Name: 代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: 学ぶ舌下免疫療法を用いてマウスの肺における自然免疫応答を増強し、Streptococcus pneumoniaeによる致死性肺炎から保護する方法。流式細胞法とリアルタイムPCRを用いて免疫細胞を解析し、呼吸器感染症に対する新たな治療戦略を探索する。

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私たちは、精製された鞭毛菌を提供してくださったリールの感染免疫センターのJean-Claude Sirard博士と、肺炎球菌株を提供してくださったウルグアイ保健省国立参考研究所所長のテレサ・カモウ博士に感謝します。
著者は、ビデオ制作と編集全体を通じての彼らの献身と努力に対して、BichoFeo Producciones-UruguayのDiego Acosta氏とIgnacio Turel氏に感謝の意を表したいと思います。 
この作業は、国立研究イノベーション庁からの助成金とBE_POS_2010_1_2544、ウルグアイのANII PR_FCE_2009_1_2783、ウルグアイのPEDECIBAの基礎科学開発プログラム、ウルグアイのCSIC-Universidad de la Repúblicaの科学研究部門委員会によって支援されました。

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著者らは開示するものは何もない。

治療剤の舌下投与は気道における免疫応答を調節するための有用な手段として実証されている。呼吸器疾患の治療のためのSLITの主な利点は、鼻腔内投与31に基づく治療法よりも安全である、肺や鼻孔への化合物の直接の送達を必要としないことである。 舌下免疫療法は、いずれかのアレルギー性炎症および喘息32の症状を改善するか、またはここに示されているように、急性肺感染症を治療するために先天性免疫機構の一時的活性化を誘導するために、調節応答の誘導のために、さまざまな方法で免疫応答を調節するために使用することができる。 このビデオで提示マウスモデルは、SLITための治療剤としての異なる化合物のスクリーニングのための便利な方法である。 この動物モデルは影響を決定するために有用な手段を提供肺の免疫応答、ならびに他の器官（ 例えば 、リンパ節または遠位粘膜部位を排出する）in vitroモデルを使用することによって模倣することができないでSLITの。舌下免疫療法を用いて得られた結果を説明するいくつかの論文がありますが、舌下投与の手順のための詳細な方法は、まだ利用可能とされていない。さらに、モデルは、気道における全身ならびに局所防御を付与することを目的舌下ワクチンの評価のために用いることができる。 添付のビデオに示されるように、化合物の舌下投与を容易に広範囲なトレーニングを必要とせずに行うことができる簡単な手順である。一般的には、動物取扱に習熟人が、このプロトコールに記載されているように注射用麻酔薬を使用した10匹のマウスのグループにスリットを実行するために1時間が必要になります。肺炎球菌チャレンジが同様に実行される場合、追加の90分を準備する必要があります細菌懸濁液と動物の鼻腔内チャレンジを行う。 ここで紹介するのFACSプロトコルは、リンパ節だけでなく、肺の「細胞動態への影響を排液、投与ローカルサイトのSLITの影響の便利な特性評価を可能にする。 気管支コンテンツおよび肺実質の個別の分析では、組織内にとどまるものから、気道の免疫常駐し、浸潤細胞型を区別することが重要です。 BALの内容の分析は、肺胞マクロファージの代謝回転の研究だけでなく、異なる処理によって誘導された肺胞腔、 例えば 、PMNの、好酸球、単球への細胞動員のダイナミクスを可能にする。 BALはまた、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）または舌下ワクチン接種後に誘発された分泌されたIgA抗体の検出によって分泌されるサイトカインおよびケモカインの存在を評価するために使用することができる。肺の「組織に関する研究他の細胞型、古典的樹状細胞、T細胞およびB細胞の特徴付けを可能にする。 FACS分析のためのBAL試料及びリンパ節の調製は簡単である。サンプル収集の後、通常は60分〜20のサンプルについて染色プロトコルを完了するために必要とされる。対照的に、肺または舌下組織からの細胞の単離は、細胞外マトリックスの消化が必要とされるので、より多くの時間を必要とする。舌下経路により送達される治療剤の吸収は、 生体内撮像系を用いて 、蛍光または放射性標識された分子を追跡することによって対処することができる。 舌下免疫療法は効果的に呼吸器疾患を治療または予防するために使用することができ、気道ならびに全身的に免疫応答を誘導するための魅力的な方法である。スリットiの後に気道における免疫応答の寛容対活性化を決定メカニズムの解明単独でまたは別の呼吸器状態に対する利用可能な治療と組み合わせて使用​​することができる新たな治療戦略の合理的設計を可能にするために重要だ。

