Name: マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶマウス副腎クロマフィン細胞における細胞-添付容量測定法。パッチクランプを用いて単一ベシクルのエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを検出し、シナプス伝達メカニズムの理解を深める。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、LWGに対する全米科学財団賞（1145581）によってサポートされています。

注：イリノイ大学シカゴ校の動物実験委員会によって承認された全体の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施した。 1。ソリューションおよび培養培地の準備<ol><li> 6ヶ月までのために-20℃で、すべてのソリューションにしてください。 3ヶ月まで4℃で培養培地にしてく​​ださい。 </li><li> DMEM中で100mlにITSX（インスリン - トランスフェリン - セレンサプリメント）1ペン連鎖球菌溶液および1ミリリットルを混合することにより、培養培地100mlのを準備します。 </li><li> 100のCaCl 2、および50mM EDTAを2.5ミリリットルの2.5ミリリットル、250ミリリットルのDMEMを混合して酵素溶液を調製します。 </li><li> DMEMを225ミリリットル、FBSを25ミリリットル、アルブミン625 mg及び625 mgのトリプシン阻害剤を混合して不活性化溶液を調製する。 </li><li> 154のNaCl、5.6のKCl、5.0mMのHEPES、3.6 mMの炭酸水素ナトリウム、5.6 mMグルコースのロックのソリューションを準備します。 NaOHで7.3にpHを調整する。 </li><li>50 mg / mlののポリ-D-リジン（PDL）溶液を調製する。被覆カバースリップに1mg / mlの最終濃度を使用する。 </li><li> 140mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2、10mMのHEPES-NaOHを、および10 mMグルコースの細胞外溶液を調製する。 〜310ナノモル/ kgで浸透圧をNaOHで7.3にpHを調整する。 </li><li> 50のNaCl、100mMのTEACL、5mMのKCl、2mMの塩化カルシウム、1mMのMgCl 2、および10mMのHEPESのピペット溶液を調製します。 〜290ナノモル/ kgで浸透圧をNaOHで7.3にpHを調整する。 </li></ol> 2副腎の分離<ol><li>大小の解剖ハサミとピンセットの2組のペアをオートクレーブ。全体のプロセスの間に手袋を着用し、氷のバケツに解剖トレイを置きます。 </li><li>日0-3で取られたマウスを使用してください。断頭続いて加圧CO 2タンクで動物を安楽死させる。 </li><li>チェルビから背骨以下の子犬の背中を削減するハサミの小さいセットを活用<html>尾側領域にcalは。皮膚の下に表面的に切断され、体腔内に刺していないようにしてください。 </li><li>離れて背骨から次に、剥離皮膚筋系は脊柱の明確な見解を持って露出するように。ここから、頸髄でtransectionalカットを行い、その後、背骨の両側に沿って2つの平行カットを行う。 </li><li>動物の本体を保持する鉗子の一組では、脊柱をつかみ、腎臓が露出するまで、背骨をバック剥離する鉗子の他のペアを使用しています。 </li><li>このとき、腎臓の上に副腎を可視化。その後、慎重にロックの溶液を充填したコニカルチューブに各動物から2腺を配置します。 注：たまに腺が鉗子に固執します。この場合は、静かに鉗子からロックの溶液に腺の除去を助けるために鉗子の別のペアを使用する。腺は、最大2時間この状態に保つことができる。 </li></ol>E &quot;&gt; 3。組織消化<ol><li>一方、気泡使用前に15分間、5％CO 2 + 95％のO 2との酵素溶液。平衡化したソリューションは、ピンクがかった/オレンジ色に鮮やかなピンク色の電源が入るか確認します。 </li><li> 20〜25単位/ mlの最終濃度で新鮮に泡立て酵素液にパパインを追加します。