Name: 口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ口腔顔面表現型の定量化法。Xenopus laevis胚を用いて、従来のサイズ測定と幾何学的形態測定学を組み合わせ、顔面の大きさと形状を統計的に解析する手法を解説。発生生物学研究に応用可能です。

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VCUからA·ディキンソンのスタートアップ資金がこの作品を支持した。 著者は、概略図を作成する際に、彼の芸術的才能のためのダンNacuを認識したい。

<ol><li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li>
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<li>Dickinson, A. J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li>
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<li>Schuff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxN3+is+required+for+craniofacial+and+eye+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis.</a> Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).</li>
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<li>Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li>
<li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac+J%22%5BJournal%5D)">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li>
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<li>Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+of+facial+growth+in+patients+with+unilateral+complete+clefts+of+the+lip%2C+alveolus+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniomaxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate.</a> J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).</li>
<li>Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+zebrafish+jaw%3A+development+beyond+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo.</a> Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).</li>
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<li>Cooper, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bentho-pelagic+divergence+of+cichlid+feeding+architecture+was+prodigious+and+consistent+during+multiple+adaptive+radiations+within+African+rift-lakes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Klingenberg, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

アフリカツメガエルは、発達のメカニズム基礎口腔顔面開発を解剖するための有用なツールとなっています。しかし、カエルは、この領域の大きさや形状変化を記述するないプロトコルは現在ありません。ここで説明する方法では、アフリカツメガエルや他の脊椎動物における口腔顔面の表現型のより厳密な定量化を可能にすることによって口腔顔面開発の分野に大きく貢献していきます。 適切にこのプロトコルを実行する最初の、最も重要な側面は、顔の寸法を測定し、両方を正確かつ再現ランドマークの配置を決定する能力である。このためには、胚性面が同じ角度、方向の倍率で撮影されることが重要である。それが横方向に胚を操作し、一貫性のある配置を達成することは困難であるように、特に注意が、鼻の長さの正確な測定値を得るように注意しなければならない。一人の人間がS上のすべての測定を実行持つ結果の再現性を最大化しながら、AME日は、この種のエラーを最小限に抑えます。良好な結果を確保する二番目に重要な側面は、そのような発達の違いや遺伝的背景として、不必要な変動性の減少である。微妙な欠陥との間の統計的有意性...

人間の先天性欠損症の最も一般的かつ破壊的な種類の中には、口腔顔面裂1として、口や顔に影響を与えるものである。不正な形式の口腔顔面構造を持つ子どもたちが生涯にわたって、複数の手術を受け、顔面disfigurements、スピーチ、聴力や食の問題に苦労しています。したがって、cranio-および口腔顔面開発に新たな研究を促進することは、ヒトにおける先天性欠損、これらのタイプの予防と治療に最も重要である。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発を支配するメカニズムを解剖するための新しいツールとして浮上している（いくつかの例は、2,3,4を含む-11）。したがって、この種の頭部の発達と顔の間に大きさや形状変化を分析するための定量的な方法は3非常に強力である可能性があります。 ここでは、そのような方法を提示する。 アフリカツメガエルの研究12から適応幾何学的形態計測を持つ伝統的なサイズ測定を組み合わせる</人間の顔の形13-15を分析する研究のSUP&gt;と富。このプロトコルの目的は、研究者は、正常および異常な発達の間の異なる顔面表現型を区別するために、顔の大きさや形状を定量化できるようにすることである。この分析は、遺伝子および/または環境要因の相乗効果に起因するもののような微妙な顔面頭蓋の欠陥との間のより良好な区別を可能にする。さらに、この定量方法は、また口腔顔面欠陥の場合でもわずかな改善や救助を明らかにできた。したがって、これはそれの潜在的治療薬の分析に有用な指針になります。 ここで提示する顔の測定値と幾何形態計測の組み合わせは、大部分が1つまたは他の15-18を利用し 、現在のプロトコルよりも口腔顔面領域の大きさと形状の両方のより総合的な統計分析を可能にする。さらに、我々はの内側および外側面の両方を評価するための簡単​​な方法を提示現在の研究13,19で使用される洗練された三次元画像装置を必要とせずに、顔。 私たちは、 アフリカツメガエルでこのプロトコルは、異常な口腔顔面開発および中央値口蓋裂2,3を誘導するレチノイン酸受容体阻害剤で処理された胚をツメガエル実証する。これらの胚における口腔顔面領域の寸法及び形状の定量化は、類似の口蓋裂およびマウスモデル20,21を有するヒトに類似している顔面の変化を明らかにした。しかしながら、このプロトコルは、成長因子などの天然物質、除草剤、またはタンパク質などの口腔顔面開発に関する他の化合物の効果を評価するために利用することができる。さらに、損失または機能実験のゲインを介して遺伝子発現の摂動から生じる口腔顔面の大きさ及び形状の変化（アンチセンスまたはモルホリノCrispersを使用するには、/ Talens）もまた、このプロトコルを使用して定量することができる。最後に、我々は、このメソッド書または仕様書を開発LLY アフリカツメガエルの形態を評価する。しかしながら、容易に任意の脊椎動物の分析のために修正される。他のアプリケーションも、進化や生態の研究のために密接に関連した種を比較するため、このプロトコルを使用して含めることができます。ここで提供する例は、口腔顔面領域の分析を記述するためにこのプロトコルを利用するが、それは容易に他の領域、臓器または構造の分析のために修正することができる。 この口腔顔面定量化プロトコルは、研究コミュニティのための貴重な資源だけでなく、ビデオのデモンストレーションとして学部学生のための優れた教育ツールとなります。

