Name: CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ多光子細胞内ナトリウムイメージングとUV焦点アンケージングを組み合わせた手法。マウス海馬CA1錐体ニューロンの樹状突起と棘におけるナトリウム動態を解析し、神経活動のメカニズム解明に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、著者らはS. DurryとC. Roderigo専門家の技術支援のために、とM.Dübbert（電子技術研究所、動物学研究所に感謝したいCRRするドイツ科学財団（DFG、Ro2327 / 6-1）の助成金によってサポートされていましたポッケルスセルコントローラとHFスイッチを実装する助けをケルン、大学、ドイツ）。

<ol><li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+Na%2B+imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflueg.+Arch.%2C+Eur.+J.+Phy%22%5BJournal%5D)">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li>
<li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+Na%2B+signals+in+spines+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li>
<li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+new+fluorescent+Na%2B+indicator+CoroNa+Green%3A+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li>
<li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li>
<li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Roy.+Soc.+B-Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li>
<li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li>
<li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mismatch+between+the+Na%2B+flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li>
<li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na%2B+influx+between+axon+and+soma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li>
<li>Denk, W., Piston, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenk%2C+W+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).</li>
<li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Ca%282%2B%29+and+Na%28%2B%29+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li>
<li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2FK+pump+current+and+%5BNa%5D%28i%29+in+rabbit+ventricular+myocytes%3A+Local+%5BNa%5D%28i%29+depletion+and+Na+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li>
<li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li>
<li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mobility+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li>
<li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li>
<li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm%3A+photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li>
<li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNikolenko%2C+V+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22">Cold Spring Harbor protocols</a>. , 1132-1141 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害を宣言しません。著者らは、ビデオの記事で使用した機器を生産ラップ光電子（ヴェーデル、ドイツ）でオープンアクセス出版を可能にする財政支援を受けた。同社は、実験でも、データの取り扱いにも、原稿執筆に関与でもなかった。

