プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

この手順の全体的な目標は、細胞培養中の個別のプラークをカウントすることにより、感染性バリアンの定量化を通じてウイルス濃度を決定することです。これは、最初に細胞をプレーティングして感染用のコンフルエント単層を形成することによって達成されます。2番目のステップは、定量する未知のウイルスサンプルの段階希釈を行うことです。

次に、ウイルスストックの段階希釈を使用してコンフルエント単分子膜に感染させ、続いて固定化オーバーレイを適用します。最後のステップは、目立たないプラークを数えるために、問題のウイルスの適切なインキュベーション時間後にプラークを固定して染色することです。最終的に、プラークアッセイは、未知のウイルスサンプルのウイルス力価を決定するために、さまざまな方法で使用および変更することができます。

この手法が半固体オーバーレイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、ハイスループットと従来のアプリケーションの両方で、塗布と除去がはるかに簡単であることです。また、試薬の加熱も必要ありません。この技術の意味するところは、液体オーバーレイの使用など、さまざまな溶解性ウイルスの研究にまで及びます。

96ウェルフォーマットでは、新しい治療用化合物の迅速なスクリーニングが可能になり、従来のプラークアッセイを行う研究室で費やされる長い時間を大幅に減らすことができますアッセイプレートの前日に、感染の日に90〜100%coの流暢さを達成するために問題のウイルスに適した細胞。ストック溶液は、アッセイの前日に調製することもでき、最初に蒸留水に10%ホルムアルデヒドの固定溶液を調製し、5.56ミリリットルの36%ストックホルムアルデヒドと14.44ミリリットルの蒸留水を混合します。次に、蒸留水で希釈した20%エタノール中の1%クリスタルバイオレットからなるクリスタルバイオレットステインを準備します。

次に、無菌条件下で作業しながら、使用する細胞の種類に適した2×プラーク培地を調製します。試薬のいずれかが滅菌されていない場合は、0.2ミクロンのフィルターで溶液をろ過します。攪拌棒で急速に混合されている蒸留水の97.6ミリリットルを含むフラスコに2.4グラムのavy細胞でプラークアッセイで使用するための液体オーバーレイを調製する。

攪拌子に対して粘性が高すぎるまで、溶液を室温で混合します。この時点で、フラスコをフラスコシェーカーに移し、30分間激しく攪拌して均質化を確保します。最後に、溶液を摂氏121度、14PSIで30分間オートクレーブします。

そして、プログラムが終了したら、arosオーバーレイのために室温で密封して保管してください。蒸留水に0.6%アグロストック溶液を調製します。攪拌子とオートクレーブで混合して、溶液またはカルボキシメチルセルロースオーバーレイに持ち込みます。

蒸留水に2%カルボキシメチルセルロース溶液を調製し、めっき前日と同様にオートクレーブよりも混合します。アッセイを開始する前に、倒立顕微鏡を使用して細胞の同時流暢さと生存率を確認してください。細胞が標準的な細胞形態と約90%coの流暢さを示すことを確認します。

細胞増殖培地中の感染性サンプルを10倍段階希釈し、問題のウイルスの予想される力価に基づいて必要な希釈回数を変化させます。また、細胞の生存率を独立して確保し、プラークの同定を支援するために、感染していないコントロールサンプルを調製します。未感染のコントロールと段階希釈をプレートのウェルにピペットで移し、単層が破壊されないように注意します。

細胞を覆うのに十分な量の接種物を使用し、その量をできるだけ低く保ちながら、単分子膜とのウイルス接触を最大化します。プレートを組織培養インキュベーターに入れ、20分ごとに45分から1時間細胞に感染させます。プレートを静かに揺らして、均一なカバレッジを確保し、感染中に細胞単層が乾燥するのを防ぎます。

液体オーバーレイ用のオーバーレイ作業溶液を準備します。温めたプラーク培地と1.2〜2.4%室温のストックエイビーセルを1対1の比率で混合して、0.6〜1.2%のセルオーバーレイ培地またはAROSまたはCMCオーバーレイの作業溶液、または混合温めたプラーク培地、および0.6%AROSまたは2%CMCのストック溶液を1対1の比率で混合します。次に、摂氏56度の水浴に30分間入れて温度平衡化します。

溶液が温かく、触ると熱くならないことを確認して、細胞死を防ぎ、ウイルス力価を低下させます。感染後、オーバーレイを添加した後、感染した単層にオーバーレイを適用します 分析対象のウイルスに応じて、摂氏37度と二酸化炭素5%でプレートをインキュベートし、液体オーバーレイで細胞を固定し、eセルオーバーレイを注ぎ込むか吸引し、10%ホルムアルデヒド溶液をウェルにピペットで固定し、室温で30分間一晩またはアロスまたはCMCに直接固定します。固定後、室温で1時間から一晩、ホルムアルデヒド溶液をオーバーレイに加え、ホルムアルデヒドを廃棄し、ヘラでアロする半固体プラグを手動で取り外します。

染色前に、アビー細胞プラークを水で洗い流し、残留オーバーレイ固定液を除去します。染色するには、細胞を最小限の結晶紫色溶液で約15分間覆います。必要に応じてプレートを揺り動かして、均一なカバレッジを確保します。

クリスタルバイオレットの汚れを水でやさしく洗い流し、固定し、染色して乾燥させたプレックスを無期限に保管して、将来の分析に備えます。各井戸のプラークを数え、プラークが5つ未満または100を超える井戸を割り引いてカウントします。同じ希釈の技術的な反復の平均を取ります。

プラークのサイズと形態に注意してください。希釈のためのプラークの平均数と総希釈係数の逆数を取ることにより、ストックサンプルのウイルス力価を決定します。この画像は、12ウェルプレートを使用したリフトバレー熱ウイルスプラークオーバーレイの比較を示していますビューローは、12ウェルプレートの5番目の細胞の2.5倍でプレーティングされ、MP 12の同じ段階希釈開始サンプルを使用して200マイクロリットルに感染しました。

感染後、0.3%と0.6%AVYの1.5ミリリットルのオーバーレイ、または1%CMCを適用して、オーバーレイを直接比較しました。このヒストグラムは、3 つのオーバーレイすべてのプラーク数と滴定の結果を示しています。ここは。12ウェルプレートを使用したViiVプラークオーバーレイの比較が示されています ビューローは以前と同様にプレーティングされ、感染後にViiV TC 83ワクチン株の同じ段階希釈開始サンプルを使用して200マイクロリットルの容量で感染し、0.3%または0.6%avy細胞または1%CMCの1.5ミリリットルオーバーレイが以前と同様に適用されました。

ここでも、ヒストグラムは、3つのオーバーレイすべてのプラークカウントと力価の結果を示しています。この画像は、高スループットのプラークオーバーレイの例を示しています。ウェルあたり4番目の細胞の10を3倍に播種したVIRの96ウェルプレートを、リフトバレー熱ウイルスMP12の同じ段階希釈開始サンプルを使用して50マイクロリットルの接種物に50マイクロリットルを感染させ、オーバーレイ0.6および1.2%のエイビーセルの最終濃度を4倍で1時間使用しました。

このヒストグラムは、各オーバーレイから決定された力価を示しています。この手順を試みる際には、すべてのウイルスが異なり、異なる細胞タイプ、インキュベーション時間、増殖培地の利用などの最適化が必要になる場合があることを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、液体オーバーレイと半固体オーバーレイの両方を利用した基本的なプラークアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。