Name: 口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ口腔顔面表現型の定量化法。Xenopus laevis胚を用いて、従来のサイズ測定と幾何学的形態測定学を組み合わせ、顔面の大きさと形状を統計的に解析する手法を解説。発生生物学研究に応用可能です。

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VCUからA·ディキンソンのスタートアップ資金がこの作品を支持した。 著者は、概略図を作成する際に、彼の芸術的才能のためのダンNacuを認識したい。

<ol><li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li>
<li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis%3A+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev Biol. 365, 229-240 (2012).</li>
<li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Orofacial+Development+and+Median+Clefts+in+Xenopus+Laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis.</a> Anat Rec (Hoboken). , (2014).</li>
<li>Dickinson, A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus%3A+cement+gland%2C+primary+mouth+and+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Development. 136, 1071-1081 (2009).</li>
<li>Barnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome+Transcription+Factor+is+critical+for+neural+crest+cell+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis.</a> Mech Dev. 129, 324-338 (2012).</li>
<li>Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+the+Xenopus+orthologue+of+the+Treacher+Collins+syndrome+%28TCOF1%29+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product.</a> Gene. 359, 73-80 (2005).</li>
<li>Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+2B+receptor+signaling+is+required+for+craniofacial+morphogenesis+and+jaw+joint+formation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus.</a> Development. 137, 2927-2937 (2010).</li>
<li>Schuff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxN3+is+required+for+craniofacial+and+eye+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis.</a> Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).</li>
<li>Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+osteogenesis+and+suture+morphology+in+Xenopus+laevis%3A+a+unique+model+system+for+studying+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li>
<li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac+J%22%5BJournal%5D)">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li>
<li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+anatomy+of+the+face+in+Down%27s+syndrome%3A+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).</li>
<li>Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+of+facial+growth+in+patients+with+unilateral+complete+clefts+of+the+lip%2C+alveolus+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniomaxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate.</a> J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).</li>
<li>Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+zebrafish+jaw%3A+development+beyond+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo.</a> Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).</li>
<li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+anatomy+of+the+face+in+Down%27s+syndrome%3A+age-related+changes+of+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).</li>
<li>Cooper, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bentho-pelagic+divergence+of+cichlid+feeding+architecture+was+prodigious+and+consistent+during+multiple+adaptive+radiations+within+African+rift-lakes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Klingenberg, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li>
<li>Allam, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+median+craniofacial+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">The spectrum of median craniofacial dysplasia.</a> Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. aF. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PDaFJ+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+Systematical+and+Chronological+Survey+of+the+Development+from+the+Fertilized+Egg+till+the+End+of+Metamorphosis%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis</a>. , Garland Publishing Inc. (1994).</li>
<li>Abdi, H., Williams, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+Component+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Computational+Statistics%22%5BJournal%5D)">Principal Component Analysis.</a> WIREs Computational Statistics. 2, (2010).</li>
<li>Hill, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHill%2C+TL+%22P.+STATISTICS%3A+Methods+and+Applications%22">P. STATISTICS: Methods and Applications</a>. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

アフリカツメガエルは、発達のメカニズム基礎口腔顔面開発を解剖するための有用なツールとなっています。しかし、カエルは、この領域の大きさや形状変化を記述するないプロトコルは現在ありません。ここで説明する方法では、アフリカツメガエルや他の脊椎動物における口腔顔面の表現型のより厳密な定量化を可能にすることによって口腔顔面開発の分野に大きく貢献していきます。 適切にこのプロトコルを実行する最初の、最も重要な側面は、顔の寸法を測定し、両方を正確かつ再現ランドマークの配置を決定する能力である。このためには、胚性面が同じ角度、方向の倍率で撮影されることが重要である。それが横方向に胚を操作し、一貫性のある配置を達成することは困難であるように、特に注意が、鼻の長さの正確な測定値を得るように注意しなければならない。一人の人間がS上のすべての測定を実行持つ結果の再現性を最大化しながら、AME日は、この種のエラーを最小限に抑えます。良好な結果を確保する二番目に重要な側面は、そのような発達の違いや遺伝的背景として、不必要な変動性の減少である。微妙な欠陥との間の統計的有意性...