本研究は、SBFI、小さな細胞区画内の細胞内ナトリウム過渡の二光子イメージングのために適していることを示している。これは、SBFIの量子効率が15かなり低く、ナトリウム濃度の相対変化は、生理活性を有する非常に小さいことが、念頭に置かなければならない。このように、微細プロセス中のNa +トランジェントの高分解能測定は、比較的面倒な作業であり、いくつかの試験のビニングまたは平均化は満足なシグナルを得るために必要であり得る。また、ナトリウム過渡の動力学は長期間にわたって記録することが義務付けこと、驚くほど遅い。この観察結果は、ニューロンの樹状突起とアストロサイト中のナトリウム過渡の単一指数減衰を室温1,2,6で10秒の範囲で、大きな減衰時間定数を特徴とした以前の研究、のものに対応しています。ナトリウムは過渡は、このようにはるかに遅い時間の共同を発揮すると思われるURSEカルシウムトランジェント16と比較してはるかに大きい減衰時間定数。 これらの欠点を脇に置き、ナトリウムイメージングは​​、ニューロンのサブドメインの生理学的特性の調査のための貴重なツールであることが分かる。例えば、ナトリウムイメージングは​​大気圧または近いアクティブなシナプスの興奮性シナプス活性をモニターするために役立つことができる。ナトリウムは、本質的に8,17にバッファリングされていないので、活性誘発性ナトリウムトランジェントが直線的シナプスのグルタミン酸放出の広い範囲に関連するか、または外因的にグルタミン酸を適用する。彼らは、それゆえ、ニューロンのグルタミン酸作動性活性を直接かつ公平な指標を表す。また、ナトリウム指示色素は、高いK dをのを示す（SBFIのK dは 25 mMの1の範囲である）。 （ - 1mMの通常0.5）、高K d &#39; は sは、染料自体が複数のバッファとして作用しないことを意味するものであっても十分な明るさを達成するために使用される比較的高い細胞内の色素濃度で憎悪。その結果、彼らは常にカルシウム感受性色素が細胞18内に導入される懸念である、ナトリウムトランジェントの振幅も、時間経過を歪めていない。したがって、検出された信号が細胞内ナトリウムで「本当の」変化の良好な尺度を表すと仮定することができる。彼らの遅い時間のコースは、その後ニューロンにおけるナトリウムのための細胞内拡散に速度が以前に19を想定よりもはるかに小さいことを意味します。 スパインと樹状突起への興奮性シナプス伝達とナトリウム流入経路の性質に対処した実験の実行が成功するための重要な要件は、シナプス後の構造の迅速かつ高度に局在活性化の誘導である。これは背骨のすぐ近くやケージド化合物の閃光光分解によるデンドライトグルタミン酸またはグルタミン酸アゴニストの迅速かつ局所適用することによって得ることができる。フラッシュ光分解は、機械的にDAMAないGE組織は、モーションアーチファクトを含まず、同様に関連の質問の調査（ 例えば 、ローカルカルシウムシグナル伝達）のために確立されています。アンケージングスポットの直径は、xy平面で1.5μmであった。棘と親樹状突起の両方にナトリウム信号を誘起伊勢デンドライトに近いアンケージング。信号がアンケージングスポットに近い棘で最大の傾向にあったのに対し、親樹状突起での振幅と棘遠くにはまだアンケージングスポットのすぐ近くのものにかなり類似していた。アンケージングは​​、内向き電流の振幅が増大し、その間に300ミリ秒を行った。アンケージドグルタミン酸は、さらに離れアンケージングスポットから樹状突起領域および棘上イオンチャネル型グルタミン酸受容体およびナトリウム流入を活性化し、同じ期間中に組織内に拡散した可能性があります。 細胞入浴液を通して投与ケージド化合物の光分解のためのUVレーザーを使用したときに発生する本質的な問題「内側のフィルタリングは &#39;です。そのためケージの高吸収率の、UV光は刺激部位20,21対物から道に沿って強く減衰される。これを回避する実現可能な方法は、さらに最小限に必要なケージド化合物の量を減少させる刺激部位に制限されているケージを持つローカル灌流である。 UVレーザー走査媒介アンケージング、近赤外二光子アンケージング22と比較して、刺激の精度が、z軸が増加する主な理由は、空間的に、より正確である。による二光子励起に用いられるようなより長い波長のために一般的に使用されるケージの小さな断面と、一方、高ケージド化合物の濃度または非常に高いのいずれか、潜在的に毒性の光強度が必要とされる。また、二光子アンケージング機器はるかに高い投資が必要となる。とりわけ、追加のIRレーザーに加えて必要な光学部品は、必要とされている。 SBFIおよびMNI-グルタミン酸の両方が同一の波長範囲で励起可能である。これはアンケージングフラッシュ、および/またはIRビームによるグルタミン酸の連続アンケージングによってSBFIの漂白で、その結果、紫外線アンケージングレーザーおよびSBFIまたはIRイメージングレーザとMNI-グルタミン酸の意図しない相互依存性につながる可能性があります。 図6（c）に示すようにしかし、それだけで紫外線フラッシュも多光子イメージングどちらも私たちの実験条件下でそのような相互的な効果をもたらした。 ここに記載したものと同様のUVフラッシュシステムは、多くの他の研究室で日常的に使用され、比較的容易に既存の多光子イメージング顕微鏡に組み込むことができる。これは、光分解のためにレーザビームを視野内に自由に配置することができるという利点を提供する。さらに、システムは、実験中の視野内に、それぞれ、レーザビームと放出量の迅速かつ自動化された再配置を可能にする。王イメージングソフトウェアのフレームが合同イメージングとアンケージングフレームを調整するために役立つことができるように、r個の修飾は、アンケージングスポットの正確な位置決めを簡素化し、改善する。 まとめると、全細胞パッチクランプおよび中枢神経細胞の樹状突起と棘での多光子ナトリウムイメージング、グルタミン酸の紫外線光誘起アンケージングための修正された手順と組み合わせることで、組織内のグルタミン酸受容体の信頼性が高く、焦点の活性化を可能にします。従って、無傷組織におけるニューロンにおける興奮性シナプス伝達およびシナプス後ナトリウム信号の特性を分析するために役立つことができる。

