Name: 一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ脳虚血モデルにおけるマウス骨髄細胞亜集団の解析法。光学分割法による立体解析とフローサイトメトリーで浸潤細胞の定量的・定性的特性評価を行い、脳卒中研究の免疫応答理解に貢献します。

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<li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent%2C+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li>
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<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで紹介する脳虚血モデルは、再現性の高い梗塞ボリュームは24〜48時間と異なるアプローチ8,15,17によるMCAの結紮後7日を決定します。このMCAOモデルは、研究で使用された動物の数を最小限に、他と比較して低い死亡率（1％未満）を有する。死亡率のこの低い速度を得るための重要なステップは、卒中誘導後の生存を損なう可能性の感染を避けるために、適切な無菌状態を維持することである。このMCAOモデルができるだけでなく、翻訳の研究18の臨床関連モデルと考えられている永久MCAOモデルとして使用されるだけでなく、スリップノットと後部再灌流とCCAとMCAの一過性のライゲーションによる一過性モデルのような所望の時点で19。この方法は、正常にマウスおよびラット17,20で使用されている。このすべての証拠は、連結によるMCAOは、複数のアプリケーションとの脳虚血の高い汎用性モデルであることを示している。 critiこの技術の校正ステップは、実体顕微鏡下に侵襲的手術を必要とすることである。開頭術は頬骨だけでなく、MCAを損傷しないように、非常に慎重に行われるべきである。しかし、（手術手順に供されるが、CCAとMCA結紮を行わない）偽動物の使用は、外科的処置依存効果を識別するための便利なツールを提供します。この技術は、次の脳損傷の程度は、いくつかの方法によって定量することができる。脳切片、ニッスル染色およびカバリエリによるボリュームの後続の推定の我々のプロトコルは、損傷領域の正確な定量を可能にし、連続脳切片は、異なる免疫組織化学的分析のために使用することができるので、研究のこのタイプに使用されるマウスの数を最小化する。この方法論のパフォーマンスを向上させるために、それは目を推定するために必要となる立体学ソフトウェア（ 表1）で使用される適切なパラメータを選択することが重要ですの式により、異なる領域の電子容積：V = 1 / SSFは、* のf *トン*のΣPiが （Ssfをtは切片の平均厚さは、スライスサンプリング画分で、fは格子間隔の領域であり、 ΣP構造に当たる点の数）。 ライゲーションによる遠位MCAOは浸潤白血球および免疫細胞の亜集団脳損傷1-4以下の炎症プロセスに関与8,13を特徴付けるために有用であることができる。ここでは、脳の免疫細胞の特徴付け、正確な立体的アプローチより優れ複数の白血球亜集団を特徴付けるためのフローサイトメトリー分析のための2つの異なる方法を提案する。 連続脳切片を利用して、好中球の総数の定量化は、細胞サンプリング機知の数から細胞の総数を推定する光分留法16によって達成することができるhaの体系的なランダム方向X、YとZの公平な仮想カウント空間の間の一定の間隔でこのメソッドは、に正確なツールを提供し、我々の場合梗塞領域における関心領域全体をカバーする公平な仮想カウントスペースの（SRS）のセットを、サンプリング結紮後の異なる時点での虚血性脳における総好中球数を推定する。それは、本研究で示されていないが、このプロトコルは、虚血21後および他浸潤白血球（単球/マクロファージ）のような虚血性脳で検出された他の細胞集団の正確な定量化のための別の好中球の亜集団を推定するためにも使用することができるまた、生き残った神経細胞を推定するための、さらには脳卒中後の神経新生の定量化のために。ものは、虚血領域における好中球の定量化のために、表3に示すように、所望の領域における正確な推定のための最も重要なステップは、適切なパラメータの選択である。これらのパラメータは、（ΣQ-を用いて計数した細胞の総数N =ΣQ-×1 / SSF×1 / ASFの×1 / TSFの式を用いて、総陽性細胞数（N）を計算するために立体学ソフトウェアのために使用される精留塔は、SSFはASFのサンプリング画領域であり、TSFはサンプリング分の厚さ）5である、節サンプリング率である。この方法は、他の定量化技術よりも遅いものの（例えば、組織、代表的な画像またはフィールド当りの好中球の数の濃度測定の投与による好中球マーカーの分析）は、それが公平かつ正確に提供する固体技法であるという利点を有している細胞数の定量化。 