Name: クイック蛍光その場でハイブリダイゼーションプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ クイック蛍光その場でハイブリダイゼーションと免疫蛍光を組み合わせた手法により、X染色体不活性化における長鎖非コードRNAの動態とエピジェネティック修飾を単一細胞レベルで解析する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

>jove_content<RNA FISHのオリゴヌクレオチド設計に関する有益なアドバイスをいただき、Hongjae Sunwooに感謝します。また、原稿を編集してくれたSerenity Curtis氏にも感謝します。NYは、日本学術振興会(JSPS)の海外特別研究員の支援を受けました。この研究は、NIH(RO1-GM102184)、March of Dimes Research Foundation(#6-FY12-337)、およびシンシナティ小児病院医療センターの開発基金および受託者助成金からY.O.への支援を受けました。

1.プローブの準備<ol><li> 5&#39;-アミノ修飾を有する複数の固有のXistにおけるオリゴヌクレオチド（20〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、63-65ºCの融解温度、 表1）を取得し、水に一時停止。 </li><li> 5&#39;-アミ​​ノ修正（合計4.5μgの）、製造業者の指示以下のアミン反応性蛍光色素で標識を用いてオリゴヌクレオチドのプール等モル量。 <ol><li>ヌクレアーゼを含まない水の最終5μlのプールされたオリゴヌクレオチドを​​溶解し、オリゴヌクレオチド溶液に、1M重炭酸ナトリウムの3μlを添加する。 </li><li>簡単にアミン反応性染料と渦のバイアルに2μlのDMSOを追加します。 </li><li> DMSO中の反応性染料をオリゴヌクレオチド溶液を混合し、暗所で1時間室温で混合物をインキュベートする。 </li></ol></li><li>エタノール沈殿に続くG-25カラムで蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを精製する。 <ol><li過剰保存バッファーを除去するために1分間750×gで&gt;遠心機G-25カラム。 </li><li>ステップ1.2.3で生産ラベリング混合物に40μlのヌクレアーゼフリー水を追加し、G-25カラムに適用されます。 2分間750×gで遠心分離する。 </li><li>ステップ1.3.2から精製されたプローブを、50μlのヌクレアーゼフリー水、10μlの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および250μlのエタノールを加える。 4℃で15分間21000×gで30分間の遠心のため-80℃で保存。 </li><li> 70％エタノール1mlで一回沈殿させたオリゴヌクレオチドを​​洗ってください。 </li><li> 50μl中に再懸濁ヌクレアーゼフリー水またはTE（10mMのトリス-HCl、pH7.5; 1mMのEDTA）、約10μMの最終濃度。 </li></ol></li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液（; 2×SSC [300mMのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム]; 2mg / mlのBSA、10％硫酸デキストラン、10％ホルムアミド）を用いて250nMでの最終濃度に蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを希釈する。 注：このクイックFISHプロトコルで、オリゴヌクレオチドPXistの中のローブを設計し、ハイブリダイゼーションのためのインキュベーション時間を短縮するためにオリゴヌクレオチドプローブを使用して、通常のFISHプロトコルよりも高い濃度で使用した。 </li></ol> 2.スライドさせて準備注：スライドをマウス胚性幹（ES）または胚様体（EB）を用いた免疫FISH用に調製することができるポリ-リジンで処理したスライド上に直接成長または細胞懸濁液をサイトスピンを用いて、セル20、21を微分する。ここで、サイトスピンによりスライドの準備を示している。 <ol><li> 6ウェルディッシュ中の培地を吸引除去する。 PBSで洗浄し（室温）、そして徹底的に吸引除去する。 </li><li> 37℃で5〜10分間インキュベート、6ウェルディッシュにトリプシンの0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>培地の5ミリリットルを加え、穏やかに数回ピペッティングして細胞を分散させる。 </li><li>室温で200×gで5分間、15mlチューブに遠心し、細胞を移す。 </li><li>メディアのANを破棄優しく2mlのPBSで細胞を懸濁dは。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、PBSによる4×10 5細胞/ mlで細胞懸濁液を希釈する。 </li><li>クリップでスライド、フィルタカードとチャンバーを組み立て、サイトスピンのローターで適切なスロットに入れます。サイトスピンで組み立てられたユニットの各チャンバーにステップ2.6で調製した各サンプルを250μlを追加。室温で10分間、1500rpmで遠心する。 </li><li> 40ミリリットルの氷冷PBS、CSKバッファーのそれぞれと氷上で3コプリンジャーフィル（10mMのPIPES、pHが6.8、100mMのNaCl、300mMのスクロース; 3のMgCl 2）、およびCSKTバッファー（0.5％トリトンとCSKバッファーX-100）、それぞれ。 </li><li>サイトスピンが終了した後、すぐに氷冷したPBS中にスライドを転送し、5分間インキュベートする。 </li><li>氷のように冷たいCSKバッファにスライドを移し、1分間インキュベートする。 </li><li>氷のように冷たいCSKTバッファにスライドを移し、5分間インキュベートする。 </li><li>バック氷のように冷たいCSK bufにスライド移動する。FERと1分間インキュベートする。 </li><li> PBS中の4％パラホルムアルデヒド中にスライドを移し、室温で10分間インキュベートする。 </li></ol> 3.免疫蛍光<ol><li>いくつかの秒（0.1％のTween-20を1×PBS）PBSTでコプリンジャーにスライドを置きます。 </li><li>残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重にスライドから余分な液体を拭き取り、水と空のピペットチップボックスに入れてください。静かにカバースリップを置き、ブロッキング溶液を40μl（1×PBS、1％BSA、0.1％のTween-20）を用いてスライドをオーバーレイし、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>カバースリップを外し、ブロッキング溶液を除去し、1の濃度に希釈し、ヒストンH3K27me3一次抗体40μlの追加：ブロッキング溶液で500を。バックスライド上にカバースリップを置き、室温で30分間インキュベートする。 注：ブロッキング溶液中のRNase阻害剤は、このRNA FIS中のRNAを保存するために役立つかもしれないポリクローナル抗体が使用されているHプロトコル。 </li><li>ウォッシュを優しく洗いながら揺れ、5分ごとに、PBSTで満たされたコプリンジャーに2回スライドさせます。 </li><li>残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重に余分な液体を拭き取り、バック先端ボックスにスライドを置く。二次抗体（1：500）の40μlのオーバーレイブロッキング溶液中で希釈し、カバースリップを置き、暗所で15分間インキュベートする。以下の手順については、すべての回で暗闇でスライドを保つ。 </li><li>ステップ3.4のように、PBSTでjarをコプリンで2回洗浄する。 </li></ol>オリゴヌクレオチドプローブ4. RNA FISH <ol><li>ステップ4.3でのRNA FISH 37℃での乾燥からスライドを防ぐために、下部の水と空のピペットチップボックスを事前に温める。 </li><li>残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重にステップ3.6からスライドから余分な液体を拭き、ワットとピペットチップボックスにスライドを置く下部のER。スライド上のFISH洗浄緩衝液（2×SSCで10％ホルムアミド）の500μLを加え、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> FISH洗浄溶液を外し、スライド上にオリゴヌクレオチドプローブの8μlを添加、カバースリップを配置し、下部の水と予め温めピペットチップボックスにスライドを転送する。 1〜2時間、37℃でインキュベートする。 </li><li> FISH洗浄緩衝液、DAPIによるFISH洗浄緩衝液、および2×SSCで37℃の水浴中で3予め温めコプリンジャーを置き。 </li><li> RNA FISH 1-2時間インキュベートした後、予め温めFISH洗浄緩衝液中にスライドを置く。 </li><li>カバースリップ、スライドの外に低下するまで数分間スライドをインキュベートします。 </li><li>バック洗浄バッファーにスライドを置き、5分間のインキュベーションを続ける。 </li><li> 0.5 / mlのDAPIで予め温めFISH洗浄緩衝液で別のコプリンジャーにスライドを移し、5分間インキュベートする。 </li><li>予め温め2X SSCで別のコプリンジャーにスライドを移し、5マイルインキュベートN。 </li><li>残りのバッファがスライドダウン流れることを可能に斜めにスライドを置きます。慎重に余分な液体を拭き取り、乾いた先端ボックスにバックスライドを置く。スライド上にDAPIで退色防止の4μLを追加し、カバースリップを配置。 </li><li>マニキュアでカバースリップを密封し、顕微鏡下で観察する。スライドは、数ヶ月間暗所で4℃で保存することができる。 </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gracefully+ageing+at+50%2C+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li>
<li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+X-inactivation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li>
<li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+by+RNAs%3A+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li>
<li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li>
<li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li>
<li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase%3A+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear%2Fchromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li>
<li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Xist.+Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li>
<li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li>
<li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+inactivation+in+mouse+ES+cells%3A+histone+modifications+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li>
<li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li>
<li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li>
<li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171(2004).</li>
<li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