人間の先天性欠損症の最も一般的かつ破壊的な種類の中には、口腔顔面裂1として、口や顔に影響を与えるものである。不正な形式の口腔顔面構造を持つ子どもたちが生涯にわたって、複数の手術を受け、顔面disfigurements、スピーチ、聴力や食の問題に苦労しています。したがって、cranio-および口腔顔面開発に新たな研究を促進することは、ヒトにおける先天性欠損、これらのタイプの予防と治療に最も重要である。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発を支配するメカニズムを解剖するための新しいツールとして浮上している（いくつかの例は、2,3,4を含む-11）。したがって、この種の頭部の発達と顔の間に大きさや形状変化を分析するための定量的な方法は3非常に強力である可能性があります。 ここでは、そのような方法を提示する。 アフリカツメガエルの研究12から適応幾何学的形態計測を持つ伝統的なサイズ測定を組み合わせる</人間の顔の形13-15を分析する研究のSUP&gt;と富。このプロトコルの目的は、研究者は、正常および異常な発達の間の異なる顔面表現型を区別するために、顔の大きさや形状を定量化できるようにすることである。この分析は、遺伝子および/または環境要因の相乗効果に起因するもののような微妙な顔面頭蓋の欠陥との間のより良好な区別を可能にする。さらに、この定量方法は、また口腔顔面欠陥の場合でもわずかな改善や救助を明らかにできた。したがって、これはそれの潜在的治療薬の分析に有用な指針になります。 ここで提示する顔の測定値と幾何形態計測の組み合わせは、大部分が1つまたは他の15-18を利用し 、現在のプロトコルよりも口腔顔面領域の大きさと形状の両方のより総合的な統計分析を可能にする。さらに、我々はの内側および外側面の両方を評価するための簡単​​な方法を提示現在の研究13,19で使用される洗練された三次元画像装置を必要とせずに、顔。 私たちは、 アフリカツメガエルでこのプロトコルは、異常な口腔顔面開発および中央値口蓋裂2,3を誘導するレチノイン酸受容体阻害剤で処理された胚をツメガエル実証する。これらの胚における口腔顔面領域の寸法及び形状の定量化は、類似の口蓋裂およびマウスモデル20,21を有するヒトに類似している顔面の変化を明らかにした。しかしながら、このプロトコルは、成長因子などの天然物質、除草剤、またはタンパク質などの口腔顔面開発に関する他の化合物の効果を評価するために利用することができる。さらに、損失または機能実験のゲインを介して遺伝子発現の摂動から生じる口腔顔面の大きさ及び形状の変化（アンチセンスまたはモルホリノCrispersを使用するには、/ Talens）もまた、このプロトコルを使用して定量することができる。最後に、我々は、このメソッド書または仕様書を開発LLY アフリカツメガエルの形態を評価する。しかしながら、容易に任意の脊椎動物の分析のために修正される。他のアプリケーションも、進化や生態の研究のために密接に関連した種を比較するため、このプロトコルを使用して含めることができます。ここで提供する例は、口腔顔面領域の分析を記述するためにこのプロトコルを利用するが、それは容易に他の領域、臓器または構造の分析のために修正することができる。 この口腔顔面定量化プロトコルは、研究コミュニティのための貴重な資源だけでなく、ビデオのデモンストレーションとして学部学生のための優れた教育ツールとなります。