脳白血球分離法は、 インビボでの染色または遺伝子操作することによって、システムのバイアスを必要とすることなく、いくつかの免疫細胞のサブタイプの同時同定及び定量を可能にする。特徴と骨髄Pからソーティングその後の細胞opulationsまたはそれらの免疫磁気分離は、遺伝子又はタンパク質発現に対するさらなる研究のような複数の下流の用途に使用することができる。この方法で得られた好中球、単球及びミクログリアの正確な特性は、免疫組織化学的研究は、脳の先天性免疫応答を媒介する別の骨髄細胞に特定の機能を割り当てることができます利点として、既存の方法に対して高い特異性を提供する。加えて、さらに血液由来マクロファージ（のCD11b + CD45 ハイ CD68 +）のような、適切なラベルと他の脳集団を特徴づけるために拡張することができ、それは、他のCNS ​​病理または傷害を研究するために適用することができる。したがって、この技術は、脳内の炎症反応の不均一性を探求するために不可欠なツールを提供しています。この技術の主な制限は、変更することができ、新鮮な脳組織から白血球懸濁液の調製に常駐細胞の活性化状態またはそれらの抗原変質。この技術は、免疫組織化学的研究に比べてより詳細な定性的な特性評価を可能にするが、それは細胞の単離に基づいて、より少ない正確​​な定量を提供しています。それにもかかわらず、我々の細胞単離プロトコルの効率は、他の公開された方法論9と同様であり、それは効率的に制御し、MCAO群の間、あるいは異なる処理8を施しMCAOグループ間の脳の免疫細胞の数の差を検出するために使用することができる。 このプロトコルの重要なステップは、組織切開、組織破壊手順、およびミエリンの除去である。組織収集に関しては、正規化ステップは、異なる解剖性能に起因するばらつきを回避するために、（採取した組織を秤量することによって）を含めることができる。さらに、異なるMCAOグループ間の正規化はまた、梗塞容積を介して起こり得る（以前磁気Rによって決定esonance）。この問題を解決する別の方法は、両方の虚血性群と対照群の全同側半球を使用し、あるいは使用される動物の数を最小化するための対照として、虚血マウスの対側半球を使用することである。このアプローチは、各解剖の違いを回避するが、それは主な欠点を有する。希釈係数は、細胞の総数排他的ではないが、同側皮質のコアおよび梗塞周囲の領域に位置している骨髄細胞の数を増加させることによって付加される。組織破壊に関しては、このプロトコルは、酵素処理を回避し、表面抗原変質9,22、炎症性細胞亜集団の更なる定性的および定量的分析のための必須の問題を防止し、脳細胞の機械的破壊のためのステップを示す図である。目的の細胞懸濁液の調製に加えて、脳試料からミエリン除去downstとの干渉を避けるために非常に推奨されるステップであるそのような免疫細胞分離などの連アプリケーション、またはフローサイトメトリー23,24を流れる。これは、異なる方法、例えば、スクロースまたはパーコール勾配、または抗ミエリンビーズを用いて達成することができる。ここで、および脳細胞懸濁液を単離するための異なる方法を比較した以前の研究に基づいて、ミエリンを除去するパーコールの使用と組み合わせて、機械的な破壊は、細胞収量および生存率25を改善するために使用される。

形態学、表現型および遺伝子発現ミクログリアの変化、ならびに血管外遊出及び血行性マクロファージおよび好中球の活性化は、脳損傷1-4以下の病態生理学的カスケードに重要な役割を果たしていると考えられている。このプロトコルは、虚血性脳の異なる骨髄細胞サブセットの数を推定するために、それらの表現型の特徴付けを行うために2つのアプローチを提供する。さらに、それはまた、梗塞を評価する方法を含む、両方の遠位の中大脳動脈（MCA）の一時的または永久的な連結および総頸動脈（CCA）で構成されたマウスにおける脳虚血の実験モデルの説明を提供する立体解析ソフトウェアを使用して、正確なカバリエリ法による。 虚血性脳の骨髄細胞サブセットを特徴付けるための最初のアプローチは、光精留塔のアプローチ5に基づいて、立体的な方法である。これは、最もあり一般的に生命科学の立体解析プローブを使用し、エラー5-7の低い係数の高精度を提供します。それが原因のセクションへの組織の断片化の細胞推定上のバイアスを避けるように組織が、セクションに切断されたときにこれは、細胞定量化のための最良の選択である。この方法は、数字、ダイナミクスと虚血組織8の浸潤した好中球の亜集団の表現型の変化を特徴づけるために非常に強力な方法です。 第二の特徴付けアプローチは、脳白血球懸濁液を分離するために、フローサイトメトリーによってそれらを特徴付けるための簡単な方法を提供カンパネラおよび共同研究9から修正されたプロトコルに基づいている。従来の免疫組織化学法とは対照的に、特徴付けフローサイトメトリミクログリアの間（CD45 見よのCD11b +）を微分可能にし、それらの差分に基づいて、骨髄細胞（CD45 ハイのCD11b +）の浸潤CD45 9-13のerent発現レベル。また、炎症促進性単球（CD45 ハイのCD11b + Lyと-6G - Lyの-6C ハイ ）、虚血組織の好中球（CD45 ハイのCD11b + Lyと-6G +）及び他の白血球サブセットを区別することができる。このアプローチは、脳虚血の実験モデルにおいて神経炎症を評価するための信頼性が高く、迅速なアッセイを提供する。しかし、組織の処理は、半定量的な特徴付けを提供する虚血組織に見られる異なる細胞集団の活性化状態と数字に影響を与えることができる。

