Name: Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶ神経血管リモデリングの解析手法。entorhino海馬器官型スライス培養を用いて虚血性脳損傷における神経細胞と血管の変化を同時に観察し、神経血管相互作用のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は、バーゼル大学、生物医学科、スイス国立科学財団（31003A_141007）によってサポートされていました。マルクスSaxerは、技術的な支援を行いました。

動物実験は、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令に準拠して実施した（63分の2010 / EU）、レビューとスイス当局によって許された。 1器官Entorhino海馬スライス培養を設定する<ol><li>静的インキュベーション法4,11を使用して、生後4日目（P4）仔マウスからentorhino海馬器官型スライス培養（EHOSCs）を準備します。ここでは、のC57Bl6及びCB6F1マウスを使用しています。 <ol><li> すなわちスライス培養の調製のためのマウスの仔あたり約30分、6仔マウスの同腹のための3時間を取る。滅菌手術器具との層流ベンチで滅菌条件下ですべての手順を実行します。 </li><li> septo時空軸に沿ったスライスの位置からの干渉の可能性を回避するためには、中隔の半分しか海馬スライスを使用しています。特に明記しない場合は、室温ですべてのステップを実行する。 </li></ol></li><li>トンカットオフ彼は外科ハサミでP4マウスの子犬の頭。無麻酔は、このステップは必要ありません。 <ol><li>脳の周りの頭蓋骨を外し、大脳半球と中脳の尾の端部との間に亀裂を識別します。慎重に頭蓋骨から脳への脳の吻側の一部を除去して、L-グルタミンの安定化された形を添加したMEMからなる氷のように冷たい準備培地に入れてください。 </li></ol></li><li>氷冷準備媒体中に浸漬された脳を持つ実体顕微鏡下で解剖を続行します。皮質半球から残りの髄膜を除去します。半球の内側尾表面で海馬​​を特定し、脳の残りの部分から隣接嗅内皮質と一緒に分離する。 <ol><li>組織チョッパーに組織を移し、海馬のsepto - 時間軸に無菌状態の横方向の下で厚さ400μmのスライスをカット。 </li></ol></li><li> CE上のスライスを置きllの培養インサート（インサートあたり約6スライス）とインキュベーション培地のウェルあたり1mlで6ウェルプレートでそれらをインキュベートする（47ミリリットルMEMを25mlイーグル培地25mlのウマ血清1mlのグルタマックスIは、1mlの37℃、5％CO 2を含む加湿雰囲気中の滅菌10％グルコース溶液、pH7.3）で。メディア翌日、その後1週間に一日おきにアップを変更します。 </li></ol>再灌流を用いたin vitro低酸素及び酸素グルコース欠乏で 2 <ol><li>手順の正確な時刻表については、表1を参照してください。低酸素症またはOGDへの曝露の前に5日間（DIV5）の培養EHOSCs。 2％のB27サプリメント、1％のグルタマックス、追加の0.1％のグルコースを含むNeurobasal培地：この時点で、以下の組成を有する無血清培地、25％ウマ血清を含む培養培地から培地に切り替える。 </li><li>文献7でコンポーネントの.theの最終濃度を詳述したように、OGD媒体を準備すると、次のようになります。0.3のCaCl 2、70mMの塩化ナトリウム、5.25ミリモルのNaHCO 3、70mMのKClを、pH6.8の1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、2mMのMgSO 4を、および10mMスクロース。 2個の6ウェル組織培養プレートの各ウェルにOGD培地1mlを加える。 <ol><li>低酸素チャンバ中で1時間N 2でOGD培地を灌流した後、37℃のインキュベーター中でO / Nを密封し続ける。 </li><li>低酸素指標として嫌気ストリップを使用してください。ストリップの色は白にピンク色に変化する際に酸素を含まないことがメディアを考えてみましょう。 </li><li>低酸素症の誘導のために、グルコースの代わりにOGD培地と無血清培地を使用しています。使用前に、OGD媒体について上記で詳述したように、低酸素室でN 2で培地を灌流。 </li></ol></li><li>スライスはOGDに曝露される前に、30分間N 2で再度OGD培地を灌流する。 30分間のスライスに1 mg / mlのヨウ2μlのヨウ化物（PI）（2μg/ mlの最終濃度）ウェル当たりのソリューションを追加し、選択し実験のための唯一の健康なスライスは、PI陽性細胞の数が少ないことによって示されるように。 </li><li> 図1に示したOGD曝露と再灌流のスケジュールを使用します。15分間のいずれかの酸素のみ（低酸素）または酸素とグルコース（OGD）のスライスを奪う。 <ol><li>低酸素症またはOGDの誘導のために、OGD培地にスライスを転送し、低酸素室で15分間保つ。培養物をOGD媒体とバックへの定期的な媒体から切り替えたとき、インサートの両側に残っている全ての流体が離れて吸引されていることを確認します。 </li><li>低酸素症またはOGD後、含酸素無血清培地でOGD培地を交換し、培養液を5％CO 2、37℃での正規インキュベーター中で無血清培地中で3,24または48時間回復させる。細胞死の決定のために固定を再び前に、PIを追加します。 </li></ol></li></ol> Entorhino海馬器官型スライス培養の3薬理学的治療<ol><li> Cultur薬理学的治療への曝露の前に培養培地中で5日間（DIV5）の電子のEHOSCs。薬理学的治療OGD中または直後にスライスが無血清培地に移される際にOGD後のいずれかを起動します。 </li><li> OGDから保護するための治療法。 <ol><li> （15分間）OGD誘導中または直後に30分間のOGD誘導後培養培地に100μMの6-シアノ-7ニトロキノキサリン-2,3 - ジオン（CNQX）または1μMテトロドトキシン（TTX）を追加します。次に、固定の前48時間正常酸素無血清培地中でインキュベートする。 </li></ol></li><li>興奮毒性死の誘導のための治療。 <ol><li>インキュベーション培地スイッチ培養における5日後、30分間100μM（RS）-αアミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチル-4 - イソキサゾールカルボン酸（AMPA）を含む無血清培地である。 </li><li>吸引によりAMPAを含む培地を取り外します（インサート上の任意の残留培地を除去するために注意してください）​​、通常の無血清培地で新鮮なプレートにスライスを転送し、固定されるまで48時間保管してください。 </li></ol></li></ol> 4の固定および免疫染色Entorhino海馬器官型スライス培養<ol><li>ヨウ化プロピジウム（PI）染色。 <ol><li> 2μg/ mlの濃度で生きているスライスの培養培地への30分間のPIを追加する。蛍光光学系を備えた倒立顕微鏡で生きた文化を表示し、さらなる処理のためのスライスを選択します。免疫組織化学と組み合わせたPI染色のために、前の文化の定着にPI溶液に30分を追加します。 </li></ol></li><li>スライスの固定。 <ol><li> 6ウェルプレートから培地を除去し、各ウェルに、新たに調製した4％パラホルムアルデヒド（PFA）を3mlを加える。その後、冷蔵庫に6ウェルプレートを配置し、4℃でO / Nを修正。 </li><li>次の日、PFA溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライス3-4回洗浄する。 </li></ol></li><li>細胞培養i番目からスライスの除去フリーフローティングセクションの免疫組織化学のために手順をnsertブロッキング。 <ol><li>慎重に切り離し、サイズ0以下のアートペイントブラシを用いて培養インサートからスライスを削除します。 （10％正常ヤギ血清（NGS）および2％のTriton-X100を含むPBS）をブロッキング緩衝液で満たされた96ウェルプレートのウェルに各個別のスライスを転送する。オービタルシェーカーで一定の攪拌下、室温で2時間ブロッキングバッファー内のスライスにしてください。 </li></ol></li><li>スライス培養の免疫染色<ol><li>標識のため血管は1の希釈でポリクローナル抗ラミニンを使用します。200をPBSで1％NGSおよび0.5％トリトン-X100を含有する。 </li><li>ラベリングニューロンのために1の希釈で抗微小管結合タンパク質2（MAP2）を使用する：PBS中500は、1％NGSおよび0.5％トリトン-X100を含む。 </li><li>一定の攪拌しながら4℃で48時間、一次抗体とのスライスをインキュベートする。インキュベーション期間の後、3〜4回、0.5％トリトン-X100を含むPBS中でそれらを洗浄。 </li&gt; <li>二次抗体を希釈1：500のPBS、1％NGSおよび0.5％トリトン-X100を含有する。 Alexaの蛍光団結合二次抗体を用いた暗闇の中で、室温で2時間のスライスをインキュベートする。アレクサ350または488に結合させ、適切なヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体を使用してください。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、トリス緩衝生理食塩水（TBS）で切片を3回洗浄する;スライドガラス上にマウントし、モヴィオールでスライドをカバースリップ。 </li></ol></li><li>染色されたスライスの顕微鏡観察</li><li>落射蛍光装置と標準的な顕微鏡や共焦点顕微鏡のいずれかで染色されたスライスを表示します。適切なカメラを入れて撮影する。いくつかの画像では、明るい背景で暗く染色された血管を得るために、蛍光のコントラスト（ 図5および6）を反転させる。 </li></ol>培養における地域血管密度の5。決定<ol><li> vesseを定量化文献8に記載されているように、血管の交差に基づいて、Lの密度。 </li><li>これらの測定のためのラミニンのために染色したスライスを使用してください。各グリッドは、平方当たり100×100μmで、0.25ミリメートル2の全分野に等しく、6×6のグリッドで10倍の倍率の撮影した画像を重ね合わせる。 </li><li>オーバーレイCA1、CA3、DG、およびEC地域の3つのこのようなグリッド（ 図2）。グリッドの線と交差血管をカウントします。 </li><li>良い統計的関連性を持つ結果を得るために、各マウスの仔あたり3スライスを持つ3仔マウスからのデータを含む、少なくとも3つの独立した実験で測定を行う。 </li><li>各地域のグリッドからの血管交差の平均値を決定し、適切な統計ソフトウェアを使用して事後検定（p &lt;有意であると定義されている0.05）のようにボンフェローニ補正をANOVAにより統計分析を行う。 </li></ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
<li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two%3A+modeling+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurol+J%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li>
<li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures%3A+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li>
<li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4%2C+GDNF%2C+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li>
<li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li>
<li>Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+%E2%80%98ischemia%E2%80%99+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li>
<li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice%3A+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li>
<li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li>
<li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li>
<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
<li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