<table><tbody><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td>、<td>AxioCamICC1カメラを装着</td></tr><tr><td>デュモン #5 イノックス鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み、使い捨てメス</td><td>Sklar</td><td>06-2015</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>087721</td><td></td></tr><tr><td>スタンダード 使い捨てトランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mmシャーレ</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Incubators</td><td>Ectotherm</td><td></td><td>を15°Cに設定。C または 20 &deg;C</td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td>プレモ、または<td>黒または白の他の</td><td>無毒モデリングクレイ</td><td></td></tr>ストレート<tr><td>ティーズニードル</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>19010</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ(針用)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>ホウロシル1.0 mm OD x 0.5 mm ID /ファイバー、各100 mmニー</td></tr><tr><td>ドルプーラー、モデルP-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>ニードルプーラー:P-97フレーミング/バウンマイクロピペットプーラーフィラメント:FB300B</td><td>フィラメントには、幅3.0mmのSutter 3.00mm角ボックスフィラメントを使用してください。</td></tr><tr><td>ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F144802、F123600、F123602</td><td></td></tr><tr><td>BMS-453</td><td>トクリス</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>アメリカン バイオアナリティ</td><td>カル AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>システイン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ファルコム</td><td>353003、351058</td><td>直径100mm、直径150mm</td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr></tbody></table>

口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

アフリカツメガエルは、頭蓋顔面の開発や欠陥を支配するメカニズムを解剖するための重要なツールとなっています。口腔顔面開発を定量化する方法は、遺伝的または分子的遺伝子発現またはタンパク質機能を操作することができる物質と廃止時顔面表現のより厳密な分析を可能にする。胚の頭部の二次元画像を用いて、従来のサイズの寸法を、そのような口顔の幅、高さ及び面積 - を計測する。また、胚口開口部の真円度測定は、口の形状を説明するために使用される。これらの二次元画像の幾何学的形態計測はまた、口腔顔面領域の形状の変化をより洗練されたビューを提供するために行われる。ランドマークは、口腔顔面領域内の特定のポイントに割り当てられ、座標が作成されます。主成分分析は、その後の処置を判別主成分にランドマークの座標を低減するために使用されるグループ。これらの結果は、類似した口腔顔面形状の個人が一緒にクラスター化した散布図として表示されます。これは、統計的に両群間のランドマークの位置を比較し、判別関数分析を実行することも有用である。この分析は、ランドマークの位置の変化は、ベクトルとして見られる変換グリッドに表示される。グリッドはワーピングパターンがかなりのランドマークの位置が変更されている場所を示すために表示されるように、これらのベクターに重畳される。判別関数分析における形状の変化は、統計的尺度に基づいており、したがって、p値によって評価することができる。この分析は、唯一のステレオスコープやフリーウェアのソフトウェアを必要とし、シンプルかつアクセス可能であるため、貴重な研究と教育のリソースとなります。

ここでは、口顔の大きさおよび形状の定量分析は、未処理対照とレチノイン酸受容体阻害剤（RAR阻害剤）で処理された胚を比較することが実証された。胚をステージ24から30までこの化学阻害剤の1μM濃度（26-35 HPF）で処理し、洗い流され、ステージ42（82 HPF）で固定した。次いで、それらを処理し、プロトコルに記載のように分析した。結果は、元のデータが、以前の出版物2,3の観測と一致している。対照胚は、ビヒクル、DMSOで処理した（ 図7AIと、ii）通常、開発された。 （ 図7Aiii、ⅳ）より三角形をRAR阻害剤の1μMの濃度で処理された胚は、顔、目の異常のわずかな狭小化を示し、それを開いて不正な形式の胚口があった。 まず、従来の顔面寸法を測定し、 図7Bに要約されている。 S tatistical有意性は、各測定のための阻害剤で処置した胚と対照との間で不等分散を仮定しスチューデントt検定を行うことによって決定した。私たちは、鼻の長さと顔の幅の両方が大幅...