パパイン酵素溶液中、37℃で40〜60分間、各動物から腺の各ペアをインキュベートする。 </li><li>各チューブに不活性化溶液の75％を加え、さらに10分間37℃でインキュベートする。このインキュベーションは、パパインの酵素活性を不活性化する。 </li><li>不活性化溶液で10分間インキュベーションした後、穏やかに新たに標識されたチューブに腺を転送して腺を培養培地で3回洗浄する。 </li></ol> 4。細胞解離とめっき<ol><li>洗浄後、培養培地を200μlに2腺を配置し、 静かに腺を滴定し、ダウン200μlのピペットを用いてピペットチップを通して組織の大部分が溶液中にもはや存在するまで。 NOTE：滴定すると、200μlのピペットの先端から下向きの力でチューブの底腺を維持し、穏やかにゆっくりと組織に係合する。高速または突然のピペッティング決して遅く、連続ストロークを使用するように注意してください。 </li><li> 450μlの最大の培地の全量を、追加の250μlの培養培地を追加します。 </li><li>プレートを60×15mmの培養皿に入れ、7つ12ミリメートルPDLプレコーティングしたカバースリップを、それぞれ上にこの細胞を含む溶液の60μlの。 </li><li>一度メッキ、細胞生存率のための環境を確保するために30分間、5％CO 2の定常流/供給しながら37℃に設定され、維持さインキュベーターに皿を置く。インキュベーションの後、静かに培養皿に予め温め培地の5ミリリットルを追加し、24時間インキュベーターに戻し、皿を返す細胞アタッシュケースの前にD録音。 注：典型的には、細胞は、最大4日間、電気生理学的記録のために使用することができる。 </li></ol> 5。細胞の同定およびギガオームシール形成<ol><li>細胞外液中に12mmのカバーガラスを配置します。全体副腎が細胞調製のために使用されるので、ベージュ/茶色がかったカラーリングと皮質細胞（細胞をクロム親和よりも小さく、調光器）と、培養中の近くの円形のフォーム（ 図1）と非常に明るいクロム親和細胞（通常はを混ぜる。 </li><li>プログラム可能なP-97プラーを使用して、4つの段階でパッチピペットを引き出します。 「ブローアウェイ」をするためにこのワックスをピペットチップの内部から先端をガラスの容量を低減するのに役立ち、その後火ポリッシュれる、溶けたロウにピペットチップを浸し。 NOTE：パッチピペット溶液で満たされたときに、パッチピペットは、典型的には約2MΩの抵抗を有する。 </li><li>数m内の細胞に近いパッチピペットアプローチicrons。セルに接続された構成を実現するには、セルに近いパッチピペットのアプローチの間にわずかな細胞変形を探します。 GΩシールが達成されるまで、穏やかな吸引を適用します。 </li></ol> 6セル接続型静電容量録音<ol><li> GΩシールが明らかにされると、EPC-7プラスパッチクランプアンプと二相のアナログロックインアンプ（機器の添付の表を参照）を使用することにより、セルに接続された録音を行う。 50 mVの（実効値）の振幅とロックインアンプから20kHzの周波数で正弦波を適用します。 </li><li> 1ミリ秒の時定数と24デシベルで、ロックインアンプの出力フィルタを設定してください。ロックインアンプなどの穏やかな吸引パルスによって生成される過渡的な静電容量の変化のみパッチコンダクタンス（再）トレースになし投影とパッチ容量（イム）トレースに表示されている（ 図2）の位相を設定します。 注：再、システムのキャリブレーションの詳細をご覧下さいference 19。 </li><li> 「下」の手順（ 図3）によって、一般的な静電容量の変化を識別します。 注：固体記録は、単一の小胞を内在化を示している多くの下向きの手順で「階段」タイプの似ている、と見ることになります。動作電流は典型的には、ほとんどの細胞から記録することができるので、パッチ適用プロセスは、機械的刺激として働く。 </li><li>そのファイル内の/月/年、自身の個別の番号（XX）として、各セルに接続された記録：個別の日を含むフォルダなど、ファイルに名前を付けます。 </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