<table><tbody><tr><td>フォトニックLED F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td>機器</td></tr><tr><td>温度コントローラー&nbsp;</td><td>パンラブ&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>機器</td></tr><tr><td>ボルバー GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>機器</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>機器</td></tr><tr><td>ステンレス鋼 バリ</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>外科用材料</td></tr><tr><td>鉗子 デュモン #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>鉗子 デュモン #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>縫合糸 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>縫合糸 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>ニコン エクリプス&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>TE300</td><td>機器</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>エステベ</td><td>571329-8</td><td>化学</td></tr><tr><td>ナトリウムペントバルビタール</td><td>ベトキノール</td><td>570681</td><td>化学</td></tr><tr><td>凍結ミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズGmbH</td><td>SM2000R</td><td>機器</td></tr><tr><td>スーパーフロストスライドサー</td><td>モサイエンティフィック&nbsp;</td><td>2014-07</td><td>ラボ材料</td></tr><tr><td>クレシルバイオレットアセテート</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>化学</td></tr><tr><td>顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>ニコン エクリプス TE300</td><td>機器</td></tr><tr><td>XYZ電動コンピュータ ステージとコントローラー</td><td>Ludl エレクトロニクス製品</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>ステレオ調査システム</td><td>マイクロ明視野</td><td>バージョン7.003 ソフトウェア</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>5 ml ティッシュグラインダー、テフロン乳棒付きポッターエルフ</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>0913X70</td><td>ラボ材料</td></tr><tr><td>ポリプロピレン 50 ミリリットル オークリッジ遠心分離管</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>ラボ資料</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>化学</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ロンザ</td><td>BE12-702F</td><td>化学</td></tr><tr><td>ベックマン超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>装置</td></tr><tr><td>ベックマン・コールター超遠心ローター 45 Ti</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>装置</td></tr><tr><td>BD 