この作業の全体的な目標は、急性呼吸器感染症(ARI)の治療に対する舌下免疫療法の利点を説明し、他の投与経路、すなわち鼻腔内投与と比較したこの送達経路の利点を提示することです。
ARIは、特に5歳未満の子供において、毎年何百万人もの死者を出しています。Streptococcus pneumoniaeは、乳児および高齢者における細菌性肺炎の主要な病因の1つとして残っています1,2。現在、利用可能な主な治療法は抗生物質の使用に依存していますが、耐性株は絶えず発生しています3,4。
SLITは、全身レベルおよび粘膜レベル、特に気道5で広範な反応を誘発します。インフルエンザ感染に対する有効性が証明されており、体液性および細胞性応答の産生により長期的な防御を促進します6,7。また、舌下経路で送達される細菌溶解物による予防的治療により、高齢者の慢性閉塞性気管支炎の増悪が減少し8、小児の呼吸器感染症の再発を予防することが示されています9。SLITは、アレルギーや喘息の治療に広く使用されています。臨床研究では、気道の免疫応答を調節する有効性だけでなく、その安全性も実証されています10。製薬会社や研究者のSLITへの関心が高まっているにもかかわらず、化合物の舌下送達後の粘膜免疫応答の誘導に関与するメカニズムは不明のままです。近年、アレルゲン脱感作に伴う耐性促進のメカニズムに注目が集まっています。樹状細胞やマクロファージのように、舌下粘膜に常在する細胞と動員された細胞は、SLIT11-13 後に耐性を促進できることが提案されています。口腔粘膜の樹状細胞は、IFN-γおよびIL-10産生Tヘルパー細胞11を促進するとともに、遠位性器粘膜に再循環し、CD8+ T細胞14を促進することができる。しかし、SLITが自然細胞に及ぼす影響や、急性呼吸器感染症における病原体のクリアランスを改善する能力については、ほとんど分かっていません。
肺炎球菌感染の自然な制御は、局所的な自然防御の効率的かつ迅速な活性化に大きく依存します。私たちは以前に、TLR5およびNLRC4アゴニストであるフラジェリン(FliC)の単回鼻腔内投与による肺の自然免疫の増強が、肺炎連鎖球菌血清型1の臨床的分離株の致死量で挑戦されたマウスの75〜100%を保護することを示しました。この防御は、GR1+細胞(多形核好中球、PMNの可能性あり)の局所動員に依存し、抗体、B細胞またはT細胞15に依存しないことが示されました。
フラジェリンは細菌の鞭毛の構造成分です。その単量体型では、細胞外FliC16を感知するTLR5と細胞内フラジェリン17,18を検出するNLRC4/NAIP5インフラマソームの2つの病原体認識受容体(PRR)によって認識されます。FliCがPRRによって感知されると、重要な炎症反応が引き起こされます。私たちと他の人々は、サルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムから精製されたFliCを肺に点滴すると、特に肺の上皮によって認識されると、ケモカインとサイトカインの迅速な産生を促進し、免疫細胞、主にPMNs15,19-21の気道への動員を組織化することを実証しました。一過性ではありますが、FliCの経鼻送達後に気道に起こる大量の好中球浸潤は、ヒト用の臨床治療に移行する場合に懸念事項となる可能性があります。過度の炎症は、肺の機能に悪影響を与える可能性があります。さらに、免疫賦活分子の鼻腔内送達は、顔面神経麻痺および/または脳毒性を引き起こす可能性があることが示されています22-24。
舌下免疫療法は、鼻腔内経路と比較して、気道の免疫応答を調節するためのより安全な代替手段を提供します。非侵襲的で、痛みがなく、シンプルで、患者のコンプライアンスが良好です25。さらに、前述のように、製剤の直接鼻腔内または肺内送達に関連するリスクなしに、呼吸器粘膜に保護反応を誘導することができます。舌下経路は、肺の免疫系に大きな影響を与えるが、毒性があることが証明されている分子や、鼻腔内投与すると大きな炎症を引き起こす分子を送達するために、代わりに使用することができます。これらの利点に加えて、舌下免疫療法の製剤は、非滅菌製品をこのルートで送達でき、内毒素ショックがSLITの懸念事項ではないため、製造コストが低くなります。一方、肺に免疫応答を誘導するには、鼻腔内または非経口経路で使用されるものと比較して、高用量の免疫刺激化合物が必要であることに注目する価値があります。また、SLITのマウスモデルを用いる場合、製剤が沈着する解剖学的部位が小さいため、高濃度の溶液が必要です。
以前に公開されたデータに基づいて、フラジェリンをモデル免疫賦活薬とする舌下免疫療法を使用した防御モデルを開発しました。我々は、フラジェリンの単回投与が血清型1株によって引き起こされる侵襲性肺炎球菌性肺炎に対して60%の生存を誘発し、対照群のすべてのマウスが5日以内に感染により死亡したことを実証した。フローサイトメトリー解析では、フラジェリンによる舌下治療後に保護動物の気道に動員されるPMNの数が多いことが示され、これらの細胞が舌下免疫療法によって誘導される防御のメカニズムに関与している可能性が示唆されています。
このビデオでは、舌下免疫療法の実施方法と、舌下粘膜から関連組織を回復させる方法、リンパ節の排出方法、肺や気道のさらなる分析を行う方法を詳細に説明しています。さらに、FACS分析のための細胞調製の一般的な手法を示し、肺炎連鎖球菌懸濁液の調製方法と、マウスで鼻腔内感染を実施して急性感染モデルを設定する方法を簡単に示します。