セルに接続された静電容量測定に成功し、高品質での録音を得るためには、いくつかの重要なステップが必要です：副腎から調製1）生存し、健康な細胞;カバースリップの2）、PDLコーティング; 3）ギガオームシール形成; 4）システムのノイズレベル;および5）位相補正。 動物を手術のために、一つは、潜在的な修正は、最も適した器用に外科的アプローチを調整し、解剖時の損傷を防止することである。電気生理学的記録のために利用される細胞は、副腎髄質からのみ来るように加えて、検索および副腎の除去に十分な練習が不可欠です。酵素消化のためには、5％のCO 2 + 95％O 2で溶液をバブリングして酵素溶液を平衡化することが重要である。シリンダに接続チューブは漏れで十分とタイトであることを確信すること。また、必ずその目的の私n個の溶液を適切に全体の15分バブリング時間の間に置かれる。これは、適切に空気流を向けるようにチューブの端部で平滑化された20 G針先端を配置することで達成することができる。また、このステップの追加の時間があれば、空気の流れがチューブ内の溶液をオ...

シナプス伝達は、神経伝達物質を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスによって媒介され、これらの小胞は、長期的にはニューロンの通信を維持する神経末端内のローカルエンドサイトーシスのリサイクルを受けなければならない。脳内のシナプス伝達の重要な役割を考えると、シナプス小胞サイクルを構成している分子機構を理解することは、全体としてセルラ通信でより良い理解に向けて不可欠な基盤である。細胞モデル系の中では、副腎髄質細胞は、シナプス小胞のリサイクルの根底にある分子機構に最も決定的な洞察のいくつかを提供してきました。エキソサイトーシス、神経伝達物質放出の最終段階は、非常に学び、副腎クロマフィン細胞1,2を使用することによって検討されている。実際には、分泌顆粒の形成、ターゲティング、ドッキングおよび融合を調整する分子の選手のほとんどが原因のdivの適用に同定されているクロマフィン細胞1におけるERSEテクニック。さらに、エキソサイトーシスに関与するタンパク質合成機構の単一小胞の解決を可能にする機会を提供することにより、クロム親和性細胞は、小胞融合3の問題に対処するための強力なモデルのままです。 細胞結合型の静電容量の測定は、第3エキソサイトーシスの間に単一小胞の融合を解決に利用した。直径60nmのセル接続構成4-7のパッチクランプ技術を用いて細胞膜アドミタンス測定によって検出されることが実証されている〜と小さい小胞のエキソサイトーシス。アドミタンスは、回路またはデバイスは、電流が流れることを可能にする方法を簡単の尺度として定義される。それは、インピーダンスの逆数である。このように、アドミタンス測定値は、膜キャパシタンスの理解を提供する。これは、原形質膜への小胞の膜を組み込むことによって達成される。この取り込みは、表面の変化を明らかにエリア8。各融合する小胞は、膜キャパシタンス9,10段階的増加を引き起こす。また、このアドミタンス測定は、膜コンダクタンスとエキソサイトーシス事象3時の融合孔コンダクタンスを提供しています。この技術は、エキソサイトーシスの間に単一小胞の動態を同定することをユニークなツールを提供してきたように、私たちの研究室は最近、単一の小胞11,12のエンドサイトーシスを検出するために、この概念を適用しております。 私たちの具体的な関心は、多くの細胞の基本的なハウスキーピング部品13として、および神経端子14,15におけるシナプス小胞エンドサイトーシスのための主要な経路と考えられてきたクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、である。 CMEは、生物学的に重要であることが知られているが、その動態は、単数エンドサイトーシスイベントを監視する技術的な制限のためによく理解されていないままである。マフィン細胞と神経細胞1との間のエキソサイトーシスの機構の類似性を考えると、PLはクロマフィン細胞での分裂メカニズムはおそらくニューロンにシナプス小胞エンドサイトーシスに適用することができることがausible。細胞結合型の静電容量の測定は、個別のエンドサイトーシスイベントを監視し、ほとんどの方法は、解決できない核分裂反応速度を分析するために利用されてきた。私達のセルに接続された記録では、20kHzの正弦波は、保持電位上に重畳され、出力電流は、二相ロックインアンプから他のチャネルでのチャネル及び膜キャパシタンスに膜コンダクタンスに分離される16 18。膜コンダクタンスと静電容量の変化から、人はおそらく小胞ピンチオフする前に細胞膜に内在化小胞をつなぐ管状膜ネックに対応核分裂細孔の動態を計算することができます。総称して、この技術は私たちにCMEの中に小胞分裂の調節メカニズムを検討する機会を与えてくれます。

