タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

この手順の全体的な目標は、タンパク質分解速度の変動を液体培養における酵母増殖の動態に結合することにより、体系的な方法でタンパク質分解速度の変動を決定することです。これは、まず、代謝マーカーに結合した分解シグナルからなるレポータータンパク質を、適切な選択培地で一晩から静止相まで発現する細胞を増殖させることによって達成されます。次に、細胞の光学密度を測定して細胞の成長速度を決定し、次に、指定されたソフトウェアプログラムを使用して、成長速度論から対数期の細胞の最小倍加時間を計算します。

最終的には、計算された最小倍加時間を使用して、タンパク質分解速度の変動を定義できます。この技術の主な利点は、シクラメートやパルスチェイス分解アッセイなどの既存の方法よりも簡単に設定すると、当社の技術は簡単にセットアップできます。データの取得と分析は簡単で、エッセイのデザインは非常にモジュール化されています。

この方法は、ユビキチンポットシステムによるミスフォールドポットの認識に必要な要素など、ポット劣化分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、ユビキチンがサブセットから除去されるタンパク質を特定するためのスクリーニングを行いたいと思ったときでした。そこで、複数のサンプルを比較する簡単な方法を確立して、分析用の細胞を準備しました。

まず、TRY 4 67などの適切なox萎縮性酵母細胞を、U three Deron融合を含むプラスミドと、プラスミドの選択と維持のための追加の代謝マーカーで形質転換します。プラスミドの選択と維持のために、アミノ酸選択マーカーを欠いた適切な合成定義培地の下で寒天プレート上で細胞を増殖させ、生存コロニーをパッチに移し、パッチから液体培地に細胞を移し、固定相に達するまで摂氏30度で一晩インキュベートします。次に、15サンプル以下の場合は、一晩培養した細胞の50マイクロリットルを、ウェルあたり150マイクロリットルの合成定義培地で希釈します。

透明な底部の96ウェルプレートで、マイクロプレートリーダーを使用してサンプルのOD600値を決定します。次に、0.25のOD 600に相当する量で酵母細胞を得るのに必要な正確な量を計算した後、Gと室温で1分間細胞をスピンダウンし、適切な選択培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁して0.25のOD 600を取得し、希釈した株の200マイクロリットルを新しい96ウェルプレートの1つのウェルに移します15より大きい場合サンプルはテストされます。一晩成長させた静止細胞の10マイクロリットルを、190マイクロリットルの適切な選択培地を含む新しい96ウェルプレートの1つのウェルに移し、選択条件下での形質転換酵母細胞の成長動態を測定する。

次に、マルチモードマイクロプレートリーダーをインキュベーション温度30°C、OD600の測定間隔を15分、軌道振とうと線形振とうサイクルを7分ごとに1分に設定します。次に、細胞をマイクロプレートリーダーで摂氏30度で12〜24時間インキュベートします。細胞が固定相に到達したら、生データをスプレッドシートファイルにエクスポートし、MDT Calcを使用して酵母の増殖速度を決定します。

成長データを含むスプレッドシートファイルが保存され、閉じていることを確認します。次に、ファイルパスの下にあるMDT Calcアプリケーションプログラムを開きます。長方形をクリックして、シート名の下にスプレッドシートファイルを見つけます。

生データの開始位置の下にあるスプレッドシート名を入力します。時間のスプレッドシート座標を入力し、時間列の下に最初のサンプルのゼロを入力します。空白の列の下に、時点の列の位置を定義する文字を秒単位で入力し、空白の列の位置を定義する文字を入力します。

例えば、96ウェルプレートのAウェル1ウェル。次に。[OD 値] で、MDT 計算の開始に必要な変換された最小の OD 600 値を選択します。通常、定義されたD 600値以上に達するサンプルに対してのみMDTが計算されるように、0.15〜0.25です。

最後の値が入力されたら、計算ボタンをクリックして、右側の進行状況バーが徐々に緑色に変わることを確認します。最後に、MDT 計算の完了時に画面に自動的に表示される 2 つのデータ セットを新しいスプレッドシートにエクスポートします。データに、最小OD値テストに合格した各ウェルのMDT値と、この代表的な実験でMDTが計算された間隔の開始時間が含まれていることを確認します。

野生型と種々の変異株との間のタンパク質分解の動態の相対的な差を、最初に野生型U、BBC6、デルタ、UBC7デルタ、またはDOA10デルタ細胞を発現するD、1、VMAU、3を発現するデルタ細胞を合成定義の完全培地で増殖させた。次に、えらを測定するために、細胞を洗浄し、合成定義培地でインキュベートしました。合成定義の全培地で増殖したすべての株について、ウラシルを差し引く同様の成長曲線および計算されたMDTが観察されたが、これは、調査した遺伝子のいずれかの欠失が細胞増殖に影響を与える可能性を除いた。

対照的に、合成定義培地からウラシルを除いたインキュベーションでは、野生型細胞の増殖が不十分であったのに対し、変異株ではわずかな増殖欠陥のみが観察されました。UBCセブンは、DEG 1、VMAU、3分解に絶対的に必要であり、さまざまなE 2変異体の部分的な影響さえも正確に評価することができます。したがって、活性部位変異体を有するUBC7を発現する細胞では急速な増殖速度が観察され、C89sおよびN81 A.In、間接的にDEGを阻害すると予測される2つの変異体、VMA ETHの3分解V20 5GおよびH90 4Kも野生型UBC7と比較して細胞増殖を促進することがわかった。 活性部位変異体よりも程度は低いですが。

したがって、えら法は、レポーター基板の安定性に対するさまざまな劣化因子の相対的な寄与の正確な測定に使用できます。この手順を試みる際には、プロトコルがタンパク質分解速度のわずかな違いに敏感であることを覚えておくことが重要です。これは利点ですが、この手順に従って使用するDeronの設計と検証に注意を払う必要があるということも意味します。

ハイスループット蛍光顕微鏡などの他の方法を実行して、レポータータンパク質の凝集傾向は何かなどの追加の質問に答えることができます。このため、レポーターにはGFPタグも含めることをお勧めします。このビデオをご覧いただければ、MICROPLATEリーダーと当社指定のソフトウェアプログラムを使用して、タンパク質分解速度の変化を体系的に判断する方法を十分に理解できるはずです。