Name: レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、コクヌストモドキ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶレッドフラワービートル幼虫RNA干渉法。Tribolium castaneumの体腔へ二重鎖RNAを注入し、効率的な遺伝子ノックダウンと表現型解析を行う。発生段階における遺伝子機能研究に応用可能。

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私たちは技術的なサポートのためにマイアミ大学のバイオインフォマティクスやゲノム機能研究センター（CBFG）を感謝します。この作品は、マイアミ大学の起動許可（YT）、国立科学財団（：IOS 0950964 YT）によってサポートされていました。

<ol><li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li>
<li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li>
<li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li>
<li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10(2008).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431(2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li>
<li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutio.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Tribolium+castaneum%2C+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li>
<li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5(2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+WM+%22Systemic+RNAi+in+C+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%22">Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1</a>. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest%2C+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%2C+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

<html> dsRNA分子の長さと濃度を含むRNAiの成功を保証するために考慮する必要がある重要な問題の数、異なるdsRNA分子間の競争（しようとした複数のノックダウン時）、およびオフターゲット効果の可能性があります（OTE）。 dsRNAは長 dsRNA分子の長さは、（dsRNAの長い上限は現在不明であるが）長いdsRNAがRNAiの7,14,15をトリガするために、より効率的であることで、全身のRNAi反応の効率に影響を与える。 dsRNAは長さがTに効果的なRNAiを誘導するために50塩基対よりも長いことが必要であるコクヌスト 7。 150 bpおよび500bpの間のdsRNAはRNAi実験のための理想的であるように思われる。長いdsRNA分子を用いることもできるが、それらはますます困難になるOTEの機会が増加し、遺伝子クローニング段階を有することになる。 dsRNAは濃度ve_content &quot;&gt;遺伝子ノックダウンの程度が異なるが、dsRNAの濃度に応じて実現することができる。を1μg/μlを頻繁に近いヌル表現型を生産するための妥当な出発濃度、であるように思われる（目的の遺伝子（群）によって異なる場合があります）。RNAiは、より強いRNAiの表現型を得るために、より高い濃度（ 例えば 、7〜8μgの/μl）を用いて行うことができる。dsRNAの段階希釈したRNAiは、時には低形質の表現型のシリーズを生成するために有益であることができる（寅泰の補足データら 2009年8、Borràs-カステル未発表データ）。 RNAiのコンクール複数遺伝子ノックダウンは、T.で達成することができる同時に、いくつかの異なるdsRNA分子を注入しコクヌスト 。しかし、それはまた、生物内に存在するいくつかの異なるdsRNA分子を有することが多いのRNAiのコンポーネントにアクセスするためのdsRNA間の競争が生じることが知られている<s&gt; 7,14アップ。