本稿では、H3K27me3ためのスライドの準備、XistのRNA FISH、および免疫蛍光を完了するために、5未満の時間がかかる迅速な免疫FISHプロトコルを提示している。通常RNA FISHのための一晩のインキュベーションを必要とするXist RNA検出のための一般的な免疫FISH法と比較して、このプロトコルは、有意に費やされる時間を減少させるだけでなく、オリゴヌクレオチドプローブを使用して免疫FISHの感度を向上させるだけでなく、。 Xistのは、高度にX染色体不活性化の際に転写され、激しくシスの Xiに蓄積し、その転写産物が検出されるので、差別化RNA FISHにより分化した細胞は、比較的短いインキュベーション時間を利用する際のXist RNAの信号を検出することは容易である。免疫蛍光およびRNA FISHで最適化が必要とされ得るが、この免疫FISHプロトコルは、関心と豊富なRNAの他のタンパク質に適用することができる。他のRNAへのプロトコルを適用するためには、numは可能なオリゴヌクレオチドプローブのファイバは、プローブの濃度、インキ...

哺乳類のX染色体不活性化（XCI）は、雌では二つのX染色体の1が1転写不活性化され、XXとXY間のX連鎖遺伝子量のアンバランスを補償するための戦略である。 X染色体不活性化は、長い非コードRNA（lncRNA）研究のための優れたモデルシステムです。 X染色体不活性化は、複数のlncRNAsによって調節され、広範にlncRNAs、転写、クロマチン構造および核組織2,3間のクロストークメカニズムを解明するために、過去数十年にわたって研究されてきた。 X染色体上に位置するX不活性化センター（XIC）は、非コードRNA 4を産生する遺伝子の数で構成される複雑な遺伝子座である。 X-非アクティブな特定の転写産物（のXist）lncRNA真獣類哺乳動物においては、X染色体不活性化5,6に重要な役割を果たしているそのようなlncRNAです。 Xistの転写物のfuの位置を囲むトゥーレXiはX染色体不活性化を開始し、RNA FISHを用いて可視化するとき雲のように表示される。この形成は、「Xistのクラウド」7と呼ばれている。のXist RNAは、様々なクロマチン修飾酵素と相互作用するので、サイレントクロマチンと抑圧的な転写のための別のエピジェネティック修飾とXistの雲の共局在は、X染色体不活性化8の間に観察されている。例えば、XistのRNAはH3K27me3を担当し、抑圧的なクロマチン状態9を誘導するポリコーム抑制複合体2（PRC2）と対話します。 Xiと集中的なH3K27me3の修正との共局在上のXistの雲の発生は、西10,11の通性ヘテロクロマチン風景を表している。 そのようなDNA / RNA FISHなどの細胞遺伝学的技術は、強化された感度で最近、高度な技術を放射性標識したプローブ12を用いた従来の方法から長い道のりを歩んでいると複数のオリゴヌクレオチドプローブ13,14を用いた蛍光イメージング。免疫蛍光と連結DNA / RNAのFISHは、日常的に、時空間核組織、RNAの局在化、クロマチン構造および修正を理解するために、細胞学的ツールとして使用されてきた。 RNA FISHのための最も標準的なプローブの調製は、プラスミドまたは細菌人工染色体（BAC）クローンおよびニックトランスレーションまたはランダムプライミング15のいずれかそれらのその後の標識の使用を含む。しかし、ヒトにおけるマウスの遺伝子の約70％の遺伝子の40％は、したがって、センスおよびアンチセンス転写物を区別するために、鎖特異的FISH法を必要とする、センスおよびアンチセンス転写物16の重なりを示している。 インビトロ転写されたRNAプローブ（リボプローブ）は、多くの場合、鎖特異的RNA FISH 17,18のために使用される。しかしながら、これは、T7、SP6又はT3プロモータープラスミドクローンまたはPCR産物を調製し、リボプローブを合成することを含む。さらに、リボプローブはGENOMから派生icをDNAまたはcDNAは、多くの場合、高いバックグラウンドノイズを生じる​​非特異的領域および反復エレメントを含む。別の問題は、長さが数百ヌクレオチドであり、複数のフルオロフォアを含むリボプローブは、効率的に核内に浸透することができないということである。これを回避するために、終了時の単一のフルオロフォアで標識された複数の短いオリゴヌクレオチドプローブは、良好な感度、均一な信号強度、精製および取り扱い14の容易さを有するように開発されてきた。また、DNAオリゴヌクレオチドは、一般的にRNAよりも安定である。我々は、X染色体不活性化の過程のXist lncRNAによって誘発される西のエピジェネティックなダイナミクスを理解するために、免疫蛍光でのXist RNA FISH 19のオリゴヌクレオチドを用いて、同様の戦略を適用した。このプロトコルは、オリゴヌクレオチドプローブおよび適切な細胞の調製、ならびに免疫蛍光およびRNA FISHの利用の作成を記載している。複数oligonucleを使用してのXist RNA FISHotidesのXist RNA FISHは自分の研究室で日常的に行われた場合、長期的に費用対効果の高いアプローチです。この技術は、同時にエピジェネティック修飾または因子との共局在をマッピングしながら、細胞内でlncRNAsを同定するために用いることができる。プロトコルの1つの主な利点は、簡単に自分の研究関心に合わせてそれを変更する機能です。