<table><tbody><tr><td>ケタミン溶液(50mg / ml)</td><td>ファーマサービス、ウルグアイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シラシン溶液(2%)</td><td>Portinco S.A.、ウルグアイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌1mlシリンジ</td><td>モダン、ウルグアイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌27G針</td><td>モダン、ウルグアイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ゼネラルエレクトリックヘルスケア</td><td>E15885</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Type-I Collagenase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 標識ラット抗マウス IgG2b 抗 CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>クローン M1/70</td></tr><tr><td>APC 標識ハムスター 抗マウス IgG1 抗 CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>クローン HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7抱合ラット抗マウスIgG2a抗Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>クローン1A8</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>Laboratorio Farmaco Uruguayo、ウルグアイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆寒天</td>BD <td>Difco、フランス</td><td>236950</td><td></td></tr>除<tr><td>細動羊血液</td><td>バイオキー、ウルグアイ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10ピペット</td><td>ギルソン</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペット</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペット</td><td>キャップ</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターチップ p10</td><td>Greiner</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターチップp200</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターチップp1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼ファインチップ鉗子&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>湾曲したストレート</td></tr><tr><td>ドレッシング組織鉗子</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>長さ 8 インチ</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>ストレート&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>闉</td></tr><tr><td>メイヨーシザース</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>サキラ メディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌生検パンチ &オスラッシュ; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>2079D</td><td>直径5mmも使用可能</td></tr><tr><td>滅菌済み1.5mlチューブ</td><td>Deltalab</td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み15mlチューブ</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み50mlチューブ</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清ピペット 5ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清ピペット 10ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清学的ピペット 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット、クラス II</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 シリーズ、タイプ A2</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアイソレーター&nbsp;ラック</td><td>レア&nbsp;IsoSystem&nbsp;</td><td>76144W</td><td>スーパー&nbsp;マウス&nbsp;1800アレルゾーン&nbsp;</td></tr><tr><td>冷蔵マイクロ遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>レジェンド マイクロ 21R</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>ヘレウス</td><td>バイオフュージ ピコ</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ソルバル ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>モデル&nbsp; 3111</td><td></td></tr><tr><td>滅菌薄型パスツールピペット</td><td>Deltalab</td><td>D210022</td><td></td></tr><tr><td>滅菌パスツールピペット</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 24 ウェルプレート</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズT10282</td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター - Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Life Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Tubes</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>ライフテクノロジー</td><td>18068-015</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>DNAse-I バッファー 10X</td><td>ライフテクノロジー</td><td>18068015</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>18068015</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>超純水</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>10977</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>RNAse アウト</td><td>ライフテクノロジー</td><td>100000840</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマープライマー</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>N8080127</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>M-MLV-RT バッファー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 18057-018</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>M-MLV-RT エンツィメ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 28025-021</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>QuantiTect Syber Green PCRキット</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>特異的プライマー&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td>分子生物学グレード</td></tr></tbody></table>