それは、一のdsRNA（他人を競合を回避するために、複数遺伝子ノックダウンを試みるときに、すべてのdsRNAは、同じ長さおよび同じ濃度を用いることが重要であるが、発現レベルが大きく間で異なる場合のdsRNAの長さおよび濃度の更なる調整が必要な場合が標的遺伝子）。私たちだけでなく、他の人は、成功した（ 例えば 、寅泰ら 、2005 16、寅泰ら 2009 17、およびYang ら 2009 18）ダブル、トリプルノックダウンを行った。実現可能なものの可能性が高いすべての4つの標的遺伝子のためのRNAi効率の有意な減少を引き起こすように、四重のRNAi（またはそれ以上）は、困難な場合があります。 オフターゲティング OTEは、RNAiベースのアプローチのための固有の問題である。 OTEを最小化する一つの方法は、dsRNAを設計する際にこれらの領域を他の遺伝子と類似の配列を共有する標的遺伝子内の領域を識別し、回避することである。 T.に対する単純なBLAST分析コクヌストの予測遺伝子セットは、そのような領域を識別することができます。いくつかのオンラインツールは、潜在的なOTE（ 例えば、E-RNAiの19）の評価を可能にする。標的遺伝子の2つの非重複領域のためのRNAiの実行は、表現型がOTEによって引き起こされる観察可能性を排除するための簡単​​で効率的な方法である。 （二つの非重複領域に類似の配列を共有しない限り）は、2つの非重複領域のため、RNAiは、同じ表現型を生成する場合OTEの可能性が最小化される。 表現型の解析以外の手段によって遺伝子ノックダウンの評価は、多くの場合、効果的に存在するRNAi関連のデータに重要である。遺伝子ノックダウンを評価するための二つの主要な方法は定量RT-PCRおよびウエスタンブロット分析である。定量RT-PCRは、標的mRNAのレベルを測定する便利な方法であり、T.のものを含む多くのRNAi関連の研究において使用されているコクヌスト （Miller らを参照してください。2012年7など）。しかし、それが私たちは最近、標的mRNAレベルはRNAiを（タンパク質産物が下方制御されているが）（Borràs-カステル未発表データ）によってアップレギュレートされているいくつかのケースを見てきたようにER、注意が、注意しなければならない。アップレギュレーションこのRNAiを誘発されたmRNAが広範囲または特定の遺伝子に特有のものができればそれは現在不明である。ウェスタンブロット分析は、遺伝子ノックダウンを確認するための別の方法である。それは最終タンパク質産物の量を測定するため、この方法は非常に信頼性があります。標的遺伝子のタンパク質産物に対して特異的な抗体の必要性は、このアプローチの欠点である。表現型分析に加えて、複数の独立した測定値を利用するのRNAiベースの分析によって得られた表現型データの信頼性を増加させる。 Tのその構想以来、 コクヌスト 、RNAiは、主に開発し、パターン形成において遺伝子機能を研究するために使用されてきた。これらのT。コクヌスト発達研究がCHARACで非常に成功している遺伝子の進化的に保存されており、分岐した機能をterizing（Denell 2008年及び2004クリングラー2に概説されている）。 Tのしかし、RNAiをベースの研究コクヌストは発生生物学に限定されるものではない。例えば、RNAiは、ストレス耐性、捕食、攻撃性、配偶者選択、活動パターン、および防御機構を含む、生理学的および行動反応、広範囲の遺伝子機能を研究するために利用することができる。 これらのコンテキストにRNAiを適用する一つの問題は、多面的効果の可能性である。多くの場合、目的の遺伝子は、Tを通じてさまざまな役割を持つことになりますコクヌストのライフサイクルは、このように困難な意図しない表現型効果なし遺伝子の除去を行う。しかし、簡単にステージの多様でRNAiを実行する能力は、多くの場合、これらの多面的な効果を回避するための有効な戦略であることができる。たとえば、代わりに幼虫や蛹の成人でRNAiを行うことは、私たちはUNINを回避できる可能性がある初期の開発中に遺伝子ノックダウンによって引き起こされる致死性を傾向があった。 TのRNAi応答の柔軟性コクヌストは、このように 、このモデルの生理学的および行動反応における遺伝子機能の実験にRNAiを適合させるための魅力的な選択肢となります。 T.コクヌストシステムはまた、教授の研究室での使用に最適です。T.コクヌストは、頻繁な継代培養せずに室温（25℃）で小麦粉/酵母混合物に容易に培養すること、およびT.におけるRNAi技術ができるコクヌストは若い、学習科学者と研究室に適応できるほど簡単である。 RNAiは、生物学のさまざまな分野において必須の技術になってきているように、学生は、この技術にさらされていることが重要です。 Tの幼虫のRNAi技術の直接的な性質コクヌストもTを作り、研究に関与することが、より多くの学生を奨励教室指向遺伝システムのための主要な候補をコクヌスト 。&lt;/ pの&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