アフリカツメガエル胚の顔面サイズおよび形状を定量化する方法が開発されている。このプロトコルでは、従来の大きさの測定は、口腔顔面開発や欠陥のより高度な分析を可能にするために、幾何学的形態計測と組み合わされる。

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

次の手順の全体的な目標は、xap Levis胚の口腔顔面表現型を定量的な統計的方法で記述することです。これは、まず、分離したxip胚の頭部を粘土型に取り付け、画像を使用して写真を記録することによって達成されます。顔の寸法は、口腔顔面領域のサイズに関する情報を提供するために測定されます。次に、幾何学的形態測定法を介してランドマークを適用し、口腔顔面領域の形状を評価します。結果は、顔の寸法と相対的なランドマーク位置の統計分析に基づいて、Opusの口腔顔面領域のサイズと形状の大幅な変化を示しています。この方法は、オーパスや顔の発達に関する洞察を得ることができますが、進化的または生態学的目的で密接に関連する種の比較など、他の脊椎動物の形態学研究にも適用できます。このセクションでは、写真記録のために胚の頭を保持するための粘土のライン皿の作り方を概説します。まず、モデリング用粘土を平らにして任意のサイズの皿にし、プレート全体を覆うように滑らかにします。次に、まっすぐなティーリング針を45度の角度で粘土に軽く押し込みます。針をしっかりと持ち、皿をゆっくりと動かしてくぼんだ線を作ります。次に、ガラスピペットを使用して、各線に沿って浅い円形のくぼみを作成します。各くぼみには、ロードする前に胚の頭部を配置できます。ヘッドはPBTで皿を満たしました。ザップピスの培養に関する詳細は、テキストプロトコルで概説されており、胚の固定に関する詳細も記載されています。このプロトコルでは、ステージ42とステージ45の間の胚を固定します。まず、固定胚を約100ミリリットルのPBTを含む150ミリメートルのシャーレに入れます。さあ、彼らの頭を切断しなさい。まず、一対の鉗子で胚を保持し、メスを使用して腸の後側を切開します。次に、腸の前面の心臓の近くに切開を行い、頭を完全に取り除きます。ピペットを使用して、ヘッドをクレイラインディッシュに移します。胚の頭は、写真撮影のためにまったく同じ向きで粘土に配置することが重要です。成功を確実にするには、粘土に描かれた行をガイドとして使用します。また、同じ人が同じ日にすべての画像をキャプチャする場合にもメリットがあります。正面から見ると、写真は頭をくぼみの後方を下にして配置します。鉗子を使用して頭と周囲の粘土を操作し、頭がカメラに面して固定され、横向きに傾かないようにします。写真では、頭の側面がすべて同じ方向を向くように頭が配置されています。ヘッドと周囲の粘土を操作して、セメントグランドがすべて同じ角度で下を向くようにします。次に、画像キャプチャ機能を備えた解剖顕微鏡を使用して、オタマジャクシの頭部の画像を収集します。過度の影を防ぐためにいくつかのライトを使用し、可能な限り高い倍率を使用してください。各頭を同じ方法で撮影します。次に、画像を非圧縮で可能な限り最高の

quantification-of-orofacial-phenotypes-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

頭蓋顔面軟骨は他の組織と緊密に連絡を開発し、生きている動物で操作するのが難しいです。我々は、初期胚の影響を迂回しながら顎顔面骨格の成長中に分子ツールを提供するためにエレクトロポレーションを使用しています。このアプローチは、私たちは効率的に候補分子をテストすることができます...

顔面間葉のエレクトロポレーション

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。...

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。...

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus...

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

メラノサイト機能の調節因子は、色素沈着の結果の目に見える違いを支配します。候補色素沈着遺伝子の分子機能を解読することは課題となる。ここでは、ゼブラフィッシュモデルシステムを使用して候補を特定し、メラニン含有量とメラノサイト数の調節因子に分類する方法を示します。...

ゼブラフィッシュを用いた色素沈着制御因子同定のための逆遺伝学的アプローチ

ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセス、特にヒトの神経変性疾患を研究するための有用なツールです。しかし、粗眼の表現型の手動定量化は偏りがあり、信頼性に欠ける可能性があります。ここでは、ilastikとFlynotyperを使用して、偏りのない方法で眼の表現型を定量化する方法について説明します。...

ショウジョウバエの眼の表現型の定量化:ilastikとFlynotyperを統合した計算アプローチ

ここでは、成虫の ショウジョウバエ...

成人の ショウジョウバエ の外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー

本研究は、ゼブラフィッシュ幼生の顔面構造変化を測定するために、無料ソフトウェア(tpsDigs2、MorphoJ、PAST)を用いて頭蓋顔面軟骨の形状を定量化するプロトコルを説明しています。...

形状の形態計測解析:ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面形状定量化のための解析ソフトウェアツールボックス

学ぶ口腔顔面表現型の定量化法。Xenopus laevis胚を用いて、従来のサイズ測定と幾何学的形態測定学を組み合わせ、顔面の大きさと形状を統計的に解析する手法を解説。発生生物学研究に応用可能です。

口腔顔面表現型の定量化でアフリカツメガエル

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