口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル

次の手順の全体的な目標は、xap Levis胚の口腔顔面表現型を定量的な統計的方法で記述することです。これは、まず、分離したxip胚の頭部を粘土型に取り付け、画像を使用して写真を記録することによって達成されます。顔の寸法は、口腔顔面領域のサイズに関する情報を提供するために測定されます。

次に、幾何学的形態測定法を介してランドマークを適用し、口腔顔面領域の形状を評価します。結果は、顔の寸法と相対的なランドマーク位置の統計分析に基づいて、Opusの口腔顔面領域のサイズと形状の大幅な変化を示しています。この方法は、オーパスや顔の発達に関する洞察を得ることができますが、進化的または生態学的目的で密接に関連する種の比較など、他の脊椎動物の形態学研究にも適用できます。

このセクションでは、写真記録のために胚の頭を保持するための粘土のライン皿の作り方を概説します。まず、モデリング用粘土を平らにして任意のサイズの皿にし、プレート全体を覆うように滑らかにします。次に、まっすぐなティーリング針を45度の角度で粘土に軽く押し込みます。

針をしっかりと持ち、皿をゆっくりと動かしてくぼんだ線を作ります。次に、ガラスピペットを使用して、各線に沿って浅い円形のくぼみを作成します。各くぼみには、ロードする前に胚の頭部を配置できます。

ヘッドはPBTで皿を満たしました。ザップピスの培養に関する詳細は、テキストプロトコルで概説されており、胚の固定に関する詳細も記載されています。このプロトコルでは、ステージ42とステージ45の間の胚を固定します。

まず、固定胚を約100ミリリットルのPBTを含む150ミリメートルのシャーレに入れます。さあ、彼らの頭を切断しなさい。まず、一対の鉗子で胚を保持し、メスを使用して腸の後側を切開します。

次に、腸の前面の心臓の近くに切開を行い、頭を完全に取り除きます。ピペットを使用して、ヘッドをクレイラインディッシュに移します。胚の頭は、写真撮影のためにまったく同じ向きで粘土に配置することが重要です。

成功を確実にするには、粘土に描かれた行をガイドとして使用します。また、同じ人が同じ日にすべての画像をキャプチャする場合にもメリットがあります。正面から見ると、写真は頭をくぼみの後方を下にして配置します。

鉗子を使用して頭と周囲の粘土を操作し、頭がカメラに面して固定され、横向きに傾かないようにします。写真では、頭の側面がすべて同じ方向を向くように頭が配置されています。ヘッドと周囲の粘土を操作して、セメントグランドがすべて同じ角度で下を向くようにします。

次に、画像キャプチャ機能を備えた解剖顕微鏡を使用して、オタマジャクシの頭部の画像を収集します。過度の影を防ぐためにいくつかのライトを使用し、可能な限り高い倍率を使用してください。各頭を同じ方法で撮影します。

次に、画像を非圧縮で可能な限り最高の解像度で保存します。画像から、口腔の顔の寸法を測定します。まず、顔の幅を決定します。

各目の腹側部分が顔の周辺部と出会う点を特定し、これらの点間の距離を測定します。顔の高さと口の顔の面積の測定の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。鼻の長さの決定に特に注意を払う横方向の画像では、目の前部を示す垂直線を作成します。

次に、顔がセメント腺の背側縁と出会う最前方の点から、目の前部を示す垂直線までの水平距離を測定します。口の幅や丸みなどの他の寸法は、この分析のテキストプロトコルで説明されており、顔のランドマーク座標を標準化してファイルに保存する必要があります。ランドマークは、画像の形状をキャプチャし、すべての画像で使用できる必要があります。

したがって、すべてのサンプルに存在するとは限らない構造は使用しないでください。次に、最初の画像ファイルを開きます。評価するには、メインツールバーのプラグインタブを選択し、ポイントピッカーを選択します。

ドロップダウンメニューから[ポイントの追加]タブを選択し、画像上にランドマークポイントを配置します。それらは多色で表示されます。クロスは、移動クロスツールを使用してランドマークポイントを切り替えます。

すべてを配置したら、メインツールバーの「表示結果」タブを選択し、「表示」オプションを選択します。これにより、ランドマークの座標が表示されます。次に、貼り付けたデータタイプLMの上の空の行に座標をコピーし、その後にサンプル内のランドマークの数を下の行

貼り付けられたデータ型 ID は、サンプルを識別する名前が後に続きます。各サンプルには一意の識別子が必要です。このプロセスを繰り返して、すべてのサンプル画像がマッピングされ、スプレッドシートに入力されます。

次に、各ランドマークのサンプルIDと座標を含む列をコピーして、テキストドキュメントに保存します。次に、形態測定ソフトウェアプログラムを開きます。このソフトウェアでは、メインメニューから[新しいデータセットの作成]を選択します。

ポップアップ画面でファイルとデータセットに名前を付け、ファイルを TPS としてインポートします。次に、座標のテキストファイルを選択してデータセットを作成します。次に、procrustesフィットとアライメントを行います。

まず、プロジェクトツリータブでデータセットを強調表示します。次に、メインツールバーで予備予選を選択し、ドロップダウンメニューから新しいprocrustesが適合します。使用可能な選択肢から、主軸による整列を選択します。

次に、予備のドロップダウンメニューで crusty のフィットバックを実行するオプションを選択し、コーヴァンスマトリックスの生成を選択して、実行を選択します。次に、[結果]タブから、コーヴァンス行列の相関を表示します。実験群のサンプルと対照群のサンプルを区別するには、データセット内の各サンプルを適切な分類器変数に代入して、分類器ファイルを作成します。

スプレッドシートで、ID というラベルの列を作成し、treatment というラベルの列を作成します。次に、各サンプルを ID 列にリストし、グループに割り当てます。[処理]列の下に、これをテキストファイルとして保存し、形態測定ソフトウェアプログラムで、[識別子による一致を選択]オプションを使用してインポートします。

次に、比較タブで、ポップアップメニューで判別関数分析変換を作成します。この関数では、適切なデータセットが選択され、データのタイプがprocrustesフィット座標であることを確認してください。比較するグループのペアを強調表示し、1000順列検定を実行します。

座標のベクトルマップを表示するには、グラフィックメニューに移動し、形状の違いタブを選択します。イメージが反転している場合は、プロット空間でポップアップメニューを表示して、ダイアグラムを正しい向きに反転します。また、ポップアップメニューでグラフを変換グリッドに変更し、ベクトルをグリッドに重ね合わせて、主成分分析の作成に関する詳細を表示します。

散布図の主成分分析。変換グリッド CVA、散布図、CVA 変換グリッドはすべてテキスト プロトコルで提供されます。胚を発生段階24からステージ30まで1マイクロモルのレチノイン酸受容体またはRAR阻害剤で処理し、次いでステージ42に固定し、DMSOで処理した対照胚を撮影した。

通常、RAR阻害剤による治療では、顔面眼の狭窄、眼の異常、口の奇形が生じていました。幾何学的形態計測解析を行った後、主成分分析により分散を評価しました。治療された胚は、対照と明確に区別されました。

PC の 1 つの軸に沿って、矢印はグループ内の統計的な外れ値を識別します。次に、形態学的差異を判別関数分析によって評価しました。横方向のランドマークの位置の劇的な変化は、顔の形が狭くなっていることを示しています。

鼻孔の位置のわずかな外側へのシフトは、矢印によって示されます。また、中面領域にも顕著な反りがあります。このビデオを見れば、従来のサイズ測定と幾何学的形態測定を組み合わせてTheusの胚の顔のサイズと形状を評価する方法について、十分に理解できるはずです。