代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

舌下経路は、血流中に小分子を送り込み、異なる部位での免疫応答を調節するために広く使用されてきました。全身部位や粘膜部位、すなわち肺や泌尿生殖器の部位で体液性および細胞の反応を効果的に誘導することが示されています。舌下ワクチン接種は、下気道および上気道での感染に対する保護を促進することができます。また、アレルゲンに対する耐性を促進し、喘息の症状を改善することもできます。舌下免疫療法(SLIT)による肺の免疫応答の調節は、潜在的に有害な分子を直接気道に送達する必要がないため、鼻腔内経路による製剤の直接投与よりも安全です。鼻腔内分娩とは対照的に、SLITでは脳毒性や顔面麻痺を伴う副作用は促進されません。SLITの根底にある免疫メカニズムは依然として解明されておらず、急性肺感染症の治療への使用はまだ調査されていません。したがって、SLITの潜在的な利点をさらに探求するためには、SLITの適切な動物モデルの開発が必要です。
この研究は、急性肺炎球菌性肺炎に対する彼らの保護能力を評価するために、マウスに治療薬の舌下投与を行う方法を示しています。舌下接種中のマウスの取り扱い、舌下粘膜の正確な同定、リンパ節の排出と組織の分離、気管支肺胞洗浄と肺の技術的側面が示されています。FACS分析のためのシングルセル懸濁液調製のためのプロトコルが詳細に説明されています。免疫応答の解析のための他のダウンストリームアプリケーションについて説明します。Streptococcus pneumoniae接種物の調製とマウスの鼻腔内チャレンジの技術的側面についても説明します。
SLITは、肺の免疫応答を調節するための候補分子のスクリーニングを可能にするシンプルな技術です。SLITの成功に影響を与えるパラメータは、分子サイズ、劣化に対する感受性、および高濃度製剤の安定性に関連しています。