滅菌細胞ストレーナー、40ミクロン</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>ラボ材料</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, マウス</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, ヒトおよびマウス</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD45-PE, マウス</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, マウス</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>抗体</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 抗マウス Ly-6C</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>128012</td><td>抗体</td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4色</td><td>BD</td><td>342975</td><td>装置</td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

ミクログリアの活性化、ならびに血行性マクロファージおよび好中球の血管外遊出は、脳卒中後の脳損傷において極めて重要な役割を果たしていると考えられている。これらの骨髄性細胞亜集団は、異なる表現型および機能を表示し、区別する必要があり、組織損傷に対する規制や寄与を研究するために特徴付けられることができる。正確な立体的アプローチとフローサイトメトリー分析：このプロトコルは、脳の免疫細胞の特性評価のための2つの異なる方法を提供します。立体的なアプローチは、系統的ランダムサンプリングによって推定関心領域内のセルの総数（脳梗塞）を算出する光学分留法に基づいている。第二の特徴付けアプローチは、虚血組織の単球および好中球が浸潤し、ミクログリアの特徴付けを可能にする、脳白血球懸濁液を単離し、フローサイトメトリーによってそれらを特徴付けるために簡単な方法を提供する。さらに、それはまた、dは死亡率の低さ、およびカバリエリ法により梗塞体積を特徴づける学的脳処理の手順で再現性の高い梗塞を生成する、もっぱら脳皮質に影響を与えたマウスにおける脳虚血モデルをetails。

ここに示した脳虚血モデルでは、線条体を灌漑MCAのlenticulostriatalブランチが（ 図1）閉塞されていないので、線条体組織に影響を与えることなく、皮質において排他的に見られる梗塞を生成します。ニッスル染色により、損傷領域は淡色皮質領域（ 図2）として同定することができる。このモデルは、ニッスル染色した切片でキャバリエ法により推定MCAO（％IH 15.89±0.28）（ 図2）の後24時間で再現性の高い梗塞量によって特徴付けられる。カバリエリ法による梗塞容積の推定は、contralesionalとipsilesional半球ならびに梗塞領域（ 表2）にグンダーセンのエラー（CE）の係数に反映されている低エラーと正確なアプローチです。損傷を受けた組織体積はmm 3でではなく、セクション3.2.13式を使用して、％IHのように表すことができる。加えて、推定ipsilesionalとcontralesional領域の総体積の浮腫指数の計算は、梗塞体積を補正し、損傷を受けた組織（ 表2）の過大評価を回避することが可能になる。 脳組織の連続切片の処理を考えると、これは光学フラクアプローチ（図3および表4）を使用して、虚血領域において、浸潤好中球のような細胞集団の総数の正確な推定を行うことの利点を取ることができる表3に示すパラメータを使用して。このプロトコルは、24時間とpMCAOの後のマウスにおける48時間（ 図3D）で82856±8143で23328±3623の梗塞領域における好中球の総数（Ly6G陽性細胞）を推定する。以前の研究と一致して、好中球浸潤を直接的に梗塞サイズ（ 図3E）と相関している。 Tの推定光精留塔法による好中球の彼数はグンダーセンのCE（ 表4）で反射され、低誤差の正確なアプローチです。 白血球の単離および特徴プロトコルフローサイトメトリー虚血マウスのipsilesional半球の皮質から47922±23174骨髄細胞の単離を可能にする。これは細胞懸濁液で見つかった合計イベント10〜30％を占める。このプロトコルを使用して取得されたイベントの大部分は、細胞破片（ 図4）に関連する低FSCパラメータを提示する。のCD11b染色のCD11b +細胞が、細胞破片は、それが200 9でFSC閾値を設定することにより、さらなる分析から除外することができ、前述したように、このマーカーで標識されていないことを示唆し、高いFSC値（ 図4）を有することを示している。