一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、虚血性脳のマウス骨髄細胞サブセットを 2 つの異なる方法論で特徴付けることです。まず、総頸動脈またはCCAと中大脳動脈またはMCAの遠位幹の両方を閉塞することにより、脳虚血の恒久的なモデルが導入され、主に脳皮質に影響を与える梗塞が生成されます。次に、骨髄系細胞サブセットの立体論理定量化のために、脳の連続冠状切片を目的の細胞の免疫染色し、浸潤した細胞を光学分画器アプローチによって定量します。

あるいは、骨髄細胞を機械的解離によって新鮮な脳組織から単離し、フローサイトメトリーによって染色および分析することができます。最終的には、脳虚血後にマウスの脳に浸潤する特定の骨髄系細胞サブセットの正確な定量化と詳細な定性的特性評価は、ステレオ定量とマルチパラメトリックフローサイトメトリーによってそれぞれ達成できます。この虚血シリアルモデルが他の既存のモデルよりも優れている主な利点は、私たちの技術が他の方法よりも死亡率が大幅に低く、研究に必要な動物の数を最小限に抑えることです。

この領域は、脳損傷における微小再活性化、血行性マクロファージの血管外漏出、または好中球の役割は何かなど、脳卒中分野の重要な質問に答えるのに役立つ方法を示していますか?彼らは、この論文で実証されたマルチパラメトリックサイトメトリーアプローチに関する正確な神学的定量化により、CE虚血に対する自然免疫応答の両方における骨髄細胞集団の数表現型と機能についての洞察を得ることができます。最初にCCAを結紮するには、手術用顕微鏡で動物の首の腹面の周りに1センチメートルの正中線切開を行います。

解剖したら、シックスゼロナイロン縫合糸を使用して、左のCCAを永久的な結び目で閉塞し、遠位MCAを結紮します。次に、側頭筋を右から左に水平に切開します。次に、側頭筋の右側に2回目の垂直切開を行います。

側頭静脈を切らないように注意してください。側頭筋を頭蓋骨から引き離し、縫合糸で保持して、頭蓋骨の表面を清潔に保ちます。次に、冷たい滅菌生理食塩水で頭蓋骨を洗浄し、頭蓋骨の透明度を介して左MCAの正確な位置を検出します。

MCAが特定されたら、ステンレス鋼のバリを使用して、頬骨弓と扁平上皮骨の間の前頭葉で1ミリメートルの円形開頭術を行います。MCAが露出している頭蓋骨を慎重に取り外します。次に、ナインゼロナイロン縫合糸を使用して、前頭MCA枝と後MCA分岐の間の分岐部の直前に、永久的な結び目で遠位体幹の左MCAを閉塞します。

脳を摘出するには、安楽死させたマウスを脊髄のすぐ上で斬首し、皮膚を前方に切開して頭蓋骨を露出させます。次に、側壁と頭蓋骨の基部の接合部に2つの横方向の切り込みを入れ、骨の小片を取り除きます。次に、矢状縫合糸に沿って頭蓋骨に切り込みを入れ、鉗子を使用して各半球を覆う頭蓋骨を切除し、脳を露出させます。

へらを使用して脳を頭蓋骨から分離し、それを4%PFA溶液に移します。3時間後、PFAを除去し、脳を30%ショ糖溶液でインキュベートして脳を凍結保護します。48時間後、ショ糖溶液を取り出し、脳をマイナス40°Cのイソップペンタンで素早く凍結し、凍結ミクロトームを使用して30マイクロメートルの冠状脳切片を作成します。

クライオ保存料溶液に10個のシリアルセットを収集。各シリアルセットは、スライス間距離が300マイクロメートルの約14〜16個のコロナスライスで構成されています。bgma の後方 1.94 から負の 2.46 の間のマウス脳の適切なサンプリングを確保して、浸潤した好中球の総数を推定します。

光学式分画器によるMCA閉塞後、まずラット抗LY six G抗体と適切な二次抗体で好中球を従来の免疫蛍光法により浮遊切片に免疫染色します。次に、脳切片をスーパーフロスト顕微鏡スライドにマウントし、梗塞領域を右側に配置し、ステレオ調査ソフトウェアを開きます。次に、ツールのシリアルセクションマネージャーメニューをクリックし、新しいセクションボタンで新しいセクションを追加します。