このような多光子顕微鏡などの光顕微鏡技術における最近の改善は、高い空間および時間分解能で無傷の組織中の脳細胞の形態学的および生理学的パラメータの研究を可能にした。電気と組み合わされ、これらの技術は、現在広くすなわち微細な樹状突起と樹状突起棘に、小さい細胞内コンパートメントにおけるニューロン上の活動に関連する電気信号、ならびに付随するカルシウムシグナルを分析するために使用される。カルシウムトランジェントに加えて、シナプス活性はまた、樹状突起と棘ナトリウム信号を誘導する、の特性が大幅に未調査である。このような信号は、iが有意な色素漂白または光損傷1,2なし長期間トランジェント（ 私の[Na +]）の[Na +]のオンライン測定を可能にする細胞内ナトリウムの二光子イメージングにより分析することができる。 の[Na +] iの画像化のための</&gt;サブ、わずか化学指示色素には、 例えば 、コロナグリーンまたはアサンテナトリウム-グリーン3,4用意されています。のNa +イメージングのための最も一般的に使用される蛍光プローブは、ナトリウム-結合ベンゾフランイソフタレート（SBFI）である。これは、よく知られているカルシウム感受性色素のfura-2と同様のレシオメトリック、UV励起色素であり、多くの細胞型（ 例えば、5,6）従来のNa +イメージングのために使用されている。刺激的な色素およびその蛍光を収集する異なる可能性がある。高い時間分解能（ すなわち高い撮像フレームレート）、空間情報との組み合わせで必要とされる場合、SBFI、高速電荷検出キセノンアークランプ、または高出力発光ダイオード（LED）素子とその発光によって励起することができ共役型デバイス（CCD）カメラ7,8。深部組織の最大の空間分解能のために、多光子レーザー走査顕微鏡は、選択9の方法である。比較的低い量子efficie（ - 2mMの0.5）、そして鋭い微小電極10またはパッチピペット1を介してSBFIの膜不透過形の直接読み込みSBFIのNCYは、比較的高い染料濃度を必要とする。 SBFIを使用して、げっ歯類の海馬の急性組織切片で行わ以前の仕事は主に1,2受容体、イオンチャネル型NMDAを通してナトリウムの流入によって引き起こされるCA1錐体ニューロンの樹状突起と棘での活動に関連したナトリウムトランジェントを実証した。より詳細には、ローカルナトリウム信号の特性の研究のために、受容体アゴニストを適用することによって、シナプス後受容体の特異的活性化は、任意の適し方法である。シナプス前活動と伝達物質の放出を模倣するには、アプリケーションが比較的短いこと、地域的刺激を可能にするために集中しなければならない。しかし、これは、無傷の組織において非常に困難であることが分かる。先の細いピペットを用いて受容体アゴニストの局所加圧は非常に焦点のpを可能にひだが、（ 例えば、樹状突起、または樹状突起棘のような）関心構造の運動を生成するための潜在的なリスクをホストし、かつ、高分解能イメージングを妨げる。神経活性物質のイオントフォレーシスの適合性は、それらの電気的性質に依存し、高電流振幅は、同様に細胞のアーティファクトを生成することができる。 これらの障害を回避する一つの方法は、光活​​性化化合物およびそれらの閃光光分解の採用である。基本的には、二つの異なる原理ケージ物質の光活性化のために使用されている：私は）広い視野閃光光分解11およびII）レーザ12と組み合わせて、スキャンモジュールを採用し、焦点アンケージング。広視野閃光光分解が関心の大きな領域を活性化するために使用されているが、 例えば、セル全体は、焦点アンケージングは、特に小細胞区画を刺激するために使用される。本研究では、全細胞パッチクランプおよびマルチpに対する手順を実証組織内のグルタミン酸受容体の信頼性が高く、焦点活性化を可能にする、グルタミン酸の紫外線光誘導アンケージングのための修正された手順と組み合わせた中枢ニューロンの樹状突起と棘におけるhotonナトリウムイメージング、。