この方法で得られた細胞の破片の可変量は、サンプルプロセスにおける違いを示唆しているる（タイミング、組織保護、試料温度、効率的なミエリンの除去など ） は 、それを考慮することができる。また、セルストレーナーの使用も試料中の細胞クランプの存在を回避するために必要とされる。このステップは、前の細胞染色を行う必要がある。 CD11bおよびCD45の発現に基づき、 図5に示すゲート戦略を使用して、我々は、虚血組織に常駐し、浸潤し、骨髄細胞を識別することができる。ナイーブこれらの細胞は主にCD45の低発現と関連した偽群では、ミクログリアが虚血（ 図4、図5および表5）の後に増殖していることを示すと比較して、虚血性半球におけるこれのCD11b +集団の増加。この差は、虚血性脳（ 図4のCD11b + CD45 ハイ細胞亜集団の出現によって証明されるように、周囲から起因する細胞浸潤に起因する可能性が高いナイーブでかつ偽脳内の低い数字で、図5および表5）。脳虚血中のCD11b +細胞集団への浸潤の寄与は非常に動的なプロセスである4。結紮によるMCAOモデルでは、病変の特徴付けとが行われた時のサイズに応じて30％から合計のCD11b +細胞の60％まで変化することができる。それらはハイのCD11b + CD45の70〜80％を含みとしてのLy-6G +細胞として特徴付け好中球は、最も多数の浸潤細胞集団は、脳虚血のこのモデルを使用して虚血性マウスの脳においてMCAO後24時間で見出される。 LY-6C ハイテクプロ炎症性単球-細胞の残りはほとんどのCD11b + CD45 ハイテクのLy-6Gの亜集団である。このモデルでは、この集団は、MCAO後24〜48時間後の虚血性脳の領域で数が増加するであろう。 図1：MCA結紮するための外科手順（A）側頭筋の収縮の後、小さな開頭マウスの頭蓋骨で行われる。 MCAは、結び目または9/0縫合糸を使用して、スリップノットて連結されている。（B）MCAOモデルで生成された皮質病変の代表的な画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg"> 図2：カバリエリによる梗塞容積の定量化。 （A）、ニッスル染色した脳切片の代表的な画像を永久MCA結紮後24時間。高倍率はニッスル染色後hipocromatic領域を示しているMCAO後に損傷領域（コア）を識別します。ペリ-梗塞（PI）領域も示されている。％梗塞半球（％のIH）として表される梗塞体積の（B）定量シリアルニッスル染色した切片でカバリエリ法を用いて、24時間のMCAO後た（n = 50マウス）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg"> 図3：梗塞領域における好中球の立体解析定量24及び48時間ライゲーション後、光学フラク法を用いた。 MCAO後24時間における虚血領域における（A）浸潤好中球（Ly6G陽性細胞）の代表的な画像。区切りは、梗塞面積を示す。（B、C）光分留による好中球の定量化のための光学的解剖器具の例（D）24での梗塞領域における総好中球の定量及び48時間（n = 4のマウス）。（E）梗塞24でのサイズとMCA結紮48時間後に好中球数の相関関係。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg"> 図4：ナイーブ、シャム虚血（MCAO後24時間）から得られた脳の白血球の代表的なドットプロット散乱分析物理的パラメータ（SSCおよびFSC）に基づいて、半球のCD11b（赤）を発現する事象の集団を同定した。すべてのグループで。この集団は、CD45の発現に応じてゲートされ、特徴付けられた。 CD45（緑）の低レベルを発現する細胞は、虚血性および非虚血性大脳皮質に存在し、およびグリア細胞に相当した。対照的に、細胞（黄色）CD45を高レベルで発現するのみであった虚血性半球にし、偽群においてより少ない程度で見つかった。のCD11b + CD45 こんにちは人口のさらなる分析は、脳卒中後24時間に浸透し、好中球（LY-6G +細胞、青）とプロ炎症性単球（LY-6C hi細胞、オレンジ）が脳内で見つかった主な細胞亜集団であることを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg"> 図5：虚血組織に浸潤し、骨髄細胞から居住者を区別するための戦略をゲーはのCD11b +細胞は、まずアイソタイプ蛍光強度（A）に応じてゲートした。虚血性脳の細胞懸濁液の代表的なドットプロットがパネルのアップ右上に示されている。でまた、この技術を用いて取得するイベントの合計数とのCD11b +事象の数の典型的な値は、（図示されない細胞の/虚血脳半球;（A）のCD11b +細胞のCD45蛍光強度解析は、パネルに表示されB.ゲートさのCD11b +亜集団のCD45およびCD11bの表現の代表的なドットプロット解析は、パネルのアップ右上隅に表示されます。