舌下免疫療法は、正常肺の免疫応答を調節するために使用することができる。私たちは、フラジェリン、TLR5及びNLRC4アゴニストの単回投与は、ケモカインCXCL1、CCL20および生理食塩水処置対照と比較してサイトカインIL-6をコードするmRNAの有意なアップレギュレーションを誘導することができることを示した。 mRNAレベルの誘導倍率は、スリット後の8時間でピークに達し、20時間（ 図1）の後に基礎レベルに戻ります。 SLITはS。肺炎連鎖球菌で2時間前に鼻腔内感染を行った場合しかし、CXCL1およびIL6 mRNAのレベルは、有意に非処置動物（ 図2）と比較して、SLIT後においても24時間後にアップレギュレートされたままであった。 FACSによってBAL中の細胞集団および肺組織の分析は、舌下経路によりFliCで処置した動物は、気道内ではなく肺'組織（ 図3）で好中球の数が増加したことが明らかになった。 図4に示すように、フラジェリンとSLIT、保護を促進し、急性の肺炎球菌性肺炎に対する生存を増加させた。 <img alt="図1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> 図1フラジェリンと舌下免疫療法後の肺の「転写プロファイルの動態。八〜10週齢のBALB / cマウス（n = 4）は麻酔下で舌下経路によりフラジェリンまたは生理食塩水を10μgで処理した。肺は、異なる時点で採取し、核酸の保存剤中に置いた。全RNA抽出を実施し、cDNAを合成した。 mRNAレベルはTABLに記載されている特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRによって評価した電子1相対的定量化は、正規化のためACTB mRNAレベルを使用したΔCt法に従って行った。結果は、中央値±SEMとして生理食塩水処置群と比較して増加倍数として示されている。アスタリスクは、マンホイットニー検定に従って計算し、統計的に有意な差（p &lt;0.05）を示す。結果は、2つの独立した実験の代表である。 <img alt="図2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> とフラジェリン。エイト10週齢のBALB / cマウス（n = 4対照群であり、n = 7処理されたグループのために） 舌下免疫療法後に肺炎球菌性肺炎の間に、図2の肺'転写プロファイルは、によってフラジェリンまたは生理食塩水を10μgで処理した麻酔下で舌下経路。 2時間後、マウス10を起こす最小致死量（MLD）を鼻腔内経路により攻撃したS.の臨床分離株の0％の死亡率4×10 5 CFU /50μlに対応する肺炎連鎖球菌血清型1 E1585、。肺は、チャレンジ後24時間後に回収し、RNA抽出およびcDNA合成を実施するまでの核酸保存剤で保存した。リアルタイムPCRを行った（表1のプライマーのリストを参照）および相対的定量化は、正規化のためACTB mRNAレベルを用い応じたΔCt法を実施した。結果は、中央値±SEMとして生理食塩水処置群と比較して増加倍数として示されている。アスタリスクは、マンホイットニー検定に従って計算し、統計的に有意な差（p &lt;0.05）を示す。 <img alt="図3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> 多形核好中球の図3。分析（PMN）SLIT後に肺の'組織や気道における募集。エイトへ10週齢のBALB / cマウス（N = 4）を麻酔下で舌下経路により、フラジェリンまたは生理食塩水を10μgで処理した。 2時間後、マウスにSのMLDで鼻腔内経路により攻撃した·ニューモニエ血清型1 E1585。 24時間チャレンジ後、BALを実施し、肺をFACS分析のために処理した。 PMNはLy6G 高 / CD11bの高 / CD11cの陰性細胞として同定され、FCS-SSCプロファイルに基づいていた。結果は、BALまたは肺中の全細胞数のに対して、PMNの割合として表されます。バーは、平均±SEM中央値を表す。アスタリスクは、一方向マンホイットニー検定に従って計算統計的に有意な差（p &lt;0.05）を示す。 <img alt="図4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> フラジェリンと図4 SLITは、急性肺炎球菌性肺炎に対してマウスを保護します。 SのMLDで鼻腔内経路により攻撃した·ニューモニエ血清型1 E1585。生存率は、日常的に評価した。カプラン·マイヤー曲線をログランク（マンテル·コックス）検定に従って比較した。アスタリスクは統計的に有意な差（P &lt;0.05）.Resultsは2つの独立した実験の代表であることを示す。 <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td> 名前 </td><td> 配列5'-3 ' </td><td> PCR産物lenght（bp）の </td></tr><tr><td> MB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> MB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> MIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> MIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> リアルタイムPCR分析のために用いたプライマーを表1のリスト。qPCR分析のために使用される特定のプライマー配列。フォワードおよびマウスACTBのためのリバースプライマー、Cccl20、CXCL1、IL6、TNFAとCXCL1は 、5'-3 '配列として提示され、予想された生成物の長さは塩基対（bp）で示されている。

