Name: 筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ筋ジストロフィー患者から尿由来細胞を用いた非侵襲的なiPSC生成法。仙台ウイルスによる無統合リプログラミングで、12日後に多能性コロニーが出現し、13世代目でトランスジーンフリー状態を確認できます。

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>jove_content<このプロトコルの開発は、助成金番号8UL1TR000055を通じて、Advancing a Healthier WisconsinおよびNational Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Healthによって支援されました。その内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

注：患者、および/またはその保護者は、研究を承認した治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与える必要があります。 1.バッファとメディアの準備<ol><li>洗浄緩衝液：リン酸緩衝食塩水（PBS）の99 mlの100×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を1ml（100 U / mlペニシリン+ストレプトマイシン100μg/ mlの）を追加し、洗浄緩衝液100mlを調製する。 </li><li>尿中前駆細胞（UPC）ミディアム：ケラチノサイト無血清（KSF）ミディアム+前駆細胞培地を等量混ぜ、UPC媒体を作製した。 <ol><li> KSF中：上皮成長因子の5 ng / mlの（EGF）、ウシ下垂体抽出物の50 ng / mlの（BPE）、コレラ毒素の30 ng / mlの、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（100 Uを追加し、ケラチノサイト培地を調製するために/ mlペニシリン、500ミリリットルKSF培地に100μg/ mlのストレプトマイシン）。 </li><li>前駆細胞培地：10％FBSでハム-F12培地とサプリメントの四分の一を含むDMEMの4分の3の追加、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、0.1nMのコレラ毒素、5 / mlのインスリン、1.8×10 -4 Mのアデニン/ mlのトランスフェリン、2をx 10 -9 Mのトリヨードサイロニン、10ng / mlのEGF、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液を5μg。 </li></ol></li><li>のhES培地：/ 20％KO血清代替（K-SR）を追加し1×MEM非必須アミノ酸、2mMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノール、20ng / mlのbFGFおよびペニシリン/ストレプトマイシン400 mlのDMEM F12培地。 </li></ol> 2.尿サンプルコレクション<ol><li>尿の十分な量（〜30〜40ミリリットル）を収集することができることを保証するために採尿に30分前に流体を飲むように患者に指示します。 </li><li>患者および/またはその保護以下の項目を含む尿採取キットを与える：（1）滅菌またはクリーンキャッチ尿サンプルを入手する方法についての説明書、（2）湿った抗菌toilettes、及び（3）を100mlの滅菌標本コレクションカップ。サンプルを収集するために患者に指示します。 </li><li>直ちに氷上に尿サンプルを配置し、laboraに移転クーラーでトーリー。すぐに細胞単離のための尿を処理します。遅延が避けられない場合には、細胞の生存率の損失を最小限に抑えて、最大4時間氷上で試料を保存する。 </li></ol> 3.単離と尿細胞の拡大注：BSL2生物学的安全キャビネット内無菌条件下で、次の手順を実行します。 <ol><li>滅菌ピペットを用いて、転送尿サンプルを50ml遠心管に無菌である。 RTで10分間、400×gで遠心分離する。 </li><li>チューブ内の1ミリリットルを残して上清を吸引。細胞ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li>再懸濁洗浄緩衝液7mlの中に複数の管からペレットを組み合わせて、RTで10分間、400×gで遠心分離を繰り返し。 </li><li>慎重に細胞ペレット及び上清〜0.2〜0.5ミリリットルを残して、上清を吸引除去する。尿中前駆細胞（UPC）培地2〜3mlの中で再懸濁し、国連の4〜6ウェルにサスペンションを転送コー​​トした24ウエルプレート。 </li><li> 72時間後、ウェル当たり新鮮UPC培地の0.5ミリリットルと文化を補完し、2〜3日ごとに後の培地に変更します。プレートに付着していない赤血球と扁平上皮細胞を培地変更で削除されます。 </li><li> 4-6日後の培養を監視します。 注：小2-4細胞コロニーが現れ始めます。細胞は、それぞれタイプIまたは腎上皮のタイプII（RE）のセル3を表す丸めまたは伸長される。 </li><li>細胞が表示されたら、彼らは急速な拡大期を受けることになるので、2〜3日毎に培地を変更します。 </li><li>細胞がプレーティング後9-15日を中心に、80〜90％のコンフルエンスに到達すると、さらなる拡大のために24ウェルプレートの2-4ウェル上に細胞（15,000-18,000細胞/ cm 2）を解離して通過。細胞継代1（P1）としてこれをマークします。 </li><li>フローサイトメトリー分析を介して系統仕様の尿細胞を特徴づける、immunohistochemiCalの染色または逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を介し。 </li><li>長期間の凍結保存のために（DMEM、10％血清および10％DMSOを補った）孤立した尿細胞（セクション4）を再プログラムまたは凍結培地にそれらを凍結する。 </li></ol>センダイウイルスを使用する4.尿細胞リプログラミング注：トランスフェクションエージェントを操作しながら適切な取り扱いとPPE（個人用保護具）の使用が推奨されます。 BSL2生物学的安全キャビネット内無菌状態で、次の手順を実行します。薬剤および/またはトランスフェクトされた細胞をトランスフェクトする適切な処分は、環境と健康の危険のリスクを回避することをお勧めします。以下に詳述するように、尿細胞の再プログラミングについては、メーカーのフィーダー依存プロトコルへの変更を加えて仙台リプログラミングキットを使用しています。 <ol><li>センダイウイルスを用いた高効率な再プログラミングを確保するために、使用が急速である尿細胞の1-5通路LYは分裂。細胞が十分に複製または老化にならない場合は、彼らが効率的に再プログラムしないので、それらを捨てる。 </li><li> 6ウェルプレートの2つのウェルにおける種子ウェル当たり60,000個の細胞。マーク·デイ-2としてこの。細胞播種密度を調整し（5×10 4から 9×10 4個の細胞をウェルあたり）0日によって80〜90％コンフルエンスに到達するために必要である。 </li><li> 0日目（細胞を播種後48時間）で、4 OSKM因子のそれぞれを含む仙台リプログラミングベクター（SeVの）を調製。予め温めUPC培地1mlにベクトルの各々を加える。尿細胞を再プログラミングするための十分である、1〜1.5のMOI（5〜7.5×10 5 CIU）を使用します。メディアを吸引し、ゆっくりと尿細胞の1ウェルに1ミリリットルUPC +のSeVを追加します。形質導入ネガティブコントロールとして第2のウェルを使用してください。 </li><li> 1日目に、新鮮なUPC媒体とUPC + SeVの媒体を交換してください。いくつかの細胞死は、ウイルス細胞毒性によるものでは24時間後に見られている。 </li><li>再プログラムCLONの効率に応じて、Eの形成とコンパクトな形態は、6日目または7まで毎日培地を変え続ける。 </li><li>前に形質導入した細胞（5日目または6）、マイトマイシンC（3時間、10μg/ ml）を0.1に5×10 4細胞/ cm 2の密度で処理された、MEFのメッキをMEFフィーダープレートを準備の解離の一日％のゼラチンは100ミリメートル2培養皿をコーティングした。 </li><li>次の日（6日目または7）、0.25％トリプシンで細胞を解離UPC培地プレートに5×10 4細胞を再懸濁する- 2×10 5細胞/ 100のmm 2のMEFフィーダープレート。 </li><li>次の日は、hES培地に切り替えて、毎日培地を変更します。形質転換細胞を監視するために、顕微鏡下で細胞を観察します。 注：細胞は、特徴的な敷石状形態を有するクローンの凝集体を形成し、細胞質の比率（12-18日後に形質導入​​）に高い核を有する。 </li><li>形質導入後2〜3週間以内に、コロニーをピックアップし、CLONのための新しいプレートに移すアル展開。 </li><li> 37℃で1時間、TRA-1-81抗体で細胞をインキュベートすることによって、IPSCクローンを選択するための生細胞染色を行う CO 2インキュベーター中で37℃で1時間、特定の蛍光色素結合二次抗体との対比染色に続いてCO 2インキュベーター内でC°。 </li><li>小さな等しい大きさの小片（クローンあたり4-6個）にクロスハッチ大きなTRA-1-81陽性のIPSCクローンに26 G 1.5インチの針を使用してください。 </li><li>マトリゲル（10μgの/ cm 2程度）の各ウェルに複数のクローンから10-20クロスハッチング部分をピックアップし、転送するために滅菌ピペットチップを使用して、hES培地で24ウェルプレートをコーティングさ。 注：単一のウェルに個々にメッキ単一のクローンからの小品が展開または多能性を維持していない。 </li><li>再プログラムされたクローンは、マトリゲル表面に取り付けられた後のIPSC媒体へのhESからの変化24〜48時間。 </li><li>マトリ被覆プレート上のメンテナンス時に、手動でSCRAPE-オフあらゆる分化した細胞または完全に再プログラムし、多能性ジストロフィーIPSC（MD-IPSC）のクローンを濃縮するためにピペットチップを用いてMEFフィーダー細胞を汚染する。 </li><li>個々のクローンは、〜100μmのサイズに達した後、3分間の0.48 mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）溶液を用いて解離および5μMY27632補充したIPSC培地に懸濁MD-iPS細胞の小細胞凝集体（、RhOなどキナーゼ阻害剤をめっきすることによってクローンを拡大する）新鮮なマトリゲル上で（を10μg/ cm 2）をコーティングした12ウェルプレート。毎日のIPSC媒体を変更します。 </li><li>各クローンの完全な再プログラミングはOSKM遺伝子および多能性マーカー（のOct3 / 4、TRA-1-81）の免疫組織化学染色の両方の遺伝子発現解析によって決定することができる。多能性の可能性の厳格な評価は完全に再プログラムIPSC線が三胚葉に分化することができる確認するために用いられるべきである。これは、胚様体（EB）形成および分化アッセイによって、またはターどちら達成することができる血腫形成アッセイ。 </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
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<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