また、CD45 LO CD45 hi細胞の典型的な数は、この技術を用いて虚血性脳半球ごとに獲得した（B）に示されている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2"></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Cavalieriの方法に使用されるパラメータ </td></tr><tr><td>切片厚（T） </td><td> 30ミクロン</td></tr><tr><td>客観</td><td> 10X </td></tr><tr><td>スライスサンプリング率（SSF） </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td>セクション間の距離</td><td> 600ミクロン</td></tr><tr><td>格子間隔</td><td> 100ミクロン</td></tr></tbody></table> 表1：梗塞組織の立体的定量化のために使用されるパラメータ。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> その結果 </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> 梗塞 </td></tr><tr><td>エリア（μm²） </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 2260万</td></tr><tr><td>ボリューム（μm³） </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 135.6億</td></tr><tr><td>音量を補正し プロジェクションオーバー（μm³） </td><td> 899.571億 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt;の134.166億</td></tr><tr><td>エラーの係数（グンダーセン）、 m = 0で</td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td>エラーの係数（グンダーセン）、 m = 1である</td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td>エラーの係数（グンダーセン）、 α（q）は</td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> ％梗塞南半球 </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> 脳浮腫（IPS巻/続きの巻） </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> 表2：ステレオ調査官ソフトウェアを使用してカバリエリ法によって、contralesional ipsilesionalおよび梗塞ボリュームの代表的な例。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td col>光精留塔のために使用されるスパン= "2"&gt; パラメータ </td></tr><tr><td>切片厚（TSF） </td><td> 30ミクロン</td></tr><tr><td>客観</td><td> 100X </td></tr><tr><td>スライスサンプリング率（SSF） </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td>フレームの高さを数える</td><td> 40ミクロ​​ン</td></tr><tr><td>フレーム幅を数える</td><td> 40ミクロ​​ン</td></tr><tr><td> Xグリッドサイズ</td><td> 230ミクロン</td></tr><tr><td> Xグリッドサイズ</td><td> 230ミクロン</td></tr><tr><td>セーフガード</td><td> 2ミクロン</td></tr><tr><td>光Disector身長</td><td> 14ミクロン</td></tr></tbody></table> 表3：ステレオ調査官のソフトウェアを用いて光分留プローブと脳虚血後に浸潤した好中球の立体解析定量化のために使用されるパラメータ。 <table border="0" cellpadding="0" cellspa><tr><td colspan="2"> 光学フラクによる好中球の推定 </td></tr><tr><td>サンプリングサイトの数</td><td> 430 </td></tr><tr><td>ファクター形状</td><td> 6.24 </td></tr><tr><td>カウント合計マーカー</td><td> 166 </td></tr><tr><td>光学フラクによって推定好中球</td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td>エラー（Gundersenの）係数は、m = 0で</td><td> 0.22 </td></tr><tr><td>エラー（Gundersenの）係数はm = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></table> 表4：ステレオ調査官ソフトウェアを使用して、光精留塔プローブを用いた脳虚血後の推定浸潤した好中球の代表的な例。