<table><tbody><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ヒルゲンベルグ</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm、壁厚 0.3 mm</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC互換カメラ</td></tr><tr><td>デコンボリューションソフトウェア</td><td>SVI</td><td>ホイヘンス Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー分光器</td><td>オーシャンオプティクス</td><td>USB 4000</td><td>ミニチュア光ファイバー分光器</td></tr><tr><td>フィルターチューブ</td><td>VWR</td><td></td><td>センリフガルフィルター、0.2 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>オリンパスヨーロッパ</td><td>Flowview Ver 5.0c、Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>IRビームパワーコントローラー</td><td>カスタムビルド</td><td></td><td>レーザービーム強度制御+ポッケルスセルIRレーザーによるフライバック時のゼロへの高速スイッチ</td></tr><tr><td></td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsed Ti:Saチューナブルレーザー(710-990 nm);注意</td></tr><tr><td>IRパワーモニター</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr>の<tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡/イメージングシステム</td><td>オリンパスヨーロッパ</td><td>BX51WI/FV300</td><td>顕微鏡とイメージングシステムは、NDフィルターホイールを強く変更しました</td></tr><tr><td>ニュー</td><td>ポート</td><td>50Q04AV.2</td><td>UV溶融シリカ、光学濃度 0.05-2.0</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>ニコンインスツルメンツ ヨーロッパ</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>成重</td><td>モデル PP-830</td><td></td></tr><tr><td>空気圧式薬剤排出システム</td><td>NPI 電子</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>ポッケルスセル</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM、ファストスイッチおよびパワー調整用</td></tr><tr><td>ポッケルスセルとして使用ドライバー</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>高電圧差動増幅器</td></tr><tr><td>シャッター</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF2コーティング BeCuブレード</td></tr><tr><td>シャッターコントローラー</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャッタードライバー</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>スライサー/ビブラトーム</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>アンケージングソフトウェア</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UVレーザー</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSLレーザー、355 nm; 10 mW;注意</td></tr><tr><td>UVレーザースキャンシステム</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>ガルバノメトリックスキャンシステム</td></tr><tr><td>化合物の名前</td><td><strong.>会社名</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>Comments/ Description</strong</td></tr><tr><td>>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA受容体拮抗薬;注意</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA受容体拮抗薬;注意</td></tr><tr><td>SBFI K+塩</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>電圧依存性Na+チャネルの阻害剤。注意</td></tr><tr><td>NMI-ケージ-L-グルタミン酸</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>ケージ入りグルタミン酸は紫外線吸収時に放出</td></tr></tbody></table>されます

ca1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のuv媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

多光子蛍光顕微鏡は、高い空間および時間分解能で無傷組織における脳細胞の形態学的および生理学的パラメータの分析を可能にした。電気生理学と組み合わせることで、それは広く、樹状突起と樹状突起棘のような小さな細胞内コンパートメントでの活動に関連したカルシウムシグナルを研究するために使用されている。カルシウムトランジェントに加えて、シナプス活性はまた、シナプス後ナトリウム信号を誘導する、の特性がわずかに理解されている。ここでは、組み合わせたホールセルパッチクランプおよび中枢ニューロンの細胞ミクロドメインにおける多光子ナトリウムイメージングのための方法を記載する。さらに、私たちは組織内のグルタミン酸受容体の信頼性が高く、焦点活性化を可能にする、グルタミン酸の紫外線（UV）-LIGHT誘発性アンケージングのために変更された手順を紹介します。この目的のために、全細胞記録は、 アンモン角細分1（CA1）の急性組織切片における錐体ニューロンで行ったマウスの海馬。ニューロンは、パッチピペットを介してナトリウム感受性蛍光色素SBFIで満たされ、SBFIの多光子励起は樹状突起と隣接する棘の可視化を可能にしました。 UV誘発焦点アンケージングを確立するために、光強度、UVアンケージングビームの影響を受け、ボリューム、ビームの位置だけでなく、ケージド化合物の濃度を含むいくつかのパラメータがテストされ、最適化された。らの結果は、ケージドグルタミン酸（MNI-グルタミン酸）とそのローカル灌流及び樹状突起と棘内向き電流およびナトリウムトランジェントにおいてその焦点紫外線アンケージング結果を示す。時間経過と内向き電流およびナトリウム信号の両方の振幅はアンケージングパルスの持続時間と相関する。さらに、本発明者らの結果は、彼らがこの経路しかしナトリウム流入によって媒介されることを実証し、細胞内ナトリウム信号は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体に対するブロッカーの存在下でブロックされていることを示している。要約すると、私たちの方法は、信頼性の高いツールを提供しています無傷の脳組織における焦点受容体活性化によって誘導される細胞内ナトリウム信号の調査。