性IPSCを使用して、心血管疾患のモデリングは、遺伝的寄与4-6を理解するための一般的なアプローチになってきている。患者から細胞サンプルを取得するいくつかの予期せぬ困難、特に幼い子供たちは、そのような尿収集などの非侵襲的アプローチのオプションを提供することによって回避することができる。この若い患者集団では、再プログラミングのための十分な尿細胞を得るのに十分な尿量を収集することはしばしば困難である。前採尿に流体30分を飲むように若い患者をコーチングすることは尿細胞単離の成功を向上させます。しかし、繰り返し尿コレクションがこの集団に必要な場合があります。我々は、合わせて、筋ジストロフィーを有する患者からのUCの単離および培養を最適化するために、2つの異なるプロトコル3,7を適応している。 誘導多能性幹細胞は、筋ジストロフィーpatienから皮膚線維芽細胞または尿細胞のいずれかから生成されているTS 1,2。しかし、両方の再プログラミングプロトコルは体細胞に再プログラミング因子を導入するレンチウイルスに依存した。導入遺伝子...

心筋症は、デュシェンヌ型とベッカー型筋ジストロフィー（MD）患者の死亡原因の第2位である。 X連鎖ジストロフィン遺伝子の変異が1で発生するものの：3500男性の出生、非常に少ない、プログレッシブ心筋の損傷につながる分子や細胞のイベントについて知られている。筋ジストロフィー患者由来のヒト誘導多能性幹細胞は、基礎疾患の機構を研究するために、薬剤は、1,2のスクリーニングに使用するための新規なツールとして浮上している。 皮膚生検または血液サンプルの予想不快感は、研究参加の同意を与えるために若い患者及び/またはその保護者を説得することができる。尿サンプルは、再プログラミング方法に修正可能である体細胞の非侵襲的な供給源である。我々は最近、筋ジストロフィー患者から採取した尿細胞は培養することができることを示しかつ効率的に山中因子とレトロウイルス形質導入を用いて、iPS細胞（に再プログラムしているあるOct3 / 4、Sox2の、Klf4及びc-Myc; OSKM）1。レトロウイルス遺伝子送達の欠点は、宿主染色体への初期化遺伝子のランダムな統合です。この制限を克服するために、我々は、尿細胞再プログラミングのための非組み込み型センダイウイルスを使用している。 このプロトコルは、さらなる研究のための心筋細胞または他の細胞型に分化させることができる筋ジストロフィー患者から単離された尿細胞のセンダイウイルス再プログラミングについて詳しく説明します。このプロトコルは、他の患者の特定の疾患に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>4オンス蓋付き標本カップ</td><td>STL尿サンプル収集用</td><td>医療用供給</td><td>M9AMSAS340</td></tr><tr><td>15 ml BD-ファルコンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD-ファルコンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>丸型ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 仙台リプログラミングキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10010-023</td><td></td></tr><tr><td>溶連菌ペン w/o グルタミン&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>37°で暖かい;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>RPMIミディアム1640</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ11875-0933333333377</td><td>°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>B-27サプリメントw /インスリン(50x)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ17504-0443333</td>°C<td>で暖かい;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>B-27サプリメントw / oインスリン(50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA37</td><td>°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>DMEM / F12(1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>37°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>Versene、1:5,000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>37°で暖かい。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>bFGF(10&micro;g)</td><td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>Cell Counter Cartridges</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum (500&nbsp;ml Bottle)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>回復細胞培養凍結中</td><td>期生命技術</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ケラチノサイト-SFM(1x)、リキッド</td><td>ライフ技術</td><td>17005-042333</td>°C<td>で暖かい。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>37°Cで暖かい;</td></tr><tr><td>ハムのF-12栄養ミックス</td>を使用する前のCウォーターバス&nbsp;<td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>37°Cで暖かい;EGF</td></tr><tr><td>組換えヒトタンパク質、液体形態</td><td>生命技術</td><td>PHG0311L</td><td>37°Cで暖かい前にCウォーターバス。Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>インスリン、ヒト組換え体、亜鉛ソルン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ12585-014</td><td>37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td>幹<td>細胞技術</td><td>5940</td><td>37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>ROCK阻害剤(Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354277</td><td>hESC認定マトリックス、LVED</td></tr><tr><td>フリーRNeasyミニキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成キット</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS 認定</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Warm in 37 &deg;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>アデニンバイオ試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A2786-5G</td><td>37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>コレラ毒素ビブリオコレラ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td>ウォーム<td>37°C;使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H0888-1G37</td><td>°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr>ヒト<td>Sigma Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>からのホロトランスフェリン</td><td>37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-チロニンナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous 封入剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</</td></tr><tr><td>strong>Mouse anti CD44 - 標識 FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗CD146 - PEで標識</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗CD73 - PEで標識</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗アルファ - 平滑筋アクチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ビメンチン</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗 - TRA-1-81</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ411100</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ反10月3/4</td><td>サンタクルーズ</td><td>バイオテクノロジーSC-9081</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ジストロフィン</td><td>ライカバイオシステム</td><td>ズNCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

異栄養性心筋症は、筋ジストロフィーのあまり理解結果である。筋ジストロフィーの患者から誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）を生成するインビトロ疾患モデル系のための貴重な細胞源であり、薬剤スクリーニング研究のために使用することができる。患者由来の尿細胞はジストロフィー性心筋1をモデル化するために、誘導多能性幹細胞への成功した再プログラミングに使用されてきた。ベクター系を統合する安全性の問題に対処する、我々は、筋ジストロフィーの患者から採取した尿細胞に山中因子の形質導入のための非組み込み型センダイウイルスベクターを使用してプロトコルを提示する。このプロトコルは、2〜3週間以内に完全に再プログラムされたクローンを生成します。多能性細胞は、流路13によりベクターフリーです。これらの異栄養性IPSCは、心筋細胞に分化し、病気のメカニズムを研究または薬物スクリーニングするために使用することができる。

（それぞれ97.37パーセント、97.09パーセント、および97.3％; 図1Aおよび図1B）は、ヒト尿から単離されたほとんどの前駆細胞は、CD44、CD73、およびCD146などの尿路上皮前駆細胞および周皮細胞のマーカーに対して陽性である。これらの細胞は、α平滑筋アクチン、およびビメンチン（ 図1B）のような他の間葉系マーカーを発現した。サイトケラチン-7（CK-7）、ウロプラキン（UP）-Ia＆-IIIa、尿路上皮細胞系列のマーカー（ 図1C）の弱い発現が存在するようにRT-PCR分析は、培養物中の細胞の混合集団の証拠を与える。 再プログラミングステップは、図2Aに概略的に要約されている。代表的な画像は、プロトコル（ 図2B）を通じて異なる時点の間、細胞の形態を示す。尿細胞は、再プログラミング中に石畳のパターン（4日目）に細長い、II型細胞（0日目）から変換する。 BY 12...