<table><tbody><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td>、<td>AxioCamICC1カメラを装着</td></tr><tr><td>デュモン #5 イノックス鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み、使い捨てメス</td><td>Sklar</td><td>06-2015</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>087721</td><td></td></tr><tr><td>スタンダード 使い捨てトランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mmシャーレ</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Incubators</td><td>Ectotherm</td><td></td><td>を15°Cに設定。C または 20 &deg;C</td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td>プレモ、または<td>黒または白の他の</td><td>無毒モデリングクレイ</td><td></td></tr>ストレート<tr><td>ティーズニードル</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>19010</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ(針用)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>ホウロシル1.0 mm OD x 0.5 mm ID /ファイバー、各100 mmニー</td></tr><tr><td>ドルプーラー、モデルP-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>ニードルプーラー:P-97フレーミング/バウンマイクロピペットプーラーフィラメント:FB300B</td><td>フィラメントには、幅3.0mmのSutter 3.00mm角ボックスフィラメントを使用してください。</td></tr><tr><td>ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F144802、F123600、F123602</td><td></td></tr><tr><td>BMS-453</td><td>トクリス</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>アメリカン バイオアナリティ</td><td>カル AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>システイン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ファルコム</td><td>353003、351058</td><td>直径100mm、直径150mm</td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr></tbody></table>

口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

アフリカツメガエルは、頭蓋顔面の開発や欠陥を支配するメカニズムを解剖するための重要なツールとなっています。口腔顔面開発を定量化する方法は、遺伝的または分子的遺伝子発現またはタンパク質機能を操作することができる物質と廃止時顔面表現のより厳密な分析を可能にする。胚の頭部の二次元画像を用いて、従来のサイズの寸法を、そのような口顔の幅、高さ及び面積 - を計測する。また、胚口開口部の真円度測定は、口の形状を説明するために使用される。これらの二次元画像の幾何学的形態計測はまた、口腔顔面領域の形状の変化をより洗練されたビューを提供するために行われる。ランドマークは、口腔顔面領域内の特定のポイントに割り当てられ、座標が作成されます。主成分分析は、その後の処置を判別主成分にランドマークの座標を低減するために使用されるグループ。これらの結果は、類似した口腔顔面形状の個人が一緒にクラスター化した散布図として表示されます。これは、統計的に両群間のランドマークの位置を比較し、判別関数分析を実行することも有用である。この分析は、ランドマークの位置の変化は、ベクトルとして見られる変換グリッドに表示される。グリッドはワーピングパターンがかなりのランドマークの位置が変更されている場所を示すために表示されるように、これらのベクターに重畳される。判別関数分析における形状の変化は、統計的尺度に基づいており、したがって、p値によって評価することができる。この分析は、唯一のステレオスコープやフリーウェアのソフトウェアを必要とし、シンプルかつアクセス可能であるため、貴重な研究と教育のリソースとなります。

ここでは、口顔の大きさおよび形状の定量分析は、未処理対照とレチノイン酸受容体阻害剤（RAR阻害剤）で処理された胚を比較することが実証された。胚をステージ24から30までこの化学阻害剤の1μM濃度（26-35 HPF）で処理し、洗い流され、ステージ42（82 HPF）で固定した。次いで、それらを処理し、プロトコルに記載のように分析した。結果は、元のデータが、以前の出版物2,3の観測と一致している。対照胚は、ビヒクル、DMSOで処理した（ 図7AIと、ii）通常、開発された。 （ 図7Aiii、ⅳ）より三角形をRAR阻害剤の1μMの濃度で処理された胚は、顔、目の異常のわずかな狭小化を示し、それを開いて不正な形式の胚口があった。 まず、従来の顔面寸法を測定し、 図7Bに要約されている。 S tatistical有意性は、各測定のための阻害剤で処置した胚と対照との間で不等分散を仮定しスチューデントt検定を行うことによって決定した。私たちは、鼻の長さと顔の幅の両方が大幅...