コクヌストモドキ、 コクヌストは 、原因部分的には、RNA干渉（RNAi）1-3を実施するのしやすさに生物学のさまざまな分野で人気を集めています。のRNAiベースの遺伝子ノックダウン技術は、複雑な遺伝的方法を利用することなく、分析科学者が機能喪失を実行することを可能にする。T.コクヌストショー堅牢な全身RNAi応答、甲虫の体腔4-6に二本鎖RNA（dsRNA）の単純な注入を介して任意の段階でRNAiを実行することが可能となる。複数の遺伝子を同時にノックダウンTにも可能である同時に7,8に2つ以上の異なるdsRNA分子を注入しコクヌスト 。また、低形質の表現型の一連の注入されたdsRNAの8の濃度を低下させることによって生成することができる。これらの機能は、Tの伝統的なフォワード遺伝学へのRNAiベースの逆遺伝学的手法魅力的な代替案を作るコクヌスト 。以来、事実上すべてのT.コクヌスト組織は、細胞外dsRNA分子9に感受性であり、この技術は、研究者が多様な状況における多種多様な組織を研究することを可能にする。また、このレポートでは、TにRNAiを行うに焦点を当てていたがコクヌスト 、ここで説明する多くの手順は、他の昆虫にも適用可能である。したがって、このプロトコルは、Tにおける興味のコンテキストで機能喪失を実行したい人のための有用な分析をされているコクヌスト 、ならびに他の昆虫へのRNAiベースの手法を適用を希望する研究者にとって。 幼虫へのdsRNAを注入すると、幼虫、蛹および成虫期4,5,10などの甲虫のライフステージのさまざまなで機能的な分析を可能にする。私たちは、以前に分子生物学の手順11を含む当社の全体的な幼虫のRNAiプロトコルを報告している。現在のレポートでは、最高のビジュアル側近で説明されていたdsRNA注入手順を記述するに焦点を当てる。私たちは、提供する詳細なステップバイステップの注入手順だけでなく、良い面と悪い面の射出例。この視覚的なプロトコルは、これまでのプロトコルを補完するものであり、組み合わせたときに、彼らはTに幼虫のRNAi手順のより包括的なビューを提供コクヌスト 。さらに、当社は、RNAi、生理学的研究のためのRNAiベースのアッセイのアプリケーションの成功だけでなく、教育の実験室での幼虫のRNAiプロトコルの適用性に影響を与える可能性dsRNA分子のパラメータについて説明します。

<table><tbody><tr><td>有機全粒粉&nbsp;</td><td>ハートランドミル社カンザ</td><td>スG1</td><td></td></tr><tr><td>ブリューワーs 酵母</td><td>MP Biomedicals</td><td>2903312</td><td>使用前に#35ステンレス製ふるいで酵母をふるいにかけます。ふるいにかけられた酵母は微粒子で呼吸器系の危険性があるため、保護マスクを着用し、ふるいをラップで覆います。</td></tr><tr><td>6オンスのプラスチックショウジョウバエストックボトルフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>11-888</td><td></td></tr><tr><td>ふるい</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>04-881N</td><td>直径 8 インチ x 内径 2 インチ #25 を使用 (公称開口部 710 & マイクロ;m) 幼虫、蛹、成虫用。&nbsp;</td></tr><tr><td>ふるい</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>04 881 10P</td><td>8インチ直径#35(公称開口部:600 & マイクロ;m)&nbsp;ステンレス鋼ふるい、8インチ直径 x 2 インチ径このふるいは、酵母粉末から塊を取り除くのに理想的です。</td></tr><tr><td>ふるい受信機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>04-866B</td><td>8インチ径</td></tr><tr><td>1.5クォート噴出サンプルパン&nbsp;</td><td>シードブロイクイップメント(株)</td><td>モデル33</td><td>収集パン</td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーBioCold環境株式会社</td><td>BC26-IN</td><td>それを30&degに保ちます。湿度70%のC。</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>S374500</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>食用色素&nbsp;</td><td>クローガー</td><td></td><td>の緑、青、または赤の顕微鏡</td></tr><tr><td>スライドガラスが望ましい&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>タックイットオーバー&粘着</td>性のあるスライド用の<td>Aleeneの</td><td></td><td>再配置可能な接着剤の上。両面テープの代替として使用することができますが、接着力にばらつきがあることが分かりました。</td></tr><tr><td>プラスチックCDケース</td><td>アマゾン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウロリケートガラス毛細管</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>BF100-50-15</td><td>O.D. 1 mm、I.D. 0.5 mm、15 cm。フィラメントなし</td></tr>ニー<tr><td>ドルプーラー</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>P-87またはP-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>取り外し可能な取り付けパテ&nbsp;</td><td>Loctite Fun-Tak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>圧縮ガスダ</td><td>スターOfficeMax</td><td>OM96091</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11231-30</td>デュ<td>モクセル#3(カブトムシを操作するため)</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td>INOX#5(針先を壊すため)</td></tr><tr><td>エチルエーテル、無水&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>フライスタッフ/ジェネシーサイエンティフィック</td><td>57-102</td><td>120 &micro;m孔径/49%オープンエリア</td></tr><tr><td>メディアボトル、100ml</td><td>VWR</td><td>89000-926</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>SteREO Discovery V12.注射顕微鏡。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Fisher/Zeiss</td><td>12-070-513&nbsp;</td><td>Stemi2000です。針を折って、幼虫を粘着性のあるスライドに置くために使用します。</td></tr><tr><td>X-Yメカニカルステージ&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>4354600000000000</td><td></td></tr><tr><td>X-Y メカニカルステージ&nbsp;</td><td>Microscopenet.com</td><td>A512</td><td>安価な代替品</td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>成重</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>成重</td><td>GJ-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリーホルダー</td><td>成重</td><td>IM-H1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30 ml使い捨てシリンジ</td><td>BDシリンジ</td><td>309650</td><td>BD Luer-Lokチップ</td></tr><tr><td>4方向ストップコック&nbsp;</td><td>コール・パーマー・インストゥルメント・カンパニー</td><td>EW-30600-03</td><td>ルアー接続付きストップコック 4方向 オススリップ</td></tr><tr><td>アートペイントブラシ</td><td>Amazon</td><td>Art Advantage オイル&アクリルブラシセット、24ピース</td><td>一般的なペイントブラシなら何でも使えます。</td></tr></tbody></table>