<table><tbody><tr><td>5'-アミノ修飾オリゴヌクレオチド</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Reactive Dye</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>10715859103</tr><tr><td>Histone H3K27me3 抗体</td><td>アクティブ モチーフ</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ヤギ アンチマウス、高度に交差吸着された</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

クイック蛍光その場でハイブリダイゼーションプロトコル

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

免疫蛍光（免疫FISH）、 インサイチュハイブリダイゼーション （FISH） で RNA蛍光を組み合わせることにより、タンパク質の局在に同時洞察、エピジェネティックな改変およびその他の詳細とRNAの局在化の空間的なダイナミックスを検出するために、単一細胞レベルで使用することができる技術を作成その免疫蛍光によって強調することができる。 X染色体不活性化は、長い非コードRNA（lncRNA）媒介遺伝子サイレンシングのためのパラダイムである。哺乳類の雌の二つのX染色体の1のX非アクティブな特定の転写産物（Xistの雲と呼ばれる）（のXist）lncRNAの蓄積は、X染色体不活性化を開始する重要なステップです。のXist RNAは、直接または間接的に、様々なクロマチン修飾酵素と相互作用し、不活性X染色体（XI）に明確なエピジェネティックな風景を紹介します。 xiの一つの既知のエピジェネティックな特徴は、ヒストンH3のトリメチルリジン27（H3K27me3）変形例である。ここでは、簡単かつ迅速免疫FISHを記述のXist RNAおよび関連するエピジェネティック修飾の局在を調べるためにH3K27me3の免疫蛍光に結合された複数のオリゴヌクレオチドプローブとのRNA FISHを使用してのXist RNAを検出するためのプロトコル。 インビトロ転写されたRNAプローブ（リボプローブ）と比較して、より短いインキュベーション時間とのXist RNAのより高感度な検出オリゴヌクレオチドプローブの結果を使用して。このプロトコルは、lncRNAsのダイナミクスとそれに関連するエピジェネティックな修飾、クロマチン構造、原子力組織と転写調節を理解するための強力なツールを提供します。

迅速な免疫FISHの代表的な画像を図1Aに示されている。 Xiの上のXist RNAクラウドとH3K27me3信号の共局在は、女性の細胞を分化で検出された。分化の際に12日目に、EB細胞の90％以上は、Xistの雲（ 図1B）を有していた。短いオリゴヌクレオチドプローブを効率のXist RNA（; 97％はn = 150、図1C）と共局在し、ほぼすべてのH3K27me3信号の可視化をもたらす、核内に侵入。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52053/52053fig1highres.jpg"> 図1：のXist RNAのためのXist RNAとH3K27me3はマウスEBを区別するのXiに共局在（A）免疫FISH分化の際に12日目に、女性のEB細胞を分化におけるH3K27me3修飾を有する。...

