筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

次の実験の全体的な目標は、尿由来の細胞培養とインテグレーションフリーのリプログラミング法から始めて、筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞またはIPSCを効率的に生成することです。これは、最初に筋ジストロフィー患者から尿サンプルを収集することによって達成されます。第2のステップとして、尿細胞を単離し、尿由来細胞培養物に増殖させます。

次に、尿由来細胞に山中因子を含むセンダイウイルスを形質導入し、12日後に典型的な多能性様コロニーが出現します。最終的に、継代13までに、多能性幹細胞の導入遺伝子の自由状態は、R-T-P-C-R分析によって確認することができる。この技術の主な利点は、レンチウイルスベクターを使用した単離された皮膚線維芽細胞のリプログラミングなどの既存の方法と比較すると、この技術を使用すると、体細胞を患者から非侵襲的に取得し、ウイルスリプログラミングのゼロフットプリント法を使用してIPCを効率的に生成するために使用できることです。

この方法は、筋ジストロフィーの分野における重要な疑問、例えば、これらの状態をヒトへの適用に安全性を懸念せずにin vitroでモデル化する方法など、答えるのに役立ちます。手順を実演するのは、モハマド・ジシャン・アル、ポスドク研究員のコートニー・ゲストング、技術者、メラニー・ライダー大学院生、私の研究室の3人全員です尿サンプルを採取するには、患者に採取の30分前に水分を飲むようにアドバイスすることから始めます尿の約30〜40ミリリットルを収集できるようにします。患者の準備ができたら、以下のアイテムを含む採尿キット、滅菌または清潔なキャッチーおよびサンプル湿った抗菌トイレの入手方法に関する書面による指示、および100ミリリットルの滅菌検体収集カップを患者に渡します。

サンプルが収集されたら、すぐに収集カップを氷の上に置き、サンプルをクーラーで実験室に移します。次に、滅菌ピペットを使用して尿サンプルを滅菌済みの50ミリリットル遠心分離チューブに移し、チューブをGの400倍で室温で10分間回転させます。次に、BSLでは、2つの生物学的安全キャビネットが、ペレットを乱さないように注意しながら、最後の1つである上清のミリリットルを除くすべてを吸引します。

次に、7ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を洗浄し、細胞を再びスピンダウンします。今回は、上清の約0.2〜0.5ミリリットルの最後のものを除いてすべてを吸引します。次に、ペレットを2〜3ミリリットルの尿中前駆細胞またはUPC培地で再利用し、懸濁液をコーティングされていない24ウェルプレートの4〜6ウェルに移し、ウェルあたり0.5ミリリットルの新鮮なUPC培地で培養液を補充します。

培養物を4〜6日間のインキュベーションで観察します。それぞれ1型または2型の腎上皮細胞を表す丸みを帯びたまたは細長い細胞の小さな2〜4細胞コロニーが現れ始めるはずです。2〜3日ごとに媒体を交換し続けます。

コロニーは培養の約9〜15日で急速な拡大段階を経るため、この時点で細胞は80〜90%コンフルエントであるべきであり、細胞を24ウェルプレートの2〜4ウェルに分割してさらに増殖させます。この培養物を細胞継代1としてマークすると、尿細胞は、フローサイトメトリー分析、免疫組織化学染色、または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を通じて系統特異的マーカーについて特徴付けることができ、形質導入シードの数日前に高効率の再プログラミング、ウェルあたり60,000細胞を確保します。1から5までの通路から6ウェルプレートの2つのウェルに培養します。

仙台リプログラミングベクターを調製するには、適切なMLIで4つのOSKM因子をそれぞれ追加して、1ミリリットルの予温UPC培地にサスペンス培地を吸引し、ウイルス懸濁液を尿細胞の1つのウェルにゆっくりと追加して、次の6日間を過ごします。5日目に上清を毎日新鮮なUPC培地と交換します。6日目には、ゼラチンでコーティングされた100ミリメートル四方の培養皿にMESを処理したマイトマイシン種子を注入します。尿細胞をトリプシンで解離し、UPC培地に再懸濁し、メスフィーダープレートごとに5番目の細胞の4番目の細胞の10倍から5番目の細胞の10倍2倍でプレートします。

翌日、UPC培地をヒト胚期またはHES培地に交換し、顕微鏡で細胞をモニターして、形質転換細胞を約12〜18日間観察します。形質導入後、細胞は特徴的な丸石の形態とより高い核対細胞質比を持つクローン性凝集体を形成するはずです。再プログラムされたIPSCクローンを同定するには、TRA 180 1抗体の生細胞染色を行います。

次に、26ゲージのハーフインチ針を使用して、TRA 180 1ポジティブクローナル凝集体をクローンごとに4〜6個の小さな等しいサイズのピースにクロスハッチします。次に、滅菌ピペットチップを使用して、複数のクローンから10〜20個のクロスハッチングピースをピックし、HESCで各ウェルA 24ウェルマトリゲルコーティングプレートに移します。中程度、再プログラムされたクローンをマトリゲル表面に播種してから24〜48時間後。

メディアをIPSCメディアと交換します。ピペットチップを使用して、分化した細胞や汚染されたメスフィーダー細胞を手動でこすり落とし、完全に再プログラムされた多能性ジストロフィーIPSCクローンの精製を支援します。クローンのサイズが約100マイクロメートルに達した後、細胞をEDTAで3分間解離し、次に、ROキナーゼ阻害剤を添加したIPSC培地に懸濁した再プログラムされたジストロフィーIPSCの小細胞凝集体を新鮮なマトリゲル被覆12ホイルプレートにプレート

最後に、遺伝子発現解析と免疫組織化学染色の両方により、各クローンの多能性を確認します。多能性マーカーについては、ヒト尿から単離されたほとんどの細胞は、CD 44、CD 73、およびCD 1 46などの前駆細胞および幹細胞マーカーに対して陽性である。また、この細胞は、α平滑筋アクチンやメントンなどの間葉系マーカーも示します。

単離された細胞のR-T-P-C-Rは、培養物中の細胞集団の混合の証拠を提供します。その点で、ユーロ上皮細胞のサイトケラチン7とUINの1つのAおよび3つのaマーカーの発現が弱い。尿細胞は、0日目の細長い2つの細胞から、再プログラミングの4日目までに丸石のパターンに変化します。

12日目までに、典型的な多能性クローンが観察され、フィーダーフリー条件下でそれらの多能性形態を維持することができます。TRA 180 1の生細胞染色は、再プログラムされたクローンを同定するために使用できます。ベクターおよび導入遺伝子の遊離多能性クローンの生成を確認するために、仙台ウイルスゲノムおよび各外因性OSKM因子に対するプライマーを用いてR-T-P-C-Rを行うことができます。

外因性遺伝子発現は、もはや継代13によって検出されないが、内因性因子のアップレギュレーションが観察され得る。免疫蛍光染色では、IPC上では多能性マーカーの発現が確認されますが、尿細胞では確認されません。ジストロフィンタンパク質および遺伝子の発現は、野生型コントロールおよびジストロフィー細胞株からのこれらの代表的な画像で実証されているように、ウェスタンブロッティングおよびR-T-P-C-Rをそれぞれさらに免疫蛍光染色することによって検証することができます。

一度習得すると、この手法を使用して、ucsのeneフリーリプログラミングを実現できます。この手順の後、数週間以内に、IPCを心筋細胞または骨格筋細胞に区別して、筋ジストロフィーの背後にあるメカニズムをさらに理解することができます。