アフリカツメガエル胚の顔面サイズおよび形状を定量化する方法が開発されている。このプロトコルでは、従来の大きさの測定は、口腔顔面開発や欠陥のより高度な分析を可能にするために、幾何学的形態計測と組み合わされる。

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

次の手順の全体的な目標は、xap Levis胚の口腔顔面表現型を定量的な統計的方法で記述することです。これは、まず、分離したxip胚の頭部を粘土型に取り付け、画像を使用して写真を記録することによって達成されます。顔の寸法は、口腔顔面領域のサイズに関する情報を提供するために測定されます。次に、幾何学的形態測定法を介してランドマークを適用し、口腔顔面領域の形状を評価します。結果は、顔の寸法と相対的なランドマーク位置の統計分析に基づいて、Opusの口腔顔面領域のサイズと形状の大幅な変化を示しています。この方法は、オーパスや顔の発達に関する洞察を得ることができますが、進化的または生態学的目的で密接に関連する種の比較など、他の脊椎動物の形態学研究にも適用できます。このセクションでは、写真記録のために胚の頭を保持するための粘土のライン皿の作り方を概説します。まず、モデリング用粘土を平らにして任意のサイズの皿にし、プレート全体を覆うように滑らかにします。次に、まっすぐなティーリング針を45度の角度で粘土に軽く押し込みます。針をしっかりと持ち、皿をゆっくりと動かしてくぼんだ線を作ります。次に、ガラスピペットを使用して、各線に沿って浅い円形のくぼみを作成します。各くぼみには、ロードする前に胚の頭部を配置できます。ヘッドはPBTで皿を満たしました。ザップピスの培養に関する詳細は、テキストプロトコルで概説されており、胚の固定に関する詳細も記載されています。このプロトコルでは、ステージ42とステージ45の間の胚を固定します。まず、固定胚を約100ミリリットルのPBTを含む150ミリメートルのシャーレに入れます。さあ、彼らの頭を切断しなさい。まず、一対の鉗子で胚を保持し、メスを使用して腸の後側を切開します。次に、腸の前面の心臓の近くに切開を行い、頭を完全に取り除きます。ピペットを使用して、ヘッドをクレイラインディッシュに移します。胚の頭は、写真撮影のためにまったく同じ向きで粘土に配置することが重要です。成功を確実にするには、粘土に描かれた行をガイドとして使用します。また、同じ人が同じ日にすべての画像をキャプチャする場合にもメリットがあります。正面から見ると、写真は頭をくぼみの後方を下にして配置します。鉗子を使用して頭と周囲の粘土を操作し、頭がカメラに面して固定され、横向きに傾かないようにします。写真では、頭の側面がすべて同じ方向を向くように頭が配置されています。ヘッドと周囲の粘土を操作して、セメントグランドがすべて同じ角度で下を向くようにします。次に、画像キャプチャ機能を備えた解剖顕微鏡を使用して、オタマジャクシの頭部の画像を収集します。過度の影を防ぐためにいくつかのライトを使用し、可能な限り高い倍率を使用してください。各頭を同じ方法で撮影します。次に、画像を非圧縮で可能な限り最高の解像度で保存します。画像から、口腔の顔の寸法を測定します。まず、顔の幅を決定します。各目の腹側部分が顔の周辺部と出会う点を特定し、これらの点間の距離を測定します。顔の高さと口の顔の面積の測定の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。鼻の長さの決定に特に注意を払う横方向の画像では、目の前部を示す垂直線を作成します。次に、顔がセメント腺の背側縁と出会う最前方の点から、目の前部を示す垂直線までの水平距離を測定します。口の幅や丸みなどの他の寸法は、この分析のテキストプロトコルで説明されており、顔のランドマーク座標を標準化してファイルに保存する必要があります。ランドマークは、画像の形状をキャプチャし、すべての画像で使用できる必要があります。したがって、すべてのサンプルに存在するとは限らない構造は使用しないでください。次に、最初の画像ファイルを開きます。評価するには、メインツールバーのプラグインタブを選択し、ポイントピッカーを選択します。ドロップダウンメニューから[ポイントの追加]タブを選択し、画像上にランドマークポイントを配置します。