私たちは、免疫蛍光と組み合わせた簡単にカスタマイズできる鎖特異的蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)プロトコルを開発しました。これにより、RNAダイナミクスの詳細な調査が可能になり、同時にクロマチン構造、核組織、および単一細胞レベルでの転写制御に関する洞察が得られます。

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

この手順の全体的な目標は、免疫蛍光と組み合わせた迅速な蛍光in situハイブリダイゼーションを使用して、X染色体不活性化中の長いノンコーディング存在、RNA、およびそれに関連するエピジェネティックな修飾のダイナミクスを調査することです。このプロトコールでは、分化している胚体細胞を含むスライドのシトシン調製が必要であり、これを浸透させてから染色のために固定します。次に、ヒストンHに対する抗体によって局在する蛍光マーカー3つのトリメチルリジン27が不活性なX染色体上に蓄積する。最後のステップでは、5つのプライムアミノ修飾を含み、AM平均反応性フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用します。RNAフィッシュ。最終的に、蛍光顕微鏡法は、E ES細胞の分化中の既存のRNAクラウドとヒストン修飾の局在を示すために使用されます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、単一のフルオロ4で標識された複数のユニークなオリゴヌクレオチドを使用することです。これにより、トランス特異的検出が可能になり、バックグラウンドが減少し、核への浸透も増加し、信号の強度が増減します。さらに、プローブの濃度を上げると、この免疫魚実験の完了に必要な時間を大幅に短縮できます。この方法では、不活性な外染色体上のRAの存在局在とそれに関連する色修飾についての洞察を得ることができます。また、RAやそれに関連するエピジェネティックな修飾、核局在化、世代を超えた調節を検出するために、他の生物学的システムにも適用できます。まず、プローブを調製するには、融解温度が摂氏63度から65度で、存在するRNAに対するユニークなアンチセンス配列とAの5プライムアミノ修飾を含む、20〜30ヌクレオチド長のオリゴを複数取得します。これらのオリゴを、さまざまなオリゴの等モル量の純水プールに懸濁し、合計4.5マイクログラムのDNAを生成します。次に、製造元の指示に従って、オリゴの標識に従って、オリゴをammean反応性蛍光色素で標識します。それらをG25列に通します。次に、エタノールと酢酸ナトリウムを使用して、オリゴを沈殿させます。これには、摂氏4度で21, 000Gのスピンを行う前に、マイナス80°Cで30分間の期間が必要です。次に、洗浄後にペレットを70%エタノールで一度洗浄します。Resusは、オリゴを50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水またはトリスEDTAに懸濁し、最終濃度が10マイクロモルのDNAになるまでします。これにより、プローブを使用するためのプローブストック溶液は、ハイブリダイゼーションバッファー中の250ナノモルに再濃縮されます。まず、ESまたはEBの分化細胞を6つのウェル皿で増殖させ、ウェルから培地を吸引し、細胞を室温で洗浄します。PBSはPBSを徹底的に吸引します。次に、各ウェルに0.5ミリリットルのトリプシン溶液を加え、プレートを5〜10分間インキュベートします。各ウェルに5ミリリットルの培地を加え、それらを穏やかにピペッティングして、トリプシン反応を停止します。次に、細胞を15ミリリットルのチューブに移します。次に、室温で200Gで5分間細胞をスピンダウンし、すべての上清を取り除き、細胞のパレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、細胞を数え、懸濁液をPBSで1ミリリットルあたり400, 000細胞に希釈します。次に、各スライドをフィルターカード、チャンバー、クリップで組み立てます。必要な数だけ作製し、サイトスピンのローターに配置します。各スライドに250マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、スライドを1500RPMで室温で10分間回転させます。次にパーメして修正します。まず、すすぎステップとして、スライドを氷冷PBSに5分間すばやく移します。次に、スライドを氷冷したCSKバッファーに1分間移して膨潤させ、3番目にスライドをCSKTバッファーに5分間移動して細胞を透過させます。第四に、細胞を氷冷したCSKバッファーで1分間洗浄します。最後に、室温の4%パラホルムアルデヒドをPBSに10分間固定します。まず、PFA溶液からスライドを取り出します。次に、PBSTを使用してコプランジャーに数秒間移し、その後、傾斜させて排水します。次に、空のピペットチップボックスに、チップホルダーインサートの下に水をロードします。