本研究では、急性マウス海馬組織切片のCA1錐体ニューロンにおけるナトリウム依存性蛍光色素SBFI付き携帯ナトリウムダイナミクスの多光子顕微鏡法のための手順を示す。また、私たちは神経活性化合物のレーザー走査系のアンケージング（ 例えばケージグルタミン酸）で、このイメージング技術を組み合わせて、携帯のマイクロドメインへのターゲティング、その正確な方法を示しています。 パッチピペットを通してSBFIでニューロンをロードすると、多光子励起（ 図6A、B、D及び図7A）を用いて微細な樹状突起と隣接する棘を含むセル全体の可視化を可能にした。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> 図6ナトリウム信号やケージグルタミン酸の閃光光分解により誘導されたシナプス電流（A）マキシムパッチピペット（PP）を介してSBFIを搭載したCA1錐体ニューロンのアル投影像。ボックスは、B、LPに拡大して示す領域がケージグルタミン酸のローカル灌流のためのピペットの位置と方向を示していることを示します。（B）は 、隣接する樹状突起棘と樹状突起の光学切片のスタックの高出力の最大投影。光学切片のスタックは、Zアライメントとデコンボリューションを受けた。赤い十字はアンケージングビームの標的領域を示している。オレンジ色の点線は、蛍光発光を記録し、そこから関心領域の輪郭を描く。 （黄色フラッシュで示される）ケージドグルタミン酸のフラッシュ光分解によって誘導される電流（ 下段 ）内向きナトリウム信号（ 上段 ）および体細胞：ボックスは左D.（C）に拡大して示す領域を示している。赤線は実験データのフィットを表す。灰色の領域は、内アンケージングフラッシュ（300期間を表しミリ秒）SBFI蛍光のイメージングを妨げ右：ケージグルタミン酸による事前灌流なしでは、同じUV-フラッシュがSBFI発光の変化、また内向き電流を誘発でもない（D）左 ：。ハイパワーデンドライトのイメージと隣接と並んでBに描写されるように、反転したグレー値と同じ画像をスパイン。点線は、蛍光発光が記録された関心領域を示している。赤い十字はアンケージングビームの局在を示している右：ケージグルタミン酸の紫外線フラッシュ光分解によって誘導されたナトリウムトランジェント。ブルートレース：樹状突起中のナトリウムシグナル;赤線：アンケージングスポットに隣接する3つのスパインからの応答を平均化し、緑のトレース：3遠い棘からの応答を平均した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版についてはこちらをご覧ください。</a> リテーナ入りローカル灌流した後、グルタミン酸、デンドライトに近い紫外線フラッシュを適用すると、細胞内のナトリウム濃度（ 図6C、Dおよび図7B）の増加を反映し、SBFIの蛍光発光の過渡的な減少をもたらした。同時に、内向き電流は、体細胞（ 図6Cおよび図7B）で記録した。 UVフラッシュの持続時間を増やすと、システムがよく、そのダイナミックレンジ内とアンケージングも細胞性いずれの応答が飽和したことであったことを示し、両方の電流およびナトリウム信号（データは示していない）内向きの誘発の振幅の増加をもたらした。ケージグルタミン酸で前灌流されていなかったスライスと同じ又はより長い持続時間の紫外線フラッシュの適用は、これらの信号は、グルタミン酸のアンケージング（ 図6C）によるものであることを示す、SBFI蛍光も内向き電流の変化を誘発したことはありません。さらに、これらの結果はimaging-とアンケージング成分のない相互依存性がuで観察されないことを示して私たちの実験条件ファインダー。ナトリウムは信号も樹状突起棘（ 図6D）で検出することができた。私たちが唯一のグルタミン酸アンケージングを持つ単一の背骨の刺激を達成しようとしなかったが、ピーク振幅は棘がさらに離れ、親樹状突起（ 図6D）とほぼ同一の蛍光変化を示したのに対し、アンケージングスポットに近い棘がやや高い傾向にあった。 最後に、グルタミン酸のアンケージングに応じて、樹状突起と棘にナトリウム流入のための経路を検討した。この目的のために、私たちはそれぞれAMPA-およびNMDAサブタイプのナトリウム透過性、イオンチャネル型グルタミン酸受容体に選択的なブロッカーであるCNQXとAPVを採用。本発明者らの結果は、グルタミン酸誘導性細胞内ナトリウム信号と誘発された体細胞電流は、これらのブロッカー（ 図7B）の存在下で省略されたことを示している。ブロッカーのウォッシュアウトすると、信号が回復している。これは股関節を実証グルタミン酸のTアンケージングは​​、細胞内のナトリウムの過渡現象と内向き電流で、その結果、樹状突起と棘へのナトリウムの流入を仲介するCA1錐体ニューロン、上のイオンチャネル型グルタミン酸受容体を活性化する。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> 誘発ナトリウム信号と内向き電流の図7の薬理学的プロファイル。 （A）細胞体に取り付けられたパッチピペット（PP）とのSBFIで満たされたCA1錐体ニューロン（B）左：樹状突起と棘添付でのケージのグルタミン酸の光活性化によって誘導されたナトリウムの過渡および体細胞の電流センター：灌流イオンチャネル型グルタミン酸受容体遮断薬CNQXとAPVは、ナトリウム信号とアンケージングによって誘発される内向き電流の両方を阻害する右：ブロッカーのウォッシュアウトすると、信号が復元されます。赤いラインrepresen実験データの適合のts。灰色の領域は、アンケージングフラッシュ（300ミリ秒）がSBFI蛍光のイメージングを妨げている期間を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版についてはこちらをご覧ください。</a>