<table><tbody><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>シグマ</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>紫外線ダル</td></tr><tr><td>ベッコを防げます修正イーグルミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>カロライナバイオロ</td>ジ<td>カル633029</td><td>12mm</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>15140122</td><td>100ml</td></tr><tr><td>インスリントランスセルX</td><td>ライフテクノロジー</td><td>51500056</td><td>ICEでのみ解凍!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus パッチアンプ</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 データ収集ボード</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor データ収集ソフトウェア</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 ピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管Sutter</td>器<td>器械</td><td>B150-110-10</td><td>外径:1.5 mm 
内径:1.10 mm 
長さ: 10 cm</td></tr></tbody></table>

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

ニューロンの伝達は、脳内の細胞コミュニケーションの不可欠な部分です。シナプス前膜の脱分極は、シナプス伝達を媒介するエキソサイトーシスとして知られる小胞融合につながります。その後のシナプス小胞の回収は、エンドサイトーシスとして同定されたプロセスで新しい神経伝達物質で満たされた小胞を生成するために必要です。エキソサイトーシス中、小胞膜を融合すると表面積が増加し、その後のエンドサイトーシスでは表面積が減少します。ここでは、私たちの研究室では、マウス副腎クロム親和性細胞における単一のエンドサイトーシスイベントの細胞付着容量記録の基本的な紹介を示しています。このタイプの電気記録は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスを単一小胞レベルで高解像度で記録するのに役立ちます。この手法は小胞エキソサイトーシスとエンドサイトーシスの両方を検出できますが、私たちの研究室の焦点は小胞エンドサイトーシスです。さらに、この技術により、単一のエンドサイトーシスイベントの動力学を分析できます。ここでは、マウス副腎組織解剖の方法、クロム親和性細胞培養、基本的な細胞付着技術、およびその後の特異なエンドサイトーシスイベントを測定する個々のトレースの例について説明します。

細胞生存率およびギガオームのシールの質は、細胞結合型静電容量記録の品質を決定する上で重要である。したがって、前の電気生理学的記録に効果的かつ効率的な細胞培養を調達することが重要であり、典型的な生細胞は、 図1に示されている。練習時間が高品質でギガオームのシールを達成するのに役立つであろう。プロトコルステップ5.3で説明したようにパッチピペットが細胞に近づいたときに一つは、明らかに、細胞の変形を見ることができれば、高品質のシールを得るための良いチャンスがある。 図3は、関連する複数の下向きステップで膜キャパシタンスの典型的な記録を実証単一小胞エンドサイトーシス。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig1highres.jpg"> 実行可能なマウスの副腎髄質細胞の図1の例細胞培養24時間後。3の生クロマフィン細胞に矢印ポイント。 <a hr...

