ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

次の実験の全体的な目標は、手動サンプル処理を使用してゼブラフィッシュの胚で化学スクリーニングを実行することです。これは、まず成魚を仕切りのある交尾室に一晩中入れ、翌朝仕切りを取り外して胚を採取することで達成されます。次に、ゼブラフィッシュの胚のグループを96ウェルプレートに配列し、目的の発生段階で薬剤で処理します。

次に、胚を4%パラアルデヒドで固定して発生させ、目的の発生過程に対する小分子の影響を測定するためのアッセイを行います。その結果、遺伝子発現ドメインの獲得や喪失などの発生的変化が示されており、これは、調査した小分子によって引き起こされる硫酸塩や組織の形態形成の変化を示している可能性がある。この技術の意味するところは、治療薬となる可能性のある化合物を同定する能力があるため、さまざまな疾患の臨床治療にまで及びます。

一般に、この技術に不慣れな個人は、マルチウェルプレート間で胚を損傷なく移植するなど、胚を扱うために必要な器用さを習得する必要があるため、苦労する可能性があります。手順を実演するのは、私自身と研究室の学部生研究者であるエリック・ドナヒューです ゼブラフィッシュの交配を設定するため。仕切り付きの交配チャンバーを使用し、仕切りの片側に成魚の雄のゼブラフィッシュを、もう一方の側に成魚の雌のゼブラフィッシュを配置します。

試験する低分子の96ウェルプレートごとに。25個の嵌合タンクを設置し、一晩放置します。翌日、各魚のペアを分離するチャンバーを取り外し、1時間後、細かいメッシュのストレーナーを使用して胚を収集し、トランスファーピペットでE 3培地を含むペトリ皿に入れます。

プレートとステレオスコープの下で破片を取り除きます。胚の各クラッチを観察し、未受精卵をすべて取り除きます。E threeミディアムをデカントし、新しいE threeと交換します。

次に、胚の各皿を摂氏28.5度のインキュベーターに2時間置きます。プレートを再度確認し、追加の未受精卵を捨てます。胚を40%eely段階まで孵化させ続けます。

ケミカルライブラリープレートをマイナス80°Cから取り外します。アルミホイルを使用して覆い、8チャンネルピペットで室温で解凍します。96ウェルプレートの2列目から12列目に99マイクロリットルのE 3を加えます。

次に、ここではカラム2から11のウェルに適切な化合物の1マイクロリットルを追加し、実験サンプルとして指定されていますDMSOの1マイクロリットルをカラム12として設計された制御カラムにピペットします。希釈プレートをアルミホイルで覆い、ストックケミカルライブラリーを冷凍庫に戻します。次に、40%epi段階の胚を含むペトリ皿を選択した後、トランスファーピペットを使用して、ウェルごとに約10個の胚を96の列2〜12に慎重に配置します。

ウェルプレート。ガラス製トランスファーピペットを使用して、各ウェルから余分なE 3を取り除き、液体廃棄物容器に排出します。胚を化学的に処理するには、96ウェルプレートから各化学希釈液の100マイクロリットルを胚のそれぞれのウェルに移し、ペーパータオルで湿ったチャンバーを作成し、それを感光性容器に入れます。

96ウェルプレートを保持するのに十分な大きさ。次に、天井マットを使用してプレートを密封します。感光性容器に入れ、摂氏28.5度で所望の時間インキュベー

化学物質を除去するには、薬物処理ウェルの各列に300マイクロリットルのEスリーを追加します。次に、Eスリーを使用して胚を3回洗浄して胚を固定する前に培地を引き出し、それらを4つのラベル付き24ウェルプレートに移し、ピペットを暗い背景の前に置きます。各ウェル移し替え後、ピペットに残っている胚を特定し、クロスオーバーを防ぐために、死んだ胚を取り出します。

胚がかろうじて液体に沈むようにE3を引き抜きます。次に、ガラスピペットを使用して、それぞれに50ミリグラム/ミリグラムのプロナーゼを2滴加えます。胚を5分間インキュベートしてから、ウェルを攪拌してコーリアンをバラバラにします。

E 3を使用して胚を2回洗浄した後、残りのE 3を引き抜いて廃棄します。各ウェルに4%P-F-A-P-B-Sを加え、胚を摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、ホールマウントin situハイブリダイゼーションなどの関心のあるスクリーニングを実行するか、またはテキストプロトコルに概説されているように、化学スクリーニングから胚をスコアリングします。

この図に示すように、実体顕微鏡を使用して観察する前に、標識された12ウェルプレートに移します。1人の人間が9週間の献身的な努力で約600の化合物に対して化学的遺伝子スクリーニングを行うことは実用的であり、3人で実施すればその時間を3週間に短縮することができます。したがって、1人または数人のベンチタイムで、自動化システムのようなリソースを大量に消費する機器の必要性を回避できます。

ここに示すように、ゼブラフィッシュの胚を、50%の人から24 HPFまでの生理活性ライブラリーからの個々の化合物にさらし、その後、3つのリボプローブのカクテルを使用してネフロンセグメントを検出し、希望ごとにアッセイしました。例として、グレーディングシステムである化合物は、近位回路尿細管またはPCTが劇的に拡大した結果をクラス1として分類され、これは最も深刻な欠陥に関連するクラスと観察された表現型に対する最高レベルの信頼性を表します。その後、化合物にはクラス1のPCTとして注釈が付けられます。

さらに、この分類は、生物への影響の重症度、薬物の影響を受ける領域、および領域が影響を受ける方法など、関心のある小分子を簡単かつ迅速に説明する方法を提供します。この手順を試みるときは、胚を正しい発生時点でステージングすることを忘れないことが重要です。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚を用いて手動化学スクリーニングを行う方法について十分に理解できるはずです。