次に、スライドの裏側を拭き取り、このボックスに移します。次に、各スライドに40マイクロリットルのブロッキング溶液を重ね、スライドをカバースリップで優しく覆います。それらをベンチで10分間箱の中でインキュベートさせます。次に、カバースリップを取り外し、スライドを斜めにセットします。次に、一次抗体溶液を40マイクロリットル加えます。カバースリップを交換し、スライドを30分後にベンチで30分間インキュベートします。コプランジャー内のPBSTでスライドを2回洗浄することにより、結合していない抗体を除去します。穏やかに振って、各洗濯を5分間待ちます。次に、スライドを斜めに戻し、PBSTを排出します。続いて、スライドの裏側から余分な溶液を拭き取り、スライドをボックスに戻します。次に、1〜500個の二次抗体溶液を40マイクロリットルを各スライドに適用します。スライドをカバースリップで覆い、光から保護された状態でベンチで15分間インキュベートします。スライドは常に光から保護する必要があります。先ほどと同様にPBSTで抗体を取り出し、スライドを斜めにセットして排出します。免疫蛍光法を行うときは、水の入った箱を摂氏37度に予温します。スライド裏面の洗浄バッファーを拭き取った後、温度水を入れたピペットチップボックスに入れ、各スライドに500マイクロリットルの魚の洗浄バッファーを塗布します。それらを5分間インキュベートさせます。5分後、各スライドの隣のスライドから、室温で作業プローブの8マイクロリットルで溶液を吸引し、カバースリップを塗布します。次に、スライドを予温スライドボックスに移し、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、スライドを37°Cのコプランジャーに入れた魚の洗浄バッファーに浸します。カバースリップが脱落した場合(通常は数分かかります)、カバースリップを取り外し、スライドを5分間インキュベートします。次に、スライドを、1ミリリットルあたり0.5ナノグラムのダッピーステインを含む魚の洗浄バッファーが入った瓶に、摂氏37度で移します。スライドをこの溶液で5分間インキュベートします。次に、スライドを2つのXSSCで5分間、摂氏37度で洗浄します。仕上げには、スライドを傾斜ドレインに2つのXSSCを余らせます。それらを拭き取り、dpiを含む4マイクロリットルのAntifa溶液で取り付けます。Quick Immuno Fishを用いて、既存のRNAおよびヒストン修飾の局在を観察しました。分化中の雌EB細胞は、不活化された1本のX染色体の全長を覆う緑色の雲のように見えますが、これらの細胞では、ヒストンHの3つのトリメチルリジン27修飾が赤で可視化され、DPIによって核が青で対比染色されています。分化中の雌マウスEB細胞を分化12日目に処理した。このとき、細胞の90%以上が細胞内に存在する雲を示し、核の短いオリゴヌクレオチドプローブが効率的に浸透することができ、その結果、ほぼすべてのヒストンHの染色が可能で、3つのトリメチルリジン27シグナルが150の核に存在するRNA雲により、97%の既存のRNAシグナルがこれらのメチル化ヒストンと共局在することがわかりました。一度習得すれば、このテクニックは5時間未満で完了し、わずかな準備を完了することができます。彼の免疫免疫蛍光は27年に3学期であり、RAが存在します。適切に実施すれば、この免疫魚のプロトコルは、他のRNAエピジェネティックな修飾や目的のタンパク質に適用することができます。このプロトコルを別の生物学的システムに適用するには、いくつかの最適化が必要になる場合があります。あなたの実験に頑張ってください。

quick-fluorescent-situ-hybridization-protocol-for-xist-rna-combined

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用...

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。...

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

蛍光カルシウムイメージングとin...

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

この記事では、X染色体異常のある女性の非移植および移植卵巣皮質組織における卵巣細胞のX染色体含有量を決定するための蛍光 in situ...

蛍光 In situ ハイブリダイゼーションを用いた卵巣細胞のX染色体異常の探索

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

学ぶ クイック蛍光その場でハイブリダイゼーションと免疫蛍光を組み合わせた手法により、X染色体不活性化における長鎖非コードRNAの動態とエピジェネティック修飾を単一細胞レベルで解析する方法です。

クイック蛍光その場でハイブリダイゼーションプロトコル

さらに動画を探す