中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

この手順の全体的な目標は、さまざまな条件下でのCentrosomesのタンパク質レベルの相対的な変化を定量化することです。例えば、プロテアソームの阻害後の細胞周期の特定の点において、これは、まず、カバースリップ上で増殖している細胞をプロテアソーム阻害剤MG one 15またはコントロール溶媒DMSOのいずれかで処理することによって達成される。その後、直ちに両方の細胞にBRDUを添加し、細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートします。

2番目のステップは、カバースリップを24ウェルプレートに移して細胞を固定することです。次に、細胞をBRDUおよび目的のタンパク質に対する抗体で染色し、次に対応する二次抗体で染色します。最後のステップは、蛍光顕微鏡とデジタルイメージングソフトウェアを使用してBRDU陽性細胞の画像を取得し、各サンプルの細胞に同一の露光時間とZ軸の長さを適用することです。

次に、画像を分析して、ロマルVDA C3の相対レベルを定量化します。最終的に、定量的免疫蛍光顕微鏡法を使用して、S期にプロテアソームが阻害されると、VDA C3のセントロソムプールが2倍に増加することを示します。この手法がフローサイトメトリー、イムノブロッティング、定量顕微鏡などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、この手法が、2つの異なるカバースリップで処理された2つの異なる処理済みサンプル中のタンパク質の相対的なロマールレベルを分析できることです。この方法では、内部標準への正規化を使用して、2つの実験細胞集団を処理する必要性を制御します。

これとは別に、この方法は中心体での特定のタンパク質の調節についての洞察を提供することができますが。また、他の細胞内構造や、細胞内の複数の部位に見られるタンパク質の特定のプールを調べるなど、他の状況にも適用できます。手順を実証するのは、私の研究室のポスドクであるシュー・マジャンダーであり、実験の継代を2回10回から5回目に非同期に成長させるRPE1細胞を事前に準備した35ミリメートル皿に蓋をして唇を覆い、2ミリリットルの完全培地で細胞を成長させます。

24時間ごとに培地を新鮮な温冷培地と交換します44時間後。培地を最終濃度5マイクロモルで0.05%DMSOまたはMG one 15を含有する完全培地と交換し、同時に最終濃度40マイクロモルの細胞にBRDUを添加し、細胞を4時間インキュベートする。次に、各カバースリップを24ウェルプレートに移します。

500マイクロリットルの耕起済みメタノールを各ウェルに加え、プレートをマイナス20°Cでインキュベートして細胞を固定します。10分後、すぐに500マイクロリットルの洗浄バッファーでカバースリップを3回洗ってください。蓋に固定された細胞をインキュベートし、細胞がインキュベートしている間に200マイクロリットルのブロッキングバッファーを30分間滑り込ませます。

空の1000マイクロリットルピペットチップボックスの下半分に濡れたペーパータオルを置いて、加湿チャンバーを準備します。ラック表面にパルファムのストリップを敷き、ブロッキングバッファーで希釈したウサギ抗V DDA 3抗体とマウス抗ガンマチューブリン抗体の20マイクロリットルの液滴をパラフォームに加えます。ブロッキング後、抗体溶液の各液滴にカバースリップを反転させます。

セルが浸されていることを確認し、チップボックスの蓋を閉めます。加湿チャンバー内で細胞を一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。カバースリップを再度反転させ、24に戻します。

カバースリップをよく皿洗いし、次いで二次抗体の150マイクロリットル溶液中でインキュベートし、ブロッキングバッファーで室温で1時間希釈した後、カバースリップをウォッシュバッファーで3回洗浄する。染色したRPE 1細胞を500マイクロリットルのメタノールで固定し、摂氏マイナス20度で冷却します。細胞を10分間固定した後、洗浄バッファーで3回洗浄します。

次に、200マイクロリットルの2つの正常HCLで細胞を30分間インキュベートします。室温で、300マイクロリットルの1モルトリスCL pH 8で細胞を中和し、細胞を3回洗浄します。洗浄バッファーを使用して、室温で30分間、200マイクロリットルのブロッキングバッファーで細胞をブロックします。

ブロッキング後、ラット抗BRDU抗体およびブロッキングバッファーを用いて、加湿チャンバー内で37°Cで45分間細胞をインキュベートします。カバーをスリップして24に戻します。細胞をよく皿に洗います。

次に、150 μLのブロッキングバッファーで希釈した二次抗体とインキュベートします。24ウェルディッシュで室温で1時間。次に、ガラス顕微鏡でAntifa試薬を含む封入液の6マイクロリットルの液滴であるXPBSスポット1個でカバースリップを3回洗浄します。

セル側を下に向けてカバースリップをスライド反転させ、取り付けソリューションに取り付けます。柔らかいクリーニングティッシュで、カバースリップをスライドにそっと押し付けて余分な液体を取り除き、カバースリップを顕微鏡に密封します。カバースリップの端に沿ってマニキュアを塗ってスライドさせます。

開口数1.4の100 x planAPO油浸対物レンズを使用して、室温でBRDUポジティブRPE One細胞の画像を取得します。0.2ミクロンのステップサイズでZ軸に沿った適切な上面と下面の焦点面を決定し、Z軸に沿って画像を取得します。次に、Z軸に沿って取得したすべての画像スタックのデコンボリューションを実行します。

各画像の総強度投影を取得します。中心体が2ミクロン未満離れている細胞のZ軸に沿ってスタックします。両方の中心体の周りに一辺あたり20〜30ピクセルの小さな正方形を描き、選択した領域をマークします。

最初の正方形の周りに一辺あたり24〜35ピクセルの大きな正方形を描き、大きな正方形の選択した領域をマークします。次に、各フルオロ4の面積と総蛍光強度を取得します。各ボックスで、各フルオロのバックグラウンド補正蛍光強度を計算します。4。

最後に、VDA C3の正規化された蛍光強度を、その蛍光のバックグラウンド補正された蛍光強度の比率を計算することにより取得します。選択された内部標準画像に使用されたフルオロのうち4つから4つは、BRDUとプロテアソーム阻害剤MG one 15または対照溶媒DMSOのいずれかでインキュベートされた非同期に増殖するRPE1細胞のランダムフィールドをキャプチャされ、DNAおよびBRDUを表示しました。バックグラウンド補正された蛍光強度は、Centro Somalに対応しました。

VD 3は、MG one 15処理細胞で約2.5倍高かったが、この箱とウィスカー図で示されているように、対照細胞では約15倍高かった。データをγチューブリンの蛍光に対してVD 3蛍光の合計で正規化すると、倍率は増加し、約2倍にわずかに低下しました。非ロマルサイトまたはVD 3の全細胞レベルでのVD C3染色は、プロテアソーム阻害の影響を受けませんでした。

したがって、VDA C3のロマルプールは、プロテアソームを介した分解によって制御されます。この手順を試行する際、試験タンパク質と内部標準に対する抗体は異なる宿主種で上昇させる必要があり、デジタルイメージングの影響を最小限に抑えるために、両方のサンプルの画像は、帝王切開の数や露光時間などの同一のイメージングパラメータを使用して取得する必要があることを覚えておくことが重要です。