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> のCD11b + </td><td> 好中球 </td><td> 単球 </td><td> 小膠細胞 </td></tr><tr><td> 素朴な </td><td> 25863±4,575.8 </td><td> 473±75.8 </td><td> 525±191.4 </td><td> 19012±1523 </td></tr><tr><td> 24時間後にシャム </td><td> 24563±5263 </td><td> 873±192.5 </td><td> 1124±391.5 </td><td> 23734±2910 </td></tr><tr><td> pMCAOの24時間 </td><td> 47922±23174 </td><td> 4874±748.7 </td><td> 4826±1345 </td><td> 35395±10833 </td></tr></tbody></table> 表5：フローサイトメトリーアプローチと脳虚血後の推定骨髄細胞の代表的な結果。

脳卒中後の脳骨髄細胞の特徴づけは、光分留法を用いて、立体解析によって行う、または脳白血球懸濁液のフローサイトメトリー分析により得ることができる。両方は、虚血性脳に見出さ主骨髄細胞サブセットの正確な表現型の区別を行うために有用な技術である。

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

この手順の全体的な目標は、虚血性脳のマウス骨髄細胞サブセットを 2 つの異なる方法論で特徴付けることです。まず、総頸動脈またはCCAと中大脳動脈またはMCAの遠位幹の両方を閉塞することにより、脳虚血の恒久的なモデルが導入され、主に脳皮質に影響を与える梗塞が生成されます。次に、骨髄系細胞サブセットの立体論理定量化のために、脳の連続冠状切片を目的の細胞の免疫染色し、浸潤した細胞を光学分画器アプローチによって定量します。あるいは、骨髄細胞を機械的解離によって新鮮な脳組織から単離し、フローサイトメトリーによって染色および分析することができます。最終的には、脳虚血後にマウスの脳に浸潤する特定の骨髄系細胞サブセットの正確な定量化と詳細な定性的特性評価は、ステレオ定量とマルチパラメトリックフローサイトメトリーによってそれぞれ達成できます。この虚血シリアルモデルが他の既存のモデルよりも優れている主な利点は、私たちの技術が他の方法よりも死亡率が大幅に低く、研究に必要な動物の数を最小限に抑えることです。この領域は、脳損傷における微小再活性化、血行性マクロファージの血管外漏出、または好中球の役割は何かなど、脳卒中分野の重要な質問に答えるのに役立つ方法を示していますか?彼らは、この論文で実証されたマルチパラメトリックサイトメトリーアプローチに関する正確な神学的定量化により、CE虚血に対する自然免疫応答の両方における骨髄細胞集団の数表現型と機能についての洞察を得ることができます。最初にCCAを結紮するには、手術用顕微鏡で動物の首の腹面の周りに1センチメートルの正中線切開を行います。解剖したら、シックスゼロナイロン縫合糸を使用して、左のCCAを永久的な結び目で閉塞し、遠位MCAを結紮します。次に、側頭筋を右から左に水平に切開します。次に、側頭筋の右側に2回目の垂直切開を行います。側頭静脈を切らないように注意してください。側頭筋を頭蓋骨から引き離し、縫合糸で保持して、頭蓋骨の表面を清潔に保ちます。次に、冷たい滅菌生理食塩水で頭蓋骨を洗浄し、頭蓋骨の透明度を介して左MCAの正確な位置を検出します。MCAが特定されたら、ステンレス鋼のバリを使用して、頬骨弓と扁平上皮骨の間の前頭葉で1ミリメートルの円形開頭術を行います。MCAが露出している頭蓋骨を慎重に取り外します。次に、ナインゼロナイロン縫合糸を使用して、前頭MCA枝と後MCA分岐の間の分岐部の直前に、永久的な結び目で遠位体幹の左MCAを閉塞します。脳を摘出するには、安楽死させたマウスを脊髄のすぐ上で斬首し、皮膚を前方に切開して頭蓋骨を露出させます。次に、側壁と頭蓋骨の基部の接合部に2つの横方向の切り込みを入れ、骨の小片を取り除きます。次に、矢状縫合糸に沿って頭蓋骨に切り込みを入れ、鉗子を使用して各半球を覆う頭蓋骨を切除し、脳を露出させます。へらを使用して脳を頭蓋骨から分離し、それを4%PFA溶液に移します。3時間後、PFAを除去し、脳を30%ショ糖溶液でインキュベートして脳を凍結保護します。48時間後、ショ糖溶液を取り出し、脳をマイナス40°Cのイソップペンタンで素早く凍結し、凍結ミクロトームを使用して30マイクロメートルの冠状脳切片を作成します。