動物実験は1986年11月24日（609分の86 / EEC）の欧州共同体理事会指令に従って行われたとスイス当局によって審査し、許可された。著者らは、開示することは何もない。

ここに提示される方法で、海馬器官型切片培養は、損傷後の神経組織におけるプラスチックの変化を研究するための多目的ツールとして使用することができる。器官型スライス培養7、虚血6の後のニューロンの反応を研究するために過去に使用されてきた血管の変化の同時研究の新たな局面が大幅この方法の潜在的な用途を高める。単独のOGDまたは低酸素症の誘導は、器官型スライス培養ではなく単純な手段によって適用され、神経組織における信頼性と再現性の損傷につながることができます。さらに、スライス培養のアプローチだけでなく、虚血性挑戦の影響を研究することができますだけでなく、神経保護を目的とした潜在的な治療策のテストを行うことができます。スライス培養は、したがって、虚血性脳損傷の研究のための魅力的で重要なツールです。 ここで紹介する方法は、ヘクタールすべての研究所のために実装するのは簡単です中枢神経系のスライス培養といくつかの経験をヴィング。 OGDまたは低酸素症を適用すると、再現性のある結果を達成するためにN 2を含む培地を注意深く平衡化を必要とす...

中枢神経系、血管系による酸素とグルコース供給の喪失または減少に特に敏感である。脳への血液供給のさえかなり短い中断は、一般的な脳卒中症候群につながる、関連する脳領域の機能が永久に失わを誘導することができる。原発被災地のニューロンの喪失に加えて、一般的に二次被害を通じて追加の遅延した神経細胞の損失がある。残念ながら、これまで、二次神経細胞死の低減のための神経保護治療は1入手できなかった。二次的損傷のメカニズムを研究するための研究努力は、中大脳動脈閉塞および血栓性閉塞、さまざまな技法のような脳虚血の動物モデルの使用に依存している（最近のレビューのために2を参照）。並行して、またにより制限および動物モデルの使用で倫理的な問題のために、さまざまなCNS組織の器官型切片培養は、STUを可能にするように使用されている負傷3-5のさまざまなタイプに神経細胞の反応のDY。 虚血性脳損傷を模倣する条件下でニューロンの反応を研究するために、酸素グルコース欠乏（OGD）のモデルシステムが開発されている。このモデルでは、スライス培養物を一時的にグルコースを欠いており、酸素の非存在下で、窒素ガスで平衡化した培地に曝露される。このような治療では、 インビボ 6,7 における虚血性傷害後に観察されたものとかなり類似している神経細胞の損傷および損失を誘導することが可能である。海 ​​馬では、このような治療はCA1ではなく、特異的に神経細胞の喪失を誘導するCA3領域または海馬の歯状回。対照的に、これまでのスライス培養における血管反応の研究が広く行われていない。明白な理由は、スライス培養モデルにおける循環および血管灌流の欠如である。しかし、それはbと維持することが可能であることが以前に示されている数日8,9用のCNS ​​スライス培養における100dは血管。 この方法の全体的な目標は、OGD後の神経細胞の運命を監視するが、傷害応答の重要な部分である血管系の運命と改造のために研究を拡張することだけではありません。今までこのような研究は、動物実験（;カヴァグリアら、2001。デ·ヨングら 、1999）の使用を必要とした。プロトコルがここに提示、当社は、そのような研究は、低酸素症、または両方ニューロンの生存と血管反応の分析に続いて興奮毒性病変のいずれかによって攻撃さentorhino海馬器官型スライス培養で詳細に行うことができる方法を。このプロトコルは、この主題10日に以前に発表された研究に基づいており、CNSにおける神経血管の相互作用に興味を持ってあらゆる研究室のために役立ちます。

