いただければ、MICROPLATEリーダーと当社指定のソフトウェアプログラムを使用して、タンパク質分解速度の変化を体系的に判断する方法を十分に理解できるはずです。

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生物学

生きた細胞内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターするための方法が記載されている。デグロン - 不安定化のGFP（GFP-DGN）と安定したGFP-dgnFS融合タンパク質が生成され、レンチウイルス発現ベクターを用いて細胞内に伝達される。この手法は、ユビキチン -...

デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

このビデオでは、プロテアソーム阻害剤を使用した細胞ベースのタンパク質凝集アッセイを実演します。これにより、蛍光標識に融合した誤って折りたたまれた突然変異タンパク質がユビキチン依存性のプロテアソーム分解を受け、細胞質内に蓄積するのを防ぎます。次に、タンパク質凝集体を蛍光顕微鏡で可視化し、定量します。...

Protein Aggregate Formation Assay:プロテアソーム阻害剤による誘導時に培養細胞内のタンパク質凝集を検出および定量する方法

このビデオでは、シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質の分解アッセイについて説明しています。この方法は、誤って折り畳まれたタンパク質のダイナミクスを研究し、タンパク質の代謝回転の詳細なメカニズムを明らかにするのに役立ちます。...

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

標的タンパク質分解は、細胞機能の主要な調節機構を表す。その後、26Sプロテアソームのために、分子「タグ」を提供する標的タンパク質にユビキチン鎖が付加し保存され、ユビキチン-プロテアソーム経路を介して行われます。ここでは、タンパク質のプロテアソーム分解のための、シンプルで信頼性の高い無細胞アッセイを記述します。...

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遺伝子レポーターアッセイは、DNA配列とその遺伝子調節活性との関係を解剖するための確立された強力なツールです。候補の調節要素を、同定配列タグを持つレポーター遺伝子に結合させることで、これらのアッセイの大規模な並列化が可能になります。...

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この記事では、タンパク質分解の遺伝的要件を決定するための酵母増殖ベースのアッセイについて説明します。また、ウェスタンブロッティングに適した酵母タンパク質の迅速な抽出方法を示し、分解要件を生化学的に確認します。これらの技術は、さまざまなタンパク質の分解を監視するために適応させることができます。...

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

このレポートは、ウェスタンブロットまたは蛍光ベースのアッセイによって、誤って折り畳まれたタンパク質の分解速度を測定するためのプロトコルを説明しています。この方法は、他のミスフォールドタンパク質の分析やハイスループットスクリーニングに適用できます。...

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イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

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学ぶ 酵母を用いたレポーターベースの成長アッセイでタンパク質分解速度を定量化する方法。液体培養における光密度測定と最小倍増時間の計算により、ユビキチン・プロテアソーム系によるプロテオリシスを体系的に解析できます。

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

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