本研究は、肺の自然免疫応答を高め、マウスの急性肺炎球菌性肺炎に対する防御を与えるために舌下免疫療法を使用することの利便性を示しています。

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

この手順の全体的な目標は、舌下免疫療法を使用して肺の自然免疫応答を高め、致命的な肺炎球菌性肺炎に対する快適な保護を行うことです。マウスでは、最初のステップは、麻酔をかけたマウスの舌下粘膜に免疫賦活剤フラグを含む溶液を投与することです。次に、致死量の肺炎球菌の原性株を含む懸濁液を、以前にフラットラインまたは生理食塩水で治療したマウスに鼻腔内根から点滴します。気管支ビラージは、気道に浸潤する亜集団を分析するために行われ、肺組織は、細胞集団の表現型特性評価のための単一細胞懸濁液を得るために処理されます。マルチパラメトリックフローサイトメトリーにより、下顎、付属下顎リンパ節、および舌下組織も処理して、フローサイトメトリーまたはその他の下流分析を行うことができます。気道に浸潤する細胞集団。肺、または舌下粘膜は、免疫表現型およびマルチパラメトリックフローサイトメトリーによって識別できます 舌下免疫療法後のさまざまな組織での免疫活性化も、リアルタイムPCRによる転写プロファイルの研究によって分析できます。バイオテクノロジー学科のワクチン研究所へようこそ、私たちは医学部、U.Oneの私たちの研究室の主な関心事の1つは、呼吸器感染症に対する免疫介入の新しい戦略を生成することです。鼻腔内経路は、肺感染症や異なる神学を治療または予防するための免疫刺激剤の送達に成功裏に使用されています。私たちは、細菌ゲルの成分である鼻腔内送達リンが、STOマウスによって引き起こされる進行中の肺感染症を壊すために効果的に使用できることを示しました。鼻腔内根は通常、低用量の治療薬を必要とし、気道で強い反応を誘発しますが、中枢神経系の毒性や、雄弁神経を介した免疫刺激化合物の吸収に関連する顔面麻痺の可能性など、いくつかの欠点があります。したがって、私たちは、肺炎球菌性肺炎に対する防御免疫を誘導するための代替手段として、UAL免疫療法のモデルを設定しました。舌下免疫療法は、鼻腔内設置と比較してより安全な代替手段を提供します。非侵襲的で、痛みがなく、シンプルです。より高用量の治療薬が必要な場合がありますが、NAまたは医薬品を送達するために使用して、最終的に長さの免疫応答を調節することができます。ここからは、お世辞を治療薬としてマウスに舌下投与を行う方法をご紹介します。お世辞を言うスビン免疫療法は、肺に自然免疫応答を引き起こすことにより、最終的にマウスを連鎖球菌肺炎による致命的な鼻腔内チャレンジから保護することができます。また、感染中および舌下免疫療法後の長さ、自然反応の特性評価にも取り組みます 流れるような幾何学とリアルタイムPCRを使用します。最後に、さらなる分析のために局所的な粒状リンパ節と舌下組織を収集する方法を示します。試験する刺激剤の溶液を調製した後、最大容量10マイクロリットルの免疫刺激剤を含む溶液である腹膜間注射Petにより、200マイクロリットルのケタミンOSI溶液を投与することにより動物に麻酔をかけます。次に、左手でマウスを取り、空いている手で親指と人差し指でマウスを持ちます。閉じた鉗子を舌の下にそっと置き、所定の位置に保持します。中指と薬指を使ってピペットを取り、口の底と舌の背側に溶液を投与します。鉗子を取り外し、口を3〜5分間休ませてからケージに戻します。この技術の主な特徴は、動物の治療と麻酔に使用される総量です。口腔マウスのサイズが小さいため、舌下比率に適用できる最大容量は10マイクロリットルに制限されています。用量を決定したら、サンプルの濃度を最大量に調整する必要があります。量が多いと、溶液が望ましくない飲み込みや誤嚥を引き起こす可能性があります。麻酔は、嚥下を避け、上皮を通じて物質が浸透できるようにするために重要です。