<table><tbody><tr><td>最小必須培地 MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>L-グルタミンの安定化型</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート</td><td>ミリポア</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>基礎培地 イーグル&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>嫌気性ストリップ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&Dシステム</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ1078/1</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナル抗ラミニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アンチMAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>GraphPadソフトウェア</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain組織チョッパー</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>低酸素チャンバー</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

虚血性脳損傷は、適切な脳機能を損なう最も一般的かつ破壊的な条件の中で、多くの場合、影響を受けた患者の機能欠損を永続化につながる。集中的な研究努力にもかかわらず、神経損傷を軽減し、遅延した二次死から虚血性の領域でニューロンを保護する利用できる有効な治療選択肢は、まだありません。この分野の研究は、典型的には、精巧で、問題の動物モデルの使用を含む。酸素およびグルコース欠乏（OGD）でチャレンジEntorhino海馬器官型切片培養物は、脳虚血を模倣するインビトロモデルにおいて確立されている。この研究の新規な態様は、脳血管の変化を比較し、相関させることができるニューロンの変化およびニューロンコンパートメント及び血管コンパートメントの両方の反応に加えて、研究されていることである。このプロトコルで提示される方法は、実質的にまたは潜在的用途を広げるganotypicスライス培養法。単独のOGDまたは低酸素症の誘導は、器官型スライス培養ではなく単純な手段によって適用され、神経組織における信頼性と再現性の損傷につながることができます。これは、生体内での脳卒中および虚血を誘導し、複雑で、問題の動物実験と全く対照的である。血管系の反応の研究を含めるように分析を広げることにより、脳の機能を維持し、復元する方法の新たな方法を提供することができます。ここで紹介するスライス培養法は、虚血性脳損傷の研究のための魅力的で重要なツールに発展する可能性があり、神経保護を目的とした潜在的な治療措置をテストするのに便利かもしれません。

酸素グルコース欠乏及び低酸素症は、海馬CA1領域において特異的に神経細胞死及び血管の減少を誘導する 。 以前7の記載と同様の海馬（ 図3）のCA1領域に特異的にヨウ化プロピジウム染色によって見られるようにOGDまたは酸素欠乏は、単独で15分間、細胞死の強力な誘導を誘導した。マーカーは、血管のネットワークを可視化すると、それは血管密度及び組織はCA1領域を除いた培養物の大部分でOGDチャレンジ後の制御と同様現れていることがわかった。そこ血管密度が減少し、血管網は、部分的に（ 図3、E及びF）破壊した。これらの変更は、ヨウ化プロピジウム染色が増加した領域で見られた。 血管の変化の時間的経過はneurのそれに匹敵する角項変性症。 私たちは、3時間、24時間および酸素欠乏（低酸素症）後48時間目の時点を使用して、CA1の両方でニューロン変性および血管損失の経時変化を調べた。 3時間後に低酸素症ではないヨウ化プロピ...