レッドフラワービートル幼虫rna干渉、コクヌストモドキ

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

コクヌストモドキ、 コクヌストは 、完全に注釈付きのゲノム配列、トランスポゾン遺伝子導入し、効果的なRNA干渉（RNAi）を含む、遺伝学的および発生研究のための実験的なツールのレパートリーを提供しています。これらの利点の中でも、RNAiをベースの遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にある。T.コクヌストショー堅牢な全身RNAi応答は、単に甲虫の体腔内に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することによって、任意のライフステージでのRNAiを実行することが可能となる。 本稿では、Tにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明しますコクヌスト 。プロトコルは、Tの適切な段階は、（i）単離を含み注射のためのコクヌスト幼虫 、噴射セット用（ii）の準備、および（iii）のdsRNA注入。幼虫RNAiは、機能喪失phenotypにすばやくアクセスを提供してくれ、シンプルでありながら強力なテクニックです複数の遺伝子ノックダウン表現型だけでなく、低形質の表現型のシリーズを含むES、。事実上すべてのT.以来コクヌスト組織は細胞外dsRNAの影響を受けやすい、幼虫のRNAi技術は、研究者は外部環境への生物の応答の遺伝的基礎を含む多様な文脈での多種多様な組織を研究することができます。また、この技術の単純さは、T.を作り、研究のより学生の関与を刺激教室の設定で使用するための理想的な遺伝システムをコクヌスト 。

