クイック蛍光その場でハイブリダイゼーションプロトコル

この手順の全体的な目標は、免疫蛍光と組み合わせた迅速な蛍光in situハイブリダイゼーションを使用して、X染色体不活性化中の長いノンコーディング存在、RNA、およびそれに関連するエピジェネティックな修飾のダイナミクスを調査することです。このプロトコールでは、分化している胚体細胞を含むスライドのシトシン調製が必要であり、これを浸透させてから染色のために固定します。次に、ヒストンHに対する抗体によって局在する蛍光マーカー3つのトリメチルリジン27が不活性なX染色体上に蓄積する。

最後のステップでは、5つのプライムアミノ修飾を含み、AM平均反応性フルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用します。RNAフィッシュ。最終的に、蛍光顕微鏡法は、E ES細胞の分化中の既存のRNAクラウドとヒストン修飾の局在を示すために使用されます。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、単一のフルオロ4で標識された複数のユニークなオリゴヌクレオチドを使用することです。これにより、トランス特異的検出が可能になり、バックグラウンドが減少し、核への浸透も増加し、信号の強度が増減します。さらに、プローブの濃度を上げると、この免疫魚実験の完了に必要な時間を大幅に短縮できます。

この方法では、不活性な外染色体上のRAの存在局在とそれに関連する色修飾についての洞察を得ることができます。また、RAやそれに関連するエピジェネティックな修飾、核局在化、世代を超えた調節を検出するために、他の生物学的システムにも適用できます。まず、プローブを調製するには、融解温度が摂氏63度から65度で、存在するRNAに対するユニークなアンチセンス配列とAの5プライムアミノ修飾を含む、20〜30ヌクレオチド長のオリゴを複数取得します。

これらのオリゴを、さまざまなオリゴの等モル量の純水プールに懸濁し、合計4.5マイクログラムのDNAを生成します。次に、製造元の指示に従って、オリゴの標識に従って、オリゴをammean反応性蛍光色素で標識します。それらをG25列に通します。

次に、エタノールと酢酸ナトリウムを使用して、オリゴを沈殿させます。これには、摂氏4度で21, 000Gのスピンを行う前に、マイナス80°Cで30分間の期間が必要です。次に、洗浄後にペレットを70%エタノールで一度洗浄します。

Resusは、オリゴを50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水またはトリスEDTAに懸濁し、最終濃度が10マイクロモルのDNAになるまでします。これにより、プローブを使用するためのプローブストック溶液は、ハイブリダイゼーションバッファー中の250ナノモルに再濃縮されます。まず、ESまたはEBの分化細胞を6つのウェル皿で増殖させ、ウェルから培地を吸引し、細胞を室温で洗浄します。

PBSはPBSを徹底的に吸引します。次に、各ウェルに0.5ミリリットルのトリプシン溶液を加え、プレートを5〜10分間インキュベートします。各ウェルに5ミリリットルの培地を加え、それらを穏やかにピペッティングして、トリプシン反応を停止します。

次に、細胞を15ミリリットルのチューブに移します。次に、室温で200Gで5分間細胞をスピンダウンし、すべての上清を取り除き、細胞のパレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、細胞を数え、懸濁液をPBSで1ミリリットルあたり400, 000細胞に希釈します。

次に、各スライドをフィルターカード、チャンバー、クリップで組み立てます。必要な数だけ作製し、サイトスピンのローターに配置します。各スライドに250マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、スライドを1500RPMで室温で10分間回転させます。

次にパーメして修正します。まず、すすぎステップとして、スライドを氷冷PBSに5分間すばやく移します。次に、スライドを氷冷したCSKバッファーに1分間移して膨潤させ、3番目にスライドをCSKTバッファーに5分間移動して細胞を透過させます。

第四に、細胞を氷冷したCSKバッファーで1分間洗浄します。最後に、室温の4%パラホルムアルデヒドをPBSに10分間固定します。まず、PFA溶液からスライドを取り出します。

次に、PBSTを使用してコプランジャーに数秒間移し、その後、傾斜させて排水します。次に、空のピペットチップボックスに、チップホルダーインサートの下に水をロードします。次に、スライドの裏側を拭き取り、このボックスに移します。

次に、各スライドに40マイクロリットルのブロッキング溶液を重ね、スライドをカバースリップで優しく覆います。それらをベンチで10分間箱の中でインキュベートさせます。次に、カバースリップを取り外し、スライドを斜めにセットします。

次に、一次抗体溶液を40マイクロリットル加えます。カバースリップを交換し、スライドを30分後にベンチで30分間インキュベートします。コプランジャー内のPBSTでスライドを2回洗浄することにより、結合していない抗体を除去します。

穏やかに振って、各洗濯を5分間待ちます。次に、スライドを斜めに戻し、PBSTを排出します。続いて、スライドの裏側から余分な溶液を拭き取り、スライドをボックスに戻します。

次に、1〜500個の二次抗体溶液を40マイクロリットルを各スライドに適用します。スライドをカバースリップで覆い、光から保護された状態でベンチで15分間インキュベートします。スライドは常に光から保護する必要があります。

先ほどと同様にPBSTで抗体を取り出し、スライドを斜めにセットして排出します。免疫蛍光法を行うときは、水の入った箱を摂氏37度に予温します。スライド裏面の洗浄バッファーを拭き取った後、温度水を入れたピペットチップボックスに入れ、各スライドに500マイクロリットルの魚の洗浄バッファーを塗布します。

それらを5分間インキュベートさせます。5分後、各スライドの隣のスライドから、室温で作業プローブの8マイクロリットルで溶液を吸引し、カバースリップを塗布します。次に、スライドを予温スライドボックスに移し、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドを37°Cのコプランジャーに入れた魚の洗浄バッファーに浸します。カバースリップが脱落した場合(通常は数分かかります)、カバースリップを取り外し、スライドを5分間インキュベートします。次に、スライドを、1ミリリットルあたり0.5ナノグラムのダッピーステインを含む魚の洗浄バッファーが入った瓶に、摂氏37度で移します。

スライドをこの溶液で5分間インキュベートします。次に、スライドを2つのXSSCで5分間、摂氏37度で洗浄します。仕上げには、スライドを傾斜ドレインに2つのXSSCを余

それらを拭き取り、dpiを含む4マイクロリットルのAntifa溶液で取り付けます。Quick Immuno Fishを用いて、既存のRNAおよびヒストン修飾の局在を観察しました。分化中の雌EB細胞は、不活化された1本のX染色体の全長を覆う緑色の雲のように見えますが、これらの細胞では、ヒストンHの3つのトリメチルリジン27修飾が赤で可視化され、DPIによって核が青で対比染色されています。

分化中の雌マウスEB細胞を分化12日目に処理した。このとき、細胞の90%以上が細胞内に存在する雲を示し、核の短いオリゴヌクレオチドプローブが効率的に浸透することができ、その結果、ほぼすべてのヒストンHの染色が可能で、3つのトリメチルリジン27シグナルが150の核に存在するRNA雲により、97%の既存のRNAシグナルがこれらのメチル化ヒストンと共局在することがわかりました。一度習得すれば、このテクニックは5時間未満で完了し、わずかな準備を完了することができます。

彼の免疫免疫蛍光は27年に3学期であり、RAが存在します。適切に実施すれば、この免疫魚のプロトコルは、他のRNAエピジェネティックな修飾や目的のタンパク質に適用することができます。このプロトコルを別の生物学的システムに適用するには、いくつかの最適化が必要になる場合があります。あなたの実験に頑張ってください。