エキソサイトーシスの後、融合した原形質膜はエンドサイトーシスとして知られるプロセスを通じて回収されます。このメカニズムは、次の放出ラウンドのために新しいシナプス小胞を再構築します。個々のエンドサイトーシスイベントは、マウス副腎クロム親和性細胞の細胞付着容量記録を使用して捕捉および分析されます。

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

この手順の全体的な目標は、単一の小胞、細胞症、およびエンドサイトーシスを検出することです。これは、まずマウスの副腎組織のクリーンで完全な消化を得ることによって達成されます。2番目のステップは、副腎から細胞を解離してプレート化することです。次に、クロミン細胞を同定し、パッチクランプして細胞付着容量記録を取得します。最終的には、単一の小胞、細胞症、およびエンドサイトーシスを観察できます。この手法は、単一イオンチャネルの細胞付着記録などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、単一小胞のエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを検出できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ギガシールの取得が難しいために役立ちます。また、プレート内に見られる混合細胞タイプの中から細胞を特定するのが難しい場合があります。手術の準備をするには、大小の解剖、はさみ、2組の鉗子をオートクレーブすることから始めます。次に、解剖トレイをアイスバケツの上に置きます。また、5%の二酸化炭素と95%の酸素で酵素溶液を泡立て始めます。溶液は、バブリングする前に明るいピンク色です。次に。新生児を3日齢のマウスに安楽死させて斬首した後、小さなハサミのセットを使用して、頸部から脊髄部までの背骨に続く子犬の背中を切り取ります。体腔に穴を開けないように、皮膚の下を表面的に切ってください。次に、脊椎から皮膚を剥がして、筋肉組織が露出し、脊柱がはっきりと見えるようにします。次に、頸髄に横断的な切り込みを入れ、次に脊椎の側面に沿って2つの平行な切り込みを入れ、1対の鉗子で動物の本体を保持します。もう一方の鉗子を使用して脊柱をつかみ、腎臓が露出するまで脊椎を剥がします。腎臓の上にある副腎の位置を特定したら、鉗子を使用して副腎を取り除きます。次に、副腎をロック溶液で満たされた円錐形のチューブに慎重に配置します。2組目の鉗子を使用して副腎を取り除きます。それらが最初の鉗子のペアにくっついている場合は、円錐形のチューブを氷の上に置きます。グランドは、最大2時間ロック溶液に保持できます。この時点で、酵素溶液をチェックして、平衡化した溶液が明るいピンク色からピンクがかったオレンジ色に変わったことを確認します。次に、新たに泡立たせた酵素溶液にパペを最終濃度20〜25単位/ミリリットルで加えます。次に、プロパン酵素溶液を新しい円錐形のチューブに加え、鉗子を使用して副腎をプロパン酵素チューブに移します。37°Cで40〜60分間腺をインキュベートします。次に、各チューブに75%の不活化溶液を加え、摂氏37度でさらに10分間インキュベートします。10分後、腺を新しく標識したチューブにそっと移し、培地で腺を3回洗浄します。洗浄後、腺を200マイクロリットルの培地に入れ、次に200マイクロリットルのピペットチップを介して腺を上下に穏やかに滴定します。滴定するときは、200マイクロリットルのピペットチップからの下向きの力でチューブの底に腺を維持し、組織を穏やかかつゆっくりと噛み合わせますゆっくりとした連続ストロークを使用するようにしてください、滴定後すぐにまたは突然ピペッティングすることはなく、培養培地の総容量を最大450マイクロリットルにするために、さらに250マイクロリットルの培養培地を追加します。次に、7つの12 mm PDLプレコートカバーが60 x 50 mmの培養皿プレートに入れられます。次に、溶液を含むセルの60マイクロリットルを7つのカバースリップのそれぞれにプレートします。メッキしたら、皿を摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。インキュベーション後、5ミリリットルの温熱培地を培養皿に静かに加え、24時間インキュベートしてから細胞付着記録を行います。インキュベーション場所の後、副腎細胞を含む12ミリメートルのカバースリップを細胞外溶液に入れます。副腎全体が使用されたため、次のステップはクロミン細胞と皮質細胞を区別することです。培養では、クロミン細胞は通常非常に明るく、茶色がかったベージュ色とほぼ完全な円形の形をしています。対照的に、皮質細胞はCHRO細胞よりも小さく、淡色です。テキストプロトコルに記載されているようにパッチピペットを引っ張った後、ピペットの先端を溶かしたワックスに浸して、ガラスの静電容量を減らします。次に、チップをファイヤーポリッシュして、ピペットチップの内側からこのワックスを吹き飛ばします。次に、パッチピペット溶液を使用してピペットを組み立て、その抵抗が約2メガオームになるようにします。パッチピペットをマニピュレーターに取り付け、細胞から数ミクロン以内に持っていきます。ピペットを前進させ続け、わずかな細胞の変形がないか探します。変形が見つかったら、ギガオムシールが達成されるまで穏やかに吸引します。セル接続構成を生成します。ギガオムシールが明らかになったら、EPC 7プラスパッチクランプアンプとテキストプロトコルで説明されている2フェーズアナログロックインアンプを使用してセルアタッチ録音を行い、ロックインアンプの位相を設定します。これは、穏やかな吸引によって生成される過渡容量の変化です。パルスはパッチ容量にのみ現れるか、パッチに投影されないImトレース、コンダクタンス、またはパッチングプロセスの再トレースが機械的刺激として機能します。通常、作用電流はほとんどのセルから記録できるため、マークされた下向きのステップで典型的な静電容量の変化を特定します。最後のステップは、将来の分析のためにデータを保存することです。ここに示されているのは、複数の下向きステップを持つ典型的なセル接続容量記録です。各下降ステップは、単一のiCalエンドサイトーシスに関連付けられています。マスタリングすれば、細胞培養は2〜3時間で完了し、発生後4日以内に記録を行うことができます。この技術は、シナプス伝達の分野の研究者が神経内分泌クロミン細胞におけるシナプス小胞のリサイクルを探求する道を開きました。