成功した注射のための重要なステップの一つは、良好な針を作ることです。ステップ6で説明したように、針の先端が前T.を注入により破壊される必要があるコクヌスト 。良い及び悪い針の例としては、 図1に示されている。良い針は0.05mm程度の直径の開口（ 図1B）と、鋭利な硬い先端を有する。 図2は、成功した注射（ 図2Aおよび2B）だけでなく、失敗した注射剤（ 図2C-2F）のいくつかのケースを提示します。適切なサイズの注射針と、針の先端は、最小の抵抗（ 図2A）と幼虫のクチクラを貫通し、およびdsRNA溶液（緑色）は、任意の漏れ（ 図2B）ことなく幼虫に流れ込む。それも適切なサイズの注射針とのdsRNA溶液をオーバーフロー（ 図原因になりますように、過剰注入しないでください2C）。針の先端が薄すぎると、ニードルチップは、多くの場合（ 図2D）注射が困難で、幼虫のキューティクルと屈曲部を貫通することができない。この問題が発生した場合、トリミングニードルチップは、時には役立ちます。大きな針は幼虫のクチクラ（ 図2E）を貫通するいくつかの困難はあるものの、多くの場合、まだ使用可能である。しかしながら、dsRNAの溶液を大量に容易しばしばdsRNAの溶液（ 図2F）のオーバーフローを生じるとしても注射器にわずかな圧力で針から押し出される。 RNAiを行う場合は、観察された効果は、dsRNAの非特異的効果、又は引き起こされる損傷のような注射手順（の結果ではないことを確認するためにRNAiが正常に動作していることを評価するための陽性対照、および陰性対照を有することが重要である注射、またはエーテル麻酔からの異常）による。 EYFPを標的とするdsRNAの注射は、としての役割を果たすことができる良い陽性対照PU-11株 5,7を使用した場合。 EYFP dsRNAは、最後の幼虫に注入されると、将来の翼原基におけるEYFPシグナルの有意な減少が、早くも1日後噴射（ 図3A）として観察することができる。 EYFPのノックダウンは、dsRNAの濃度は1など（十分に高い場合蛹（ 図3C及び3D）を通って、カブトムシの一生持続する二日EYFPのdsRNA（ 図3B）を注入し、このノックダウンした後に完了したμgの/μl）を、非内因性遺伝子配列であり、形態学的または生理学的混乱（ 図3A〜3D）を引き起こすべきではない7。EYFP dsRNAは、陰性対照としても使用することができる。 私たちは、どのようにEFの別の例として、 痕跡（VG）のための幼虫RNAiの画像、クリティカル翼遺伝子12を提供したこの注射ベースのRNAi技術はTにあるfective コクヌスト 。 VGのためのdsRNAは最後から二番目の段階の幼虫（最後の幼虫期の前に1段目）に注入されると、翼構造体の完全な喪失は、蛹（ 図3Eおよび3F）で観察することができる。その結果、大人にも完全に翼構造（ 図3Gおよび3H）を欠いている。 VGのためのRNAiの結果は堅牢性とT.におけるRNAiの全身の両方の性質を例示しているコクヌスト 。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500"> 図1：切れ目のない良い、悪い針の（A）（B）としてはよく壊れた良い針の先端（C）が大きすぎると鈍いです壊れた針の先端（D）の先端。損紙の薄すぎる、n個の針。スケールバー（赤色）は0.05ミリメートルである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500"> 図2：（A）A、適切なサイズの注射針は、終齢幼虫に挿入された（B）幼虫が適切に緑色のdsRNA溶液を注入した（C）過剰注入による注入点でのdsRNA溶液のオーバーフロー（D ）幼虫クチクラに浸透することができない細い針を。（E）終齢幼虫に挿入された大規模な注射針。（F）幼虫は、オーバーフローおよびdsRNA液の漏れ、その結果、大規模な針で注入した。矢印は、針を示している。ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500"> 図3：T.で成功したRNAiの例コクヌスト。（AD）EYFP 発現の減少におけるEYFPのdsRNA結果の最後の幼虫注入。から得られる（A）幼虫注射後1日である。（B）幼虫二日注射後。（C）コントロール蛹。（D）蛹幼虫EYFPのdsRNA注入。陰性対照は緩衝液インジェクション（A、B）およびDsRedの dsRNAの注入（C、D）である。矢頭および矢印は、EYFPの発現を示すか、それぞれ、翼原基と目にその欠如。（EH）ペンVGのための究極の幼虫のRNAi。（E）野生型蛹。（F）VGのRNAi蛹。翼構造の欠如は、蛹（矢印）。G）野生型の大人。（H）VGたRNAi成人ですでに表示されている。ウィング関連構造が完全に（矢印）が欠落している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

RNA干渉（RNAi）は、遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にあるベース。ここでは、 コクヌストにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明します。幼虫RNAiは、研究者が多様な文脈で遺伝子機能を研究することができ、機能喪失型の表現型への迅速なアクセスを提供する単純な、しかし強力な技術である。

レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、コクヌストモドキ

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

この手順の全体的な目標は、二本鎖RNA溶液を幼虫の体腔に注入することにより、赤い花の甲虫トリウムカジウムのRNA干渉を介して目的の遺伝子をノックダウンすることです。これは、最初に培養花をふるいにかけ、幼虫を種子鍋上の他の段階のカブトムシから分離することにより、幼虫の適切な段階を培養物から分離することによって達成されます。第2のステップは、針の先端を折って針ホルダーに置き、針に所望の濃度の二本鎖RNA溶液を前倒しして注射針を準備することです。次に、分離された幼虫を承認し、幼虫を粘着性のスライドガラスの上に置きます。最後のステップは、解剖顕微鏡で幼虫に二本鎖RNA溶液を注入することです。最終的に、目的の段階でのRNAi関連の表現型を分析して、標的遺伝子の機能を決定します。この技術が既存の方法(ニューロン新生やトランスジェネシスなど)と比較した場合の主な利点は、ダブレット鎖のRNA溶液をカブトムシの体腔に単純に注入するだけで、ベド発生の任意の望ましい段階で効率的で長期にわたる遺伝子ノックダウンを誘導できることです。ここで説明するプロトコルは、いくつかの変更を加えたトリウムキャスチンの幼虫に焦点を当てますが、注入手順は、トライアム、キャスチン、および他の昆虫の他の段階に適用することができます。一般的に、この方法に不慣れな個体は、幼虫を殺さずに適切な量の二本鎖RNA溶液を注入し、良い針を作るのに苦労するでしょう。ダブレット鎖RNAの注入と針の調製ステップは説明が難しく、培養の観察と実践を通じてのみ学ぶことができるため、この技術の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。添付のテキストプロトコルに詳述されているように、選択のティーキャスト株。カブトムシの培養ボトル1本を番号25のふるいにすぐに空にし、積極的にふるいにかけ、古い幼虫、蛹、成虫を収集します。次に、カブトムシが逃げるのを防ぐために、カブトムシをexusと一緒にシードパンタッピングに移します。次に、シードパンをそっと吹きかけて、カブトムシの表面からエクサスと花の粒子を取り除きます。シードパンをタップして解決します。内容です。より可動性の大人が山から出てくるのを待って、それらを取り除き、蛹の角度、鍋を少し下に分離します。そっとノックして蛹を転がして取り除き、幼虫だけをシードパンに残します。次に、分離した幼虫をきれいなペトリ皿に入れます。顕微鏡下での注射に必要な幼虫のステージを選択し、承認されるまでシャーレに入れておきます。カブトムシの残りの段階を組み合わせ、それらを培養ボトルに戻します。引っ張ったガラス針をガラス顕微鏡に取り付けます。解剖顕微鏡でスライドさせます。先端が曲がる場所を見つけます。その領域を先端側に少しつかみ、ひねって折れて幼虫のキューティクルを最適に浸透させ、直径約0.05ミリメートルの角度のある開口部の針を選択します。次に、ニードルホルダーの先端を緩めます。針の後端をホルダーの先端に置き、ゴム製のガスケットをホルダーの先端の下に置きます。次に、針の裏側をホルダーに挿入し、ゴム製ガスケットが開口部に挿入されていることを確認します。先端をホルダーにねじ込みます。次に、組み立てたニードルホルダーをニードルマニピュレーターに置きます。針の先端が顕微鏡の視野の中央にくるように位置を調整します。注入直前に二本鎖RNA溶液を調製します。20マイクロリットルの使い捨てピペットチップの先端をカットします。次に、トリミングされたピペットチップに溶液の10マイクロリットルをピペットで移します。背圧を与えて液体を先端に保持しながら、ピペットチップをピペットから慎重に取り外します。二本鎖RNA溶液を入れたピペットチップを顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡を覗いて、針の先端が装填されたピペットチップのすぐ内側に来て溶液に入るまで、ロードされたチップをゆっくりと針に向かって動かします。