虚血性脳損傷の多くの局面を再現することができentorhino海馬器官型切片培養のためのプロトコルは、提示される。神経細胞の変化に加えて、神経脈管構造の変化を研究することによって、このプロトコルは、損傷後の神経組織内のプラスチック製の変化を研究するための汎用性の高いツールです。

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

この手順の全体的な目的は、虚血性脳損傷の組織培養モデルにおけるニューロンと血管の変化を同時に研究することです。これは、最初にサイの海馬スライス培養物を設定することによって達成されます。2番目のステップは、培養物を低酸素状態にさらすことにより、虚血性脳損傷を模倣することです。最後のステップは、ニューロンの生存と血管の変化を分析し、相関させることです。最終的に、有機海馬スライス培養に基づくin vitroアプローチを使用して、虚血条件下でのニューロンと血管系との間の複雑な相互作用を示します。この技術の主な利点は、低酸素チャレンジの後、ニューロンの生存と血管の変化をスライス培養モデルシステムで同時に研究できることです。この方法は、ニューロンと血管系との間の複雑な相互作用や虚血状態を明らかにするなど、神経虚血領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。まず、準備し、出生後の日型マウスポップからサイ海馬器官型スライス培養物を入力します。頭蓋骨を切除した後、大脳半球の臍帯端と中脳との間の亀裂を特定します。脳吻側から中脳までの部分を慎重に取り除き、補充されたMEMからなる氷冷調製培地に入れます。実体顕微鏡で解剖を続け、脳を氷冷調製培地に浸し続けます。皮質半球から残りの髄膜を取り除きます。.次に、半球の内側臍帯表面にある海馬を特定し、隣接する入るRH皮質と一緒に脳の残りの部分から海馬を分離します。組織をティッシュチョッパーに移し、海馬の中隔側頭軸を横切るように400ミクロンの厚さのスライスをカットします。スライスを細胞培養インサートに置き、加湿雰囲気で1ミリリットルのインキュベーション培地を入れた6つのウェルプレートでインキュベートします。翌日に培地を交換し、その後は1週間まで隔日で交換します 次に、OGD培地を準備します。1ミリリットルのOGD培地を2つの6の各ウェルに加えます。ウェル組織培養プレートは、低酸素チャンバー内でOGG培地に窒素を1時間注入し、37°Cのインキュベーターで一晩密封して保存する前に、低酸素指標として嫌気性ストリップを使用します。ストリップの色がピンクから白に変わったとき、媒体は無酸素であると考えてください。準備ができたら、ヨウ化プロピジウム染色またはPI染色により健康な細胞を選択します。piを1ミリリットルあたり2マイクログラムの濃度で培地に30分間加えます。蛍光光学系のみを備えた倒立顕微鏡で生きた培養物をご覧ください。ここに示すように、標識されたセルが少ないスライスは、ここに示すように、標識された細胞が多数あるスライスをさらに研究するために選択する必要があります。OGDの導入には使用しないでください。.スライスをOGD培地に移し、低酸素チャンバーで15分間保持し、インサートの側面に残っているすべての液体がスイッチの培養物で吸引されていることを確認し

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

organoptypic海馬スライス培養モデルは、...

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。...

器官型海馬切片培養

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

前脳と小脳のスライス培養システムを使用してNG2細胞とオリゴデンドロサイトを研究する技術が説明されています。...

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

ここでは、器官型スライス培養技術を用いて海馬の出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。この方法では、成人の神経新生のin vitro操作を可能にし、培養海馬への薬理学的薬剤の直接適用することができます。...

生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

切片海馬スライス培養 (一部は、OHSC) は、体内の状況を非常によくシミュレートする生体外モデルを表します。ここで述べる vibratome...

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。...

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

マウス前脳の組織図スライス培養における遺伝的にコードされたFRETベースのセンサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、ニューロンおよびアストロサイトにおける細胞ATPレベルの動的イメージングにこのセンサを使用する方法を示す。...

FRETベースのセンサATeam1.03YEMKを用いたマウス脳の組織組織スライスにおける細胞内ATPのイメージング

ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。...

リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル

この論文では、神経幹細胞を移植した脊髄器官型スライスを長期間生成および維持するための再現性のある方法を提供し、細胞置換療法をテストするための ex vivo モデルとして提供します。...

脊髄損傷における細胞移植を検証するためのプラットフォームとしての長期マウス脊髄器官型スライス培養

学ぶ神経血管リモデリングの解析手法。entorhino海馬器官型スライス培養を用いて虚血性脳損傷における神経細胞と血管の変化を同時に観察し、神経血管相互作用のメカニズム解明に貢献します。

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

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