私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

この手順の全体的な目標は、無傷の組織にある中枢ニューロンのスパインや樹状突起などの小さな細胞コンパートメントでナトリウムダイナミクスを呼び起こし、分析することです。これは、まず急性マウス海馬スライスを調製し、パッチピペットを介してナトリウム感受性蛍光色素SBFIをピラミッド型ニューロンにロードし、多光子励起を使用して細胞形態を視覚化することによって達成されます。次のステップは、実験用のとげのある樹状突起を選択し、フォーリーがこの樹状突起の近くにケージドグルタミン酸などの光活性化化合物を注入することです。次に、選択した樹状突起に近い少量を標的とするように正確に配置されたUVレーザーを使用して、ケージに入れられていないグルタミン酸にUVフラッシュをフォーリーに印加します。最後のステップは、樹状突起のSBFI蛍光の結果として生じる変化をモニターし、隣接するスパインのナトリウムの結果として生じる変化をモニターすることです。付随する膜電流も記録されます。最終的には、受容体拮抗薬などの適切な薬理学的ツールを使用することで、誘発される細胞内ナトリウムシグナルを生成するメカニズムの研究が可能になります。この方法は、小さな細胞コンパートメントおよび無傷の脳組織における細胞内ナトリウムシグナルの研究に信頼性の高いツールを提供します。ここでは、全細胞パッチクランプと多光子ナトリウムイメージングを、UV光誘起アンケージングの修正手順と組み合わせます。これにより、神経活性化合物の正確かつ焦点を絞った適用に対する細胞応答を監視できます。この手順は、Karl KAと私の研究室の大学院生であるKaan Kleinhansによって実演されます。組織の解剖を開始するには、すぐに脳を氷冷解剖、人工脳脊髄液、またはCSFを備えたシャーレに入れ、正中線に沿って矢状切開を行って半球を解剖します。ブロッキングサーフェスとして目的の方向に2回目のカットを実行します。次に、これを瞬間接着剤でビブラムの切断段階に取り付けます。ビブラムのカッティングチャンバーと冷却エレメントを冷凍庫から取り出した後、ブレインセクションをチャンバー内に設置したカッティングステージを配置します。次に、冷却要素をチャンバーに入れ、組織を氷冷解剖A CSFに沈めます。次に250マイクロメートルの厚さにカットします。海馬のパラ矢状スライスとビオム。CS液が常に泡立っていることを確認してください。スライス後、組織を通常のA CSFのビーカーのメッシュ上に保持し、摂氏34度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、組織を室温に保ちます。この実験は暗い環境で実行する必要がありますが、ここでは撮影目的で薄暗い条件下で示しています。最初にハードウェアを準備するには、多光子システムのコンポーネントをオンにし、テキストプロトコルで説明されているように赤外線レーザービームの位置合わせを調整します。次に、pcalセルと光マルチプライヤの設定を変更して、多光子レーザーの波長とビーム強度を調整します。次に、スイッチを入れて、対物レンズの下に蛍光サンプルスライドを配置して、アンケージングシステムを校正します。アンケージングユニット制御ソフトウェアのキャリブレーションルーチンを開始します。UVレーザーをスキャン範囲内のいくつかのポイントに設定し、UVレーザースポットをクリックしてCCDカメラで蛍光をキャプチャします。各ポイントで、ガルバニックスキャンミラーの位置をソフトウェアの特定の座標に対応するように調整します。アンケージングスポットの正確な位置決めは、アンケージングコンピュータとイメージングコンピュータ間のネットワーク接続を介してイメージングシステムの画像をインポートすることによって達成されます。スクリーングラバーソフトウェアを使用して、イメージングソフトウェアのフレームを連続的に読み取り、イメージングを調整します。また、ケージフレームは、イメージングソフトウェアから10フレームごとに参照画像としてフラッシュユニットに同時にエクスポートし、実験全体で適切に調整されるようにします。次に、マイクロマニピュレーター、電気生理学コンポーネント、およびケージされた化合物を標的領域に送達するための圧力印加装置の電源を入れます。全細胞パッチクランプ用のプルピペットと、ファイヤーポリッシュドホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用した局所的な増殖。