マウスがすぐに目を覚ますため、麻酔に吸入を使用しないことをお勧めします。一部の注射可能な麻酔薬は、マウスの唾液分泌を誘発する可能性があることに注意してください。その場合は、治療剤で溶液を塗布する前に、フィット感や紙で過剰な唾液分泌を解消し、治療剤の用量を調整してその効果を最大化する必要があり、数回の用量をテストすることを強くお勧めします。以前に鼻腔内ルートでコンパウンドを使用していた場合は、5倍から10倍の用量でテストを開始するのが良いでしょう。舌下根で治療薬をテストします。上皮を介した吸収は、分子の解け液解けのサイズによって制限されることに注意してください 既知の細菌CFU番号の肺炎連鎖球菌の以前に調製された作業ストックのアリコートは、2、500 Gで5分間遠心分離し、スーパーナトを廃棄します スター生理食塩水と遠心分離機の1ミリリットルで中断します。再度、上清を捨ててから休ませます。50マイクロリットル中の50マイクロリットルで5つのCFUに10×4倍の懸濁液を得るために、滅菌生理食塩水の適切な容量でペレットを懸濁し、これは球根C.マウスで100%の死亡率を引き起こすために使用される微粒子血清型の最小細菌量C.マウスの細菌懸濁液の50マイクロリットルを取り、慎重に以前に麻酔したマウスの鼻孔に全量を注入する。マウスを2分間直立させ、さらに2分間背側の位置で休ませます。チャレンジ後、懸濁液を10倍に連続希釈し、血液に播種することにより、細菌懸濁液中のCFU数を確認しました。寒天プレート 5%CO2ムコと37度で一晩インキュベートします。民族のコロニーは、アルファ溶血性細菌の特徴的な緑色のaloによって区別することができます。コロニー形成単位をカウントし、チャレンジ用量の使用を登録します。動物を安楽死させた後、胸腔を首まで開きます。前脚に沿って切開を行い、気管と舌下領域を露出させます。下顎リンパ節を特定します。これらは通常、唾液腺の上に座っている白っぽい楕円形の構造として現れます。先端の細い湾曲鉗子を使用して、舌下組織をそっと引き上げ、口底の背側を露出させます。下顎リンパ節を芯の細い先端鉗子で優しく引き上げて組織から解放します。下流の手順に従って、C-R-P-M-Iまたは核酸保存料溶液が入ったチューブに入れます。それは後で実行されます。次に、喉の両側のより深い位置にある小さなリンパ節を特定し、それらを取り出します。これらは副下顎リンパ節です。胸腔を開いて肺を露出させ、胸腺を切除します。下ビンナCVAをカットし、吸収性組織で余分な血液を取り除き、気管支洗浄を行います。まず、気管を露出させます。次に、メスで小さな切開を行い、細い先端を導入します。以前にカルシウムマグネシウムと1ミリモルEDAを含まないPBSの1ミリリットルで満たされたペッペを転送し、総量を少なくとも3回慎重に点眼し、吸引します。次に、吸引して細胞懸濁液を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移します。カルシウムマグネシウムを含まない5ミリリットルのPBSと1ミリモルのEDTAを心臓の右心室に注入して肺を灌流し、肺の血管に存在するすべての赤血球と免疫細胞を排除します。灌流が正しく行われた場合、肺の色はピンクから白に変化します。心臓を取り出し、灌流肺を採取し、実行する下流の分析に応じて、完全な中核酸防腐剤溶液に入れます。舌下粘膜の細胞集団を解析したい場合は、動物の頭部を分離し、唾液腺を切除して軟組織を付着させます。下顎関節に到達するまで口の両側を切開し、下顎を舌と口の底と一緒に分離します。鈍いラットの歯の鉗子を使用して、舌を引き上げ、舌の付け根が口の床と出会う場所に切開を行います。この領域は舌下粘膜を構成します。生検パンチ、鉗子、はさみを使用して舌を切断して取り除きます。舌下粘膜組織を切り取り、きれいなチューブに入れます。肺を24ウェルプレートに移し、きれいなハサミでそれらを意味します。