それらは多色で表示されます。クロスは、移動クロスツールを使用してランドマークポイントを切り替えます。すべてを配置したら、メインツールバーの「表示結果」タブを選択し、「表示」オプションを選択します。これにより、ランドマークの座標が表示されます。次に、貼り付けたデータタイプLMの上の空の行に座標をコピーし、その後にサンプル内のランドマークの数を下の行に続けます。貼り付けられたデータ型 ID は、サンプルを識別する名前が後に続きます。各サンプルには一意の識別子が必要です。このプロセスを繰り返して、すべてのサンプル画像がマッピングされ、スプレッドシートに入力されます。次に、各ランドマークのサンプルIDと座標を含む列をコピーして、テキストドキュメントに保存します。次に、形態測定ソフトウェアプログラムを開きます。このソフトウェアでは、メインメニューから[新しいデータセットの作成]を選択します。ポップアップ画面でファイルとデータセットに名前を付け、ファイルを TPS としてインポートします。次に、座標のテキストファイルを選択してデータセットを作成します。次に、procrustesフィットとアライメントを行います。まず、プロジェクトツリータブでデータセットを強調表示します。次に、メインツールバーで予備予選を選択し、ドロップダウンメニューから新しいprocrustesが適合します。使用可能な選択肢から、主軸による整列を選択します。次に、予備のドロップダウンメニューで crusty のフィットバックを実行するオプションを選択し、コーヴァンスマトリックスの生成を選択して、実行を選択します。次に、[結果]タブから、コーヴァンス行列の相関を表示します。実験群のサンプルと対照群のサンプルを区別するには、データセット内の各サンプルを適切な分類器変数に代入して、分類器ファイルを作成します。スプレッドシートで、ID というラベルの列を作成し、treatment というラベルの列を作成します。次に、各サンプルを ID 列にリストし、グループに割り当てます。[処理]列の下に、これをテキストファイルとして保存し、形態測定ソフトウェアプログラムで、[識別子による一致を選択]オプションを使用してインポートします。次に、比較タブで、ポップアップメニューで判別関数分析変換を作成します。この関数では、適切なデータセットが選択され、データのタイプがprocrustesフィット座標であることを確認してください。比較するグループのペアを強調表示し、1000順列検定を実行します。座標のベクトルマップを表示するには、グラフィックメニューに移動し、形状の違いタブを選択します。イメージが反転している場合は、プロット空間でポップアップメニューを表示して、ダイアグラムを正しい向きに反転します。また、ポップアップメニューでグラフを変換グリッドに変更し、ベクトルをグリッドに重ね合わせて、主成分分析の作成に関する詳細を表示します。散布図の主成分分析。変換グリッド CVA、散布図、CVA 変換グリッドはすべてテキスト プロトコルで提供されます。胚を発生段階24からステージ30まで1マイクロモルのレチノイン酸受容体またはRAR阻害剤で処理し、次いでステージ42に固定し、DMSOで処理した対照胚を撮影した。通常、RAR阻害剤による治療では、顔面眼の狭窄、眼の異常、口の奇形が生じていました。幾何学的形態計測解析を行った後、主成分分析により分散を評価しました。治療された胚は、対照と明確に区別されました。PC の 1 つの軸に沿って、矢印はグループ内の統計的な外れ値を識別します。次に、形態学的差異を判別関数分析によって評価しました。横方向のランドマークの位置の劇的な変化は、顔の形が狭くなっていることを示しています。鼻孔の位置のわずかな外側へのシフトは、矢印によって示されます。また、中面領域にも顕著な反りがあります。このビデオを見れば、従来のサイズ測定と幾何学的形態測定を組み合わせてTheusの胚の顔のサイズと形状を評価する方法について、十分に理解できるはずです。

quantification-of-orofacial-phenotypes-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル

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