次に、スライスを実験用浴に入れ、グリッドで固定するために、浴を顕微鏡ステージに置き、スライスにA CSFを恒久的に灌流します。パッチピペットに細胞内溶液またはSBFIを含むICSをロードして、全細胞パッチクランプを開始し、次にローカル灌流ピペットにケージドコンパウンドをロードします。ピペットを対応するマイクロマニピュレーターに取り付け、参照電極を浴に入れます。スライスの表面から30〜70マイクロメートル下に位置する体細胞を持つCA 1錐体細胞を選択して、無傷の細胞形態を確保し、ケージ解除ビームの散乱と減衰を低く抑えます。IR DICビデオ顕微鏡を用いたパッチピペットでこの細胞にアプローチします。ギガシールが得られるまで、優しく吸引します。高速容量を補います。次に、メンブレンを破り、セルを開いてセル構成を取得します。最後に、電流クランプモードでの細胞生存率を評価します。脱分極電流を注入し、結果として生じるスパイク活動をチェックして、イメージングと刺激を行います。まず、A CSFにテトロDOINDを添加して、電位依存性ナトリウムチャネルの活性化と活動電位の発生を防ぎます。多光子励起とその結果生じるSBFI蛍光を使用して細胞形態を可視化します。実験にはとげのある樹状突起を選択します。画像を拡大して高解像度で表示し、樹状突起の周囲にクリップボックスを配置します。次に、ケージに入れたコンパウンドを入れたピペットを樹状突起の近くに置きます。ピペットを位置決めして、選択した樹状突起の効率的な局所灌流を可能にします。アンケージングレーザーを調整して、アンケージングスポットを目的の構造の近くに配置します。次に、イメージングソフトウェアを使用して、選択した樹状突起と隣接するスパインに関心領域を設定します。関心領域に近づき、トリガー信号を介して低圧スタートパッチ、クランプ、および蛍光記録を使用して、ケージされた化合物を数秒間注入します。ケージコンパウンドの局所的な拡散中、励起ビームは完全に調光され、漂白が防止されます。次に、ケージド化合物の局所的な増殖を停止します。次に、SBFIの効率的な励起を可能にするために2光子レーザーの強度を上げ、UVフラッシュを適用してケージモニター上でSBFI蛍光の変化を初期化し、体細胞電流はSBFI蛍光がベースラインに戻った後に記録を停止します。形態を取得するには、実行された測定に設定されたクリップボックス領域のXY、Zスタックを記録します。このスタックが空間的にオーバーサンプリングされていることを確認して、最適なイメージ デコンボリューションを可能にし、イメージの品質と解像度を向上させます。パッチピペットを介してSBFIをニューロンにロードすると、ケージドグルタミン酸による局所灌流後の多光子励起を用いることにより、微細な樹状突起や隣接するスパインを含む細胞全体の可視化が可能になりました。樹状突起の近くにUVフラッシュを適用すると、細胞内ナトリウム濃度の増加を反映して、SBFIの蛍光発光が一時的に減少しました。同時に、ケージ入りグルタミン酸で事前に灌流されていなかったスライスにUVフラッシュをSOMAで適用すると、内向きの電流が記録されました。SBFI蛍光の変化や、これらのシグナルがグルタミン酸のアンケージングによるものであることを示す内向きの電流は引き出されませんでした。ピーク振幅は、ケージ解除スポットに近いスパインでわずかに高かったが、それ以上のスパインのパターンは親樹状突起に似ていた。グルタミン酸のアンケージングに応答して樹状突起およびスパインにナトリウムが流入する経路は、ナトリウム透過性イオノトロピックグルタミン酸受容体、グルタミン酸誘導性細胞内ナトリウムシグナルの選択的ブロッカーを使用して研究され、これらのブロッカーの存在下で誘発された体細胞電流は省略されました。ブロッカーがウォッシュアウトすると、シグナルが回復し、グルタミン酸のケージ解除が約1錐体ニューロンの細胞向性グルタミン酸受容体を活性化し、細胞内のナトリウム一過性および内向きの電流をもたらすことが実証されています。この手順を試行する際は、準備への損傷を最小限に抑えるために、赤外線レーザーの強度を可能な限り低く選択することを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、細胞の微小残骸におけるナトリウムシグナル伝達を研究するための実験的アプローチの重要なステップを十分に理解しているはずです この技術を習得すると、他の技術によって導入された運動アーチファクトのない、無傷の組織で誘発された細胞内イオンシグナルの活性の高解像度イメージングが可能になります。