このプロトコルは、筋ジストロフィー患者からの尿由来細胞の分離のための詳細な手順を伴います。それらは、センダイウイルスの形質導入を通じて効率的かつ迅速に再プログラミングされます。

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

次の実験の全体的な目標は、尿由来の細胞培養とインテグレーションフリーのリプログラミング法から始めて、筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞またはIPSCを効率的に生成することです。これは、最初に筋ジストロフィー患者から尿サンプルを収集することによって達成されます。第2のステップとして、尿細胞を単離し、尿由来細胞培養物に増殖させます。次に、尿由来細胞に山中因子を含むセンダイウイルスを形質導入し、12日後に典型的な多能性様コロニーが出現します。最終的に、継代13までに、多能性幹細胞の導入遺伝子の自由状態は、R-T-P-C-R分析によって確認することができる。この技術の主な利点は、レンチウイルスベクターを使用した単離された皮膚線維芽細胞のリプログラミングなどの既存の方法と比較すると、この技術を使用すると、体細胞を患者から非侵襲的に取得し、ウイルスリプログラミングのゼロフットプリント法を使用してIPCを効率的に生成するために使用できることです。この方法は、筋ジストロフィーの分野における重要な疑問、例えば、これらの状態をヒトへの適用に安全性を懸念せずにin vitroでモデル化する方法など、答えるのに役立ちます。手順を実演するのは、モハマド・ジシャン・アル、ポスドク研究員のコートニー・ゲストング、技術者、メラニー・ライダー大学院生、私の研究室の3人全員です尿サンプルを採取するには、患者に採取の30分前に水分を飲むようにアドバイスすることから始めます尿の約30〜40ミリリットルを収集できるようにします。患者の準備ができたら、以下のアイテムを含む採尿キット、滅菌または清潔なキャッチーおよびサンプル湿った抗菌トイレの入手方法に関する書面による指示、および100ミリリットルの滅菌検体収集カップを患者に渡します。サンプルが収集されたら、すぐに収集カップを氷の上に置き、サンプルをクーラーで実験室に移します。次に、滅菌ピペットを使用して尿サンプルを滅菌済みの50ミリリットル遠心分離チューブに移し、チューブをGの400倍で室温で10分間回転させます。次に、BSLでは、2つの生物学的安全キャビネットが、ペレットを乱さないように注意しながら、最後の1つである上清のミリリットルを除くすべてを吸引します。次に、7ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を洗浄し、細胞を再びスピンダウンします。今回は、上清の約0.2〜0.5ミリリットルの最後のものを除いてすべてを吸引します。次に、ペレットを2〜3ミリリットルの尿中前駆細胞またはUPC培地で再利用し、懸濁液をコーティングされていない24ウェルプレートの4〜6ウェルに移し、ウェルあたり0.5ミリリットルの新鮮なUPC培地で培養液を補充します。培養物を4〜6日間のインキュベーションで観察します。それぞれ1型または2型の腎上皮細胞を表す丸みを帯びたまたは細長い細胞の小さな2〜4細胞コロニーが現れ始めるはずです。2〜3日ごとに媒体を交換し続けます。コロニーは培養の約9〜15日で急速な拡大段階を経るため、この時点で細胞は80〜90%コンフルエントであるべきであり、細胞を24ウェルプレートの2〜4ウェルに分割してさらに増殖させます。この培養物を細胞継代1としてマークすると、尿細胞は、フローサイトメトリー分析、免疫組織化学染色、または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を通じて系統特異的マーカーについて特徴付けることができ、形質導入シードの数日前に高効率の再プログラミング、ウェルあたり60,000細胞を確保します。1から5までの通路から6ウェルプレートの2つのウェルに培養します。