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

副腎髄質クロマフィン細胞培養システムは、in...

マウス副腎髄質クロマフィン細胞分離

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

このビデオの記事では、セットアップの細胞体とどのように全体のマウントマウス網膜における神経節細胞からのダイナミッククランプ記録を実装するにパッチを適用する手順を示しています。この手法は、興奮性と抑制性シナプス入力の正確な貢献の調査、および神経スパイクに対する相対的な大きさとタイミングを可能にします。...

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

浸透圧ストレスは、エキソサイトーシスとこの処理中に解放の神経伝達物質の量に影響します。透過型電子顕微鏡と共に電気化学的方法を組み合わせることを使用エキソサイトーシス活動、小胞素量サイズ、および神経伝達物質解放の量に細胞外の浸透圧の影響を検討することができる方法を紹介します。中に分泌します。...

浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC...

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

マウス副腎の分離、組織を修正、セクション、それらを免疫蛍光染色を実行する方法をご紹介します。...

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

副腎皮質から分泌されるホルモンは、ストレスや病気に対して動物に不可欠です。ここでは、プライマリのラットの文化にプロトコル副腎細胞を提案します。副腎ステロイド生合成機能と脂質生合成に興味の試薬のメカニズムを調査するための良い生体外のプラットフォームかもしれない。...

初代培養ラット副腎皮質細胞とステロイド ホルモン産生機能の試金

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。...

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

マウス副腎皮質に対して、ゾナ・グロメルローサおよびゾナ・ファシキュラータ富む細胞の2次元一次培養を確立するための堅牢かつ再現性の高いアプローチが開発されました。このシステムは各ゾーンの主要な分子および機能的特徴を保存し、シグナル伝達経路、ホルモン産生、副腎皮質細胞の行動をアウト...

マウス副腎皮質からのゾーン強化一次培養の確立

学ぶマウス副腎クロマフィン細胞における細胞-添付容量測定法。パッチクランプを用いて単一ベシクルのエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを検出し、シナプス伝達メカニズムの理解を深める。

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

さらに動画を探す