1ミリリットルの消化培地を数回ピペッティングで上下させ、インキュベーション後37度および5%CO2で40分間インキュベートします。ピペを何度も上下させて、ほとんどの細胞が組織から放出されたことを確認します。細胞懸濁液を40マイクロメッシュの細胞ストレーナーに移し、5ミリリットルのPBAで洗浄します。5ミリモルEDTA遠心分離機を2、500GSで5分間。Reusは、カルシウムマグネシウム、1ミリモルEDTA、および1%胎児Boing血清を含まないPBSで構成された1ミリリットルのファックスEDTAで細胞を懸濁します。QUを取り、トリップとブルーで細胞を2倍に希釈し、Reus懸濁細胞を1ミリリットルあたり7個の細胞に10の2倍の濃度に戻し、チューブあたり50マイクロリットルを追加します。免疫表現型分析のために、各チューブに2倍抗体ミックスを50マイクロリットル加えます。事実を3回洗った後、暗闇の中で氷の上で30分間インキュベートします。EDTAは、200マイクロリットルの事実EDTAで細胞を再懸濁し、サイトメーターで分析し、同じ手順で、このスペースを含む消化培地を使用して舌下組織の細胞集団を分析するために使用できます。TLR 5およびLC 4のアゴニストである精製フラットラインを用いたコラゲナーゼおよびDS 1舌下免疫療法は、肺の好中球動員に関与するケモカインおよびサイトカインのmRNAレベルの有意なアップレギュレーションを誘導した。これは感染中にも観察されました。肺へのPMNの動員は、フローサイトメトリーによって確認されました。TLR5作動薬による舌下治療は、動物の生存率の増加および肺炎球菌性肺炎に対する防御と相関していた。舌下免疫療法は、侵襲性PNE肺炎球菌性肺炎に対するラインの保護を誘導する効果的な手段であることを示しました。これは、肺炎組織によって産生されないテーラーファイブアゴニストであるlainの舌下設置によって達成されました。Lainの舌下設置は、ライン内のケモカインC Xcl Lのアップレギュレーション、および好中球の浸潤を誘発しました。TLRアゴニストによる肺炎球菌の舌下免疫療法の排除に重要な細胞の一種は、細菌の播種や重症型の感染症の発症を防ぐために、感染症を単独で、または抗生物質治療などの現在の治療法と組み合わせて治療するために使用することができます。舌下根はワクチンの送達にも使用でき、粘膜および全身防御免疫の誘導に効果的であることが示されています。この戦略は、呼吸器感染症の場合、特にブロ肺炎の場合、基本的な病気を防ぐだけでなく、エントリーのスポーツで細菌をブロックする鼻腔コロニー形成も防ぐことができるため、特に興味深いものです。全体として、舌下ルートは、呼吸器感染症を治療または予防するための新しい戦略を開発するための魅力的な代替手段であると考えています。このテクニックを試してみることをお勧めします。

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本研究では、非侵襲的な気管内挿入技術が、基本的な喉頭鏡を用いてラットでALIを発生させることが示され、肺へのLPSの正確な供給が保証されています。LPSは喉頭鏡を用いた気管内チューブ から 点滴されます。肺損傷の規模は複数の時点で評価されます。...

齧歯類の急性肺損傷を誘発するための非侵襲的気管内リポ多糖投与

学ぶ舌下免疫療法を用いてマウスの肺における自然免疫応答を増強し、Streptococcus pneumoniaeによる致死性肺炎から保護する方法。流式細胞法とリアルタイムPCRを用いて免疫細胞を解析し、呼吸器感染症に対する新たな治療戦略を探索する。

代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために

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