次に、注射シリンジのプランジャーを静かに引き戻し、針に過負荷をかけずに溶液をゆっくりと針に引き込みます。DS RNA溶液の末端が針の先端に近づくと、針の先端が空気に到達する前に、引っ張る速度を遅くして溶液のローディングを停止し、針ホルダーへの急速な取り込みを回避します。ストップコックを開いて、注射シリンジとニードルホルダーの圧力を取り除きます。次に、ピペットの先端を針の先端から離します。次に、針をステージ上に上げ、空になったピペットチップを顕微鏡ステージから取り外します。幼虫を電子認証バスケットに入れ、バスケットをエーテルボトルに入れて蓋を閉めます。3分後、幼虫の動きを確認します。まだ動いている場合は、さらに30秒間エーテルボトルに戻します。E認定の幼虫をバスケットから粘着性のあるスライドガラスの焦げ付き防止の端に移します。幼虫を順番にスライドに移します。それぞれを横に置きます。鉗子で頭から尾まで体をそっと軽くたたいて、少し伸ばして幼虫をスライドに固定します。次に、準備したスライドを顕微鏡ステージに配置します。二本鎖RNAをロードした針を幼虫の背側にそっと挿入し、ステージを使用して幼虫を針に移動します。次に、DS RNAの針を少し後ろに引きます。幼虫の体腔に入るには、幼虫が緑色に変わり、伸びていっぱいに見えるまで、注射器をそっと押します。次に、注射器を少し引き戻しながら、幼虫から針を取り外します。スライドにすべての幼虫を注入します。正常に注入されなかった幼虫を必ず取り除いてください。注入された幼虫は、すべての幼虫がE認証から回復するまで脇に置いておきます。次に、幼虫を頭から尾までそっと持ち上げ、きれいなペトリ皿に移し、注射創が凝固するまで少なくとも10分間放置します。その後、注入された幼虫を摂氏30度、湿度70%で培養します。幼虫のRNAI表現型を定期的に観察します。これらの例は、適切なサイズの注射針を使用して、緑色の二本鎖RNA溶液を最後の幼虫に注入した場合のさまざまな成功レベルを示しています。針先は最小限の抵抗で幼虫のキューティクルを貫通し、緑色のDS RNA溶液は漏れることなく幼虫に流れ込みます。PU 11株では、増強された黄色蛍光タンパク質が二本鎖RNA注入実験の良好なポジティブコントロールとして役立つ可能性があります。EYFP DS RNAを最後の幼虫期に注入すると、注入後1日という早い時期に、将来の翅原始におけるEYFPシグナルの大幅な減少が観察されます。EYFP発現のノックダウンは、通常、注射後2日で観察でき、DS RNA濃度が十分に高ければ、瞳孔期を通じてカブトムシの生涯を通じて持続します。EYFPは非内因性の遺伝子配列であるため、この遺伝子は、形態学的または生理学的混乱を引き起こさないネガティブコントロールとしても使用できます。この実験では、最後から2番目の幼虫に重要な翅遺伝子である痕跡用の二本鎖RNAを注入しました。瞳孔期には、翼構造の完全な喪失が観察されることに注意してください。結果として生じる成虫もまた、翼の構造を完全に欠いています。マスターすると、この手順に従って適切に実行すれば、この手法は2時間以内に実行できます。定量的リアルタイムPCR、in situハイブリダイゼーション、または免疫組織化学などの他の方法を実行して、標的遺伝子によって制御される遺伝子が開発後にどの遺伝子が制御されているかなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、研究者が複雑な遺伝学技術を使用せずに、機能喪失解析とtraum castenの胚発生後の段階を実行する道を開きました。この方法はシンプルな性質を持っているため、教育現場にも非常に適用できます。このビデオを見れば、注射の適切な段階を選択する方法、注射針の作り方、ダブルスタンダードRNAの許容注射を成功させる方法についてよく理解できるはずです。このプロトコルにより、TriumのRNIレベルを通じてGeneの機能を評価することができます。

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レッドフラワービートル幼虫RNA干渉、コクヌストモドキ

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