Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Shubhra Majumder; Harold A. Fisk

doi:10.3791/52030

JoVE Journal
Biology

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JoVE Journal Biology

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

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09:39 min

December 20, 2014

DOI: 10.3791/52030-v

Shubhra Majumder¹, Harold A. Fisk¹

¹Department of Molecular Genetics,The Ohio State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

ここでは、タンパク質の蛍光強度を適切な内部標準の蛍光強度に正規化することにより、中心体におけるタンパク質のレベルの変化を測定するための新しい定量的蛍光アッセイが開発されています。

この手順の全体的な目標は、さまざまな条件下でのCentrosomesのタンパク質レベルの相対的な変化を定量化することです。例えば、プロテアソームの阻害後の細胞周期の特定の点において、これは、まず、カバースリップ上で増殖している細胞をプロテアソーム阻害剤MG one 15またはコントロール溶媒DMSOのいずれかで処理することによって達成される。その後、直ちに両方の細胞にBRDUを添加し、細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートします。

2番目のステップは、カバースリップを24ウェルプレートに移して細胞を固定することです。次に、細胞をBRDUおよび目的のタンパク質に対する抗体で染色し、次に対応する二次抗体で染色します。最後のステップは、蛍光顕微鏡とデジタルイメージングソフトウェアを使用してBRDU陽性細胞の画像を取得し、各サンプルの細胞に同一の露光時間とZ軸の長さを適用することです。

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