1 つの 10 番目のスライス サンプリング分数の評価間隔を 10 に設定します。次に、輪郭ダウンメニューから、梗塞領域輪郭ツールを選択します。10 x 対物レンズの下の梗塞領域の輪郭を描くように輪郭を描きます。

次に、顕微鏡の対物レンズメニューと対物レンズメニューの下にある100 x対物レンズに切り替えます。プローブメニューで好中球を定量化するには、光学フラクショネーターを選択し、XグリッドサイズとYグリッドサイズの両方でカウントフレームのXY配置を230に設定します。次に、マーカーバーから好中球ボタンを選択し、梗塞領域の汚れた好中球に印を付けます。

定量化の結果をスプレッドシートファイルにエクスポートして、脳を単一細胞懸濁液に解離します。示したように脳を切除した後、脳虚血性マウスの脳から同側皮質のコア領域と梗塞領域を解剖します。脳組織の重量を量り、実験グループ間の正常化のために呼び出しごとに5ミリリットルの氷冷RPMIに入れ、次にテフロン乳棒付きのティッシュグラインダーを使用して組織を単一の細胞懸濁液に解離します。

細胞懸濁液を50ミリリットルの超遠心チューブに移し、さらに5ミリリットルのRPMI/コール溶液をサンプルに加えます。次に、細胞懸濁液を7,800GSおよび摂氏25度で30分間遠心分離した後。ミエリンに対応する白色の層が溶液の上部に表示されていることを確認します。

ミエリン層を慎重に除去し、ペレット化された細胞を含む細胞懸濁液全体を40マイクロメートルのナイロンメッシュストレーナーでろ過します。ストレーナを10ミリリットルのRPMIで洗浄して、すべての細胞がメッシュでろ過されていることを確認してから、溶液を50ミリリットルのチューブに移します。細胞に20ミリリットルのRPMIを加え、細胞をスピンダウンした後、白血球ペレットを再懸濁します。

PBSの1ミリリットルで、室温で4ミリリットルの溶解緩衝液で細胞を2〜3分間インキュベートして赤血球を溶解し、次に細胞をスピンダウンします。1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSと氷上の適切な抗体で細胞を標識します。次に、45分後、サンプルを1ミリリットルの冷たいPBSで洗浄し、Resusはペレットを100マイクロリットルのファックスフローバッファーに再懸濁してフローサイトメトリー分析を行います。

このモデルは、キャバリエリ法によって推定されるように、中大脳動脈閉塞後 24 時間での梗塞容積の再現性が高いことを特徴としています。以前の研究と一致するように、ニール染色切片では、好中球の浸潤は梗塞のサイズと直接相関しています。さらに、白血球の単離とフローサイトメトリーの特性評価により、虚血性マウスのIPS病変半球の皮質から骨髄細胞を単離することができ、これは細胞懸濁液に見られる全イベントの10〜30%を占め、細胞の破片に関連する低い前方散乱パラメータを示します。

CD 11 B陽性細胞は、細胞残骸がこのマーカーで標識されていないことを示唆するより高い前方散乱値を有し、前述のように、FSC閾値を200に設定することによりさらなる分析から除外できることを示唆しています LYとして特徴付けられる好中球 6つのG陽性細胞は、この脳虚血モデルを使用して虚血性マウス脳のMCA閉塞後24時間で発見された最も多数の浸潤細胞集団であり、CD11B陽性CD45高細胞の70〜80%を含む。残りの細胞は、主にCD 11 B、陽性CD 45、高LY 6 G、陰性6 Cの高炎症性単球の亜集団であり、これらは中大脳動脈閉塞後24時間から48時間後に虚血性脳領域に高い数で見られます。このP-M-C-A-Oモデルは、フローサイトメトリーの手順に従って適切に実施すれば、30分で実施することができます。

特定の細胞サブセットのソーティングなどの他の方法を実行して、このモデルシステムにおける骨髄系細胞の発現パターン、代謝変化、または酢酸活性などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、虚血モデルを作成する方法、そして最も重要なこととして、マウスの脳損傷または脳虚血後のtpeで2つの異なるアプローチによって浸潤する骨髄細胞の数と表現型を特徴付ける方法をよく理解してください。