蛍光タンパク質の発現において Branchiostoma lanceolatum未受精卵へのmRNA注入による

この手順の全体的な目標は、蛍光タンパク質をコードするmRNAを気管支ストーマlancia latam卵母細胞に導入して、発生中の胚のin vivo蛍光イメージングを可能にすることです。これは、最初に24時間の温度ショックによって熟したamfi ais、オス、メスの産卵を誘導することによって達成されます。温度ショックの後、雌と雄は別々の産卵カップに入れられ、それぞれ卵子と精子を採取することができます。

ポリリジンコーティングされた皿に細胞を並べると、特別に調製されたマイクロインジェクション針を使用して、細胞のコア内に溶液を注入します。最後のステップは、1〜5滴の精子で細胞を受精させることです。最終的には2光子レーザースキャン。

顕微鏡法は、マイクロ注入されたmRNAから産生される蛍光タンパク質の遍在性発現を示すために使用されます。マイクロインジェクションのステップは、必要な技術スキルが印刷物で詳細に説明することが不可能なため、習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。まず、注射中に細胞を固定するために使用されるポリリジンコーティング皿を準備します。

35 mm細胞培養シャーレ1枚につき、底部をポリリジン溶液で覆い、室温で5分間インキュベートします。次に、ポリリジン溶液を別のディッシュに移し、再び室温で5分間インキュベートします。溶液を捨て、ペトリ皿を逆さまにして室温で2時間乾かします。

乾いたら、コーティングされた皿を4°Cのラップで包んで最大1週間保管してください。注入した胚の培養に用いるアロスコーティングディッシュを調製するには、人工海水と逆浸透水を作ります。次に、アロを濾過したSWに1%の濃度に溶解し、温かいアロ溶液を1つのシャーレから別のシャーレに迅速に注ぎ、ディッシュの非常に薄いアロスコーティングを確保します。

コーティングされた皿をサランラップで包み、摂氏4度で最大1週間保管します。まず、RNAとDNAフリーの水フェノールに注入ミックスを調製します。赤は溶液を着色し、注入に成功した胚の同定を可能にします。

次に、混合物を遠心分離して結晶をペレット化し、使用する準備ができるまで氷上に保ちます。準備ができたら、10マイクロリットルのピペットに0.5マイクロリットルの注入混合物をロードし、結晶がペレット化されたチューブの底を避けます。0.5マイクロリットルの滴下をピペッティングして、注射針を埋め戻します。

針の大きな開口部に混ぜます。注射中に1本が折れた場合に備えて、2本の針を用意してください。注射液の蒸発を防ぐために、針を底に水を入れた瓶に保管してください。

混ぜ合わせて摂氏4度に置きます。注入混合物を少なくとも1時間ゆっくりと注射針の先端に移動し、気泡の発生を最小限に抑えます。卵子と精子の収集を開始するには、オスとメスをSWで24時間ショックを与え、産卵の1〜2時間前に個々のカップに移します。

産卵したら、すぐに精子と細胞を採取します。収集中に大人を驚かせないように注意してください。追加の動きは散逸し、したがって収集後に精子と細胞の両方を希釈する可能性があります。

精子を1.5ミリリットルのチューブで氷上に保持し、ろ過したSWの細胞を事前にすすいだシャーレに移します。100〜500個の細胞を別の35mmシャーレに移して注射を行います。最後に、精子と細胞の品質のコントロールとして、または他の実験のために、細胞クラッチの残りの部分を受精させます。

注射手順を開始するには、25個のex眼球を備えた蛍光解剖スコープの下で水平面に対して50度の角度でマイクロマニピュレータに針を取り付け、30個の細胞をポリリジンコーティングされた皿に移し、SWをろ過して注入された細胞の追跡を支援します。それらを整然とした方法で線に沿って配置します。露出を最小限に抑えるために、常に小さな数値を注入してください。

ポリリジンまでの時間、これは発生中の胚を変形させる傾向があります。暗視野照明を使用して、細胞をできるだけ半透明にします。次に、粗い動きのノブで、注射針を細かい鉗子で細胞に近づけます。切る。

インジェクターでパルスして、先端が湾曲し始めるレベルで針を開きます。赤い注射ミックスが200倍の倍率で針から流れ出ていることを確認します。そして、細かい動きのつまみで、注入針を細胞の芯の内側にゆっくりと動かします。

表面的に2つ挿入すると、注入された溶液はUO部位内に残りません。挿入しすぎると、UOサイトが破壊されます。1〜3パルスで注入します。

針が十分に細い場合は、一定の圧力で連続流して注入します。注入量が、注入後の単一の卵子の体積の5分の1から3分の1に対応していることを確認してください。漏れを防ぐために、針をすばやく引き出してください。

注入した溶液が細胞内に留まること、および数秒後に注入した溶液が細胞全体に広がることを確認します。次のサイトに移動します。各シリーズの一部の非注入胚をネガティブコントロールとして保持し、注入された胚をスキャンするときにバックグラウンド蛍光を推定し、シリーズが注入されるとすぐに卵子を受精させます。

卵子の質は時間とともに低下するため、1時間以内に細胞を注入して受精させます。産卵後。精子の濃度にもよりますが、UYに1〜5滴の精子を加え、皿を渦巻きます。

受精エンベロープは、胚に明らかになるはずです。約1分後、胚をポリリジンでコーティングした皿から切り離し、別の一連の卵子を注入します。分離したら、胚をarosでコーティングされたペトリ皿に移します。

可能であれば、ポリリジンでコーティングされた皿から胚を取り除きます。.2つの細胞期の前。2細胞から4細胞の段階で、蛍光解剖スコープを使用して、正常に注入された胚を選択します。

DSRフィルターでは、注入の成功は、フェノールレッド由来の赤色蛍光シグナルを示す正常な形態によって示されます。胚を保持し、in vivoイメージングの所望の段階まで摂氏19度でアグロスコーティングされたペトリ皿でSWをろ過し、気管支ストーマlancia lato胚のこれらの代表的な画像は、mRNAのマイクロインジェクションおよびコーティング蛍光タンパク質の後に撮影された。この最初の画像は、H two B-E-G-F-Pコンストラクトのマイクロインジェクションによって得られた核EGFPの発現が、16細胞期という早い時期に胚で検出できることを示しています。

この胃期の胚は、核のmチェリーと膜を標的としたEGFPの遍在性共発現の一例です。核シグナルはH two BMチェリーコンストラクトのマイクロインジェクションから得られ、細胞膜での蛍光はEEG FP CAAXボックスコンストラクトのマイクロインジェクションによって得られます。この胃期胚の光学切片は、核標的mCherryと膜関連EGFPによって、核と細胞の輪郭がそれぞれどのように強調されるかを示しています。

このマイクロインジェクション技術の視覚的なデモンストレーションは、生物学コミュニティの進化的発展の研究者が、動物の進化を理解するための重要なモデルである個々のイメージング、遺伝子特異的操作、および安定のための既存のアプローチを改善し、開発することをサポートします。