クライオ保存料溶液に10個のシリアルセットを収集。各シリアルセットは、スライス間距離が300マイクロメートルの約14〜16個のコロナスライスで構成されています。bgma の後方 1.94 から負の 2.46 の間のマウス脳の適切なサンプリングを確保して、浸潤した好中球の総数を推定します。光学式分画器によるMCA閉塞後、まずラット抗LY six G抗体と適切な二次抗体で好中球を従来の免疫蛍光法により浮遊切片に免疫染色します。次に、脳切片をスーパーフロスト顕微鏡スライドにマウントし、梗塞領域を右側に配置し、ステレオ調査ソフトウェアを開きます。次に、ツールのシリアルセクションマネージャーメニューをクリックし、新しいセクションボタンで新しいセクションを追加します。1 つの 10 番目のスライス サンプリング分数の評価間隔を 10 に設定します。次に、輪郭ダウンメニューから、梗塞領域輪郭ツールを選択します。10 x 対物レンズの下の梗塞領域の輪郭を描くように輪郭を描きます。次に、顕微鏡の対物レンズメニューと対物レンズメニューの下にある100 x対物レンズに切り替えます。プローブメニューで好中球を定量化するには、光学フラクショネーターを選択し、XグリッドサイズとYグリッドサイズの両方でカウントフレームのXY配置を230に設定します。次に、マーカーバーから好中球ボタンを選択し、梗塞領域の汚れた好中球に印を付けます。定量化の結果をスプレッドシートファイルにエクスポートして、脳を単一細胞懸濁液に解離します。示したように脳を切除した後、脳虚血性マウスの脳から同側皮質のコア領域と梗塞領域を解剖します。脳組織の重量を量り、実験グループ間の正常化のために呼び出しごとに5ミリリットルの氷冷RPMIに入れ、次にテフロン乳棒付きのティッシュグラインダーを使用して組織を単一の細胞懸濁液に解離します。細胞懸濁液を50ミリリットルの超遠心チューブに移し、さらに5ミリリットルのRPMI/コール溶液をサンプルに加えます。次に、細胞懸濁液を7,800GSおよび摂氏25度で30分間遠心分離した後。ミエリンに対応する白色の層が溶液の上部に表示されていることを確認します。ミエリン層を慎重に除去し、ペレット化された細胞を含む細胞懸濁液全体を40マイクロメートルのナイロンメッシュストレーナーでろ過します。ストレーナを10ミリリットルのRPMIで洗浄して、すべての細胞がメッシュでろ過されていることを確認してから、溶液を50ミリリットルのチューブに移します。細胞に20ミリリットルのRPMIを加え、細胞をスピンダウンした後、白血球ペレットを再懸濁します。PBSの1ミリリットルで、室温で4ミリリットルの溶解緩衝液で細胞を2〜3分間インキュベートして赤血球を溶解し、次に細胞をスピンダウンします。1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSと氷上の適切な抗体で細胞を標識します。次に、45分後、サンプルを1ミリリットルの冷たいPBSで洗浄し、Resusはペレットを100マイクロリットルのファックスフローバッファーに再懸濁してフローサイトメトリー分析を行います。このモデルは、キャバリエリ法によって推定されるように、中大脳動脈閉塞後 24 時間での梗塞容積の再現性が高いことを特徴としています。以前の研究と一致するように、ニール染色切片では、好中球の浸潤は梗塞のサイズと直接相関しています。さらに、白血球の単離とフローサイトメトリーの特性評価により、虚血性マウスのIPS病変半球の皮質から骨髄細胞を単離することができ、これは細胞懸濁液に見られる全イベントの10〜30%を占め、細胞の破片に関連する低い前方散乱パラメータを示します。CD 11 B陽性細胞は、細胞残骸がこのマーカーで標識されていないことを示唆するより高い前方散乱値を有し、前述のように、FSC閾値を200に設定することによりさらなる分析から除外できることを示唆しています LYとして特徴付けられる好中球 6つのG陽性細胞は、この脳虚血モデルを使用して虚血性マウス脳のMCA閉塞後24時間で発見された最も多数の浸潤細胞集団であり、CD11B陽性CD45高細胞の70〜80%を含む。残りの細胞は、主にCD 11 B、陽性CD 45、高LY 6 G、陰性6 Cの高炎症性単球の亜集団であり、これらは中大脳動脈閉塞後24時間から48時間後に虚血性脳領域に高い数で見られます。このP-M-C-A-Oモデルは、フローサイトメトリーの手順に従って適切に実施すれば、30分で実施することができます。特定の細胞サブセットのソーティングなどの他の方法を実行して、このモデルシステムにおける骨髄系細胞の発現パターン、代謝変化、または酢酸活性などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、虚血モデルを作成する方法、そして最も重要なこととして、マウスの脳損傷または脳虚血後のtpeで2つの異なるアプローチによって浸潤する骨髄細胞の数と表現型を特徴付ける方法をよく理解してください。

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