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。...

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。...

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。...

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

ここでは、中脳ニューロンのin vitro Ca2+ フラックスを測定するプロトコルと、プライマリマウス中脳培養を用いたカスパーゼ-3に対するその下流の影響を提示する。このモデルは、中脳ニューロンにおける異常なCa2+...

主マウス中脳ニューロンにおける自発的Ca2+ フラックスとその下流効果の定量化

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+...

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+...

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、感覚ニューロンシグナル伝達の堅牢な集団レベルの分析を可能にします。本研究では、ラット三叉神経節ニューロン活性の in vivo GECI可視化を可能にする新しいアプローチを開発しました。...

生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

このプロトコルは、無傷の三叉神経節(TG)ニューロンの in vivoGCaMPカルシウムイメージングを記述します。この説明には、TG 曝露手術、TG ニューロンの in vivo 共焦点顕微鏡イメージング、TG ニューロン顕微鏡イメージング中の体細胞刺激の適用、および in vivo GCaMP カルシウム イメージング...

インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

学ぶ多光子細胞内ナトリウムイメージングとUV焦点アンケージングを組み合わせた手法。マウス海馬CA1錐体ニューロンの樹状突起と棘におけるナトリウム動態を解析し、神経活動のメカニズム解明に貢献します。

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

さらに動画を探す