仙台リプログラミングベクターを調製するには、適切なMLIで4つのOSKM因子をそれぞれ追加して、1ミリリットルの予温UPC培地にサスペンス培地を吸引し、ウイルス懸濁液を尿細胞の1つのウェルにゆっくりと追加して、次の6日間を過ごします。5日目に上清を毎日新鮮なUPC培地と交換します。6日目には、ゼラチンでコーティングされた100ミリメートル四方の培養皿にMESを処理したマイトマイシン種子を注入します。尿細胞をトリプシンで解離し、UPC培地に再懸濁し、メスフィーダープレートごとに5番目の細胞の4番目の細胞の10倍から5番目の細胞の10倍2倍でプレートします。翌日、UPC培地をヒト胚期またはHES培地に交換し、顕微鏡で細胞をモニターして、形質転換細胞を約12〜18日間観察します。形質導入後、細胞は特徴的な丸石の形態とより高い核対細胞質比を持つクローン性凝集体を形成するはずです。再プログラムされたIPSCクローンを同定するには、TRA 180 1抗体の生細胞染色を行います。次に、26ゲージのハーフインチ針を使用して、TRA 180 1ポジティブクローナル凝集体をクローンごとに4〜6個の小さな等しいサイズのピースにクロスハッチします。次に、滅菌ピペットチップを使用して、複数のクローンから10〜20個のクロスハッチングピースをピックし、HESCで各ウェルA 24ウェルマトリゲルコーティングプレートに移します。中程度、再プログラムされたクローンをマトリゲル表面に播種してから24〜48時間後。メディアをIPSCメディアと交換します。ピペットチップを使用して、分化した細胞や汚染されたメスフィーダー細胞を手動でこすり落とし、完全に再プログラムされた多能性ジストロフィーIPSCクローンの精製を支援します。クローンのサイズが約100マイクロメートルに達した後、細胞をEDTAで3分間解離し、次に、ROキナーゼ阻害剤を添加したIPSC培地に懸濁した再プログラムされたジストロフィーIPSCの小細胞凝集体を新鮮なマトリゲル被覆12ホイルプレートにプレート化します。最後に、遺伝子発現解析と免疫組織化学染色の両方により、各クローンの多能性を確認します。多能性マーカーについては、ヒト尿から単離されたほとんどの細胞は、CD 44、CD 73、およびCD 1 46などの前駆細胞および幹細胞マーカーに対して陽性である。また、この細胞は、α平滑筋アクチンやメントンなどの間葉系マーカーも示します。単離された細胞のR-T-P-C-Rは、培養物中の細胞集団の混合の証拠を提供します。その点で、ユーロ上皮細胞のサイトケラチン7とUINの1つのAおよび3つのaマーカーの発現が弱い。尿細胞は、0日目の細長い2つの細胞から、再プログラミングの4日目までに丸石のパターンに変化します。12日目までに、典型的な多能性クローンが観察され、フィーダーフリー条件下でそれらの多能性形態を維持することができます。TRA 180 1の生細胞染色は、再プログラムされたクローンを同定するために使用できます。ベクターおよび導入遺伝子の遊離多能性クローンの生成を確認するために、仙台ウイルスゲノムおよび各外因性OSKM因子に対するプライマーを用いてR-T-P-C-Rを行うことができます。外因性遺伝子発現は、もはや継代13によって検出されないが、内因性因子のアップレギュレーションが観察され得る。免疫蛍光染色では、IPC上では多能性マーカーの発現が確認されますが、尿細胞では確認されません。ジストロフィンタンパク質および遺伝子の発現は、野生型コントロールおよびジストロフィー細胞株からのこれらの代表的な画像で実証されているように、ウェスタンブロッティングおよびR-T-P-C-Rをそれぞれさらに免疫蛍光染色することによって検証することができます。一度習得すると、この手法を使用して、ucsのeneフリーリプログラミングを実現できます。この手順の後、数週間以内に、IPCを心筋細胞または骨格筋細胞に区別して、筋ジストロフィーの背後にあるメカニズムをさらに理解することができます。

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筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

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