Name: エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶ EPA法1615による環境水・飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスの標準サンプリング手法。電気陽性フィルターを用いたウイルス濃縮と無菌採取技術を習得し、水質モニタリングの精度を向上させる。

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著者らは、その貢献ICRとの間に実施モニタリングを行った数々のEPAの担当者に感謝可能UCMR3、報告されている他のEPA研究の次のリード研究者：ダニエルDahling、アルフレッドデュフール、アンドレイエゴーロフ、スーザンGlassmeyer、ASJA Korajkic、リチャード·リーバーマン、ロバートSafferman、とティム·ウェイド。批判的にこの原稿をレビューするとシャノングリフィンとマイケル·ウェア。著者は、サンプル収集を実証するため、それらのポンプの家の1つの使用のためにインドのヒル水道に感謝。この作品は、USEPAによって審査と出版が承認されましたが、それは必ずしも公式代理店の方針を反映していない場合があります。商標名や商用製品に関する記述は、使用のために承認または推奨するものではありません。

1.予備手続き<ol><li>補足資料に記載されているように、吸気モジュール、カートリッジハウジングモジュールと、放出モジュールからなる、図1に示すように、標準的なフィルター装置を組み立てる。 </li><li>最初の使用の前にサンプリングに使用流量での流量計/積算を校正。最初の使用後にキャリブレーションをチェックし、その後、使用の1ヶ月後。流量校正がどちら最初の使用後、または使用の最初の月の後に変更された場合は補足資料に記載されているように、キャリブレーションチェックの頻度を決定する。 <ol><li>吸気モジュールに放電モジュールを接続し、タップに吸気モジュールを接続します。流量を読み取るための流量計/積算を設定する。完全にタップをオンにして、その後ブロンズグローブバルブを使用して、10リットル/分の流量を調整。流量は10L /分で安定したら、総体積を読み取るために流量計/積算をリセットする。 </li><li>外を配置4 Lに放電モジュールのみましょうか、大きなメスシリンダーと同時にゼロに積算をリセットします。 4-Lマークにおける積算読み取り及びシリンダーに4 Lマークに到達するのに必要な時間を測定する。率を流れるように戻って設定流量計/積算を変更します。 注：流量が9.95以下にLに低下したか、ステップ1.2.2を完了した後に、複数10.05 Lまで増加した場合には、流量が安定しており、繰り返しステップ1.2.2になるまで待ちます。正しく調整メーターは4.0±0.04 Lの積算読書で24±1秒でメスシリンダーに4 Lマークに到達します</li><li>積算読み取り値が3.96未満または以上4.04 Lである場合に、観察された差を調整するために必要な補正係数を算出する。流量計/積算がメスシリンダー上の4 Lの時点で3.9 Lを読み取る場合、補正係数は1.026（3.9÷4）である。フィールドサンプルの所望の体積が300 Lであった場合にこのように、ボリュームは、rに従って収集流量計/積算上のeadingはあるべき300÷1.026 = 292.4 L. </li></ol></li><li>標準のフィルター装置を殺菌し、サンプル収集の準備をします。 <ol><li>いずれかの完全に溶液中にモジュールを浸漬することにより、またはモジュールは、ポンプを使用しても次亜塩素酸ナトリウムを循環させることにより、各使用前に少なくとも30分間、0.525パーセントの次亜塩素酸ナトリウム摂取量とカートリッジハウジングモジュールを滅菌する。無菌のdH 2 Oでモジュールをすすぎ、次いで5分間滅菌試薬グレード水1リットル当たり1 Mチオ硫酸ナトリウムを50 mlを含む溶液中で脱塩素。装置モジュールが無菌アルミ箔で終わるフィルタのサンプリングをカバーする。 </li><li>カートリッジハウジングモジュール無菌的に電気陽性カートリッジフィルターを追加します。 注：カートリッジフィルターが正しくハウジングに装着されていることを確実にするために注意してください。正しく固定フィルタは漏れないと振とう時フィルタは、ハウジング内に移動しません。 APのガスケットroperly座っフィルタはどこにフィルタの連絡先にそれらを示して見えるくぼみを持つことになります。ガスケットは常にフィルターをハウジングから削除された直後にくぼみをチェックする必要があります。 </li><li>サンプルデータシート上のユニークなサンプル数を記録（例えば補足資料を参照）、次に取るか、またはサンプルに関し必要な指示と一緒に、フィルターサンプリング装置とフィールド試料を採取される個々のサンプルデータシートを出荷コレクション（ 例えば 、サンプル量、サンプル位置など ）。 </li></ol></li></ol>サンプリングサイトで試料の収集2.準備<ol><li>コレクションサイトで到着時に手を洗うとサンプル汚染の可能性を最小限に抑えるために手術用手袋を着用。腸や呼吸器症状を経験した場合のサンプルを収集することはありません。頻繁に手袋を変更し、特に水タップと続き可能性のある他のアイテムに触れた後、アミノ化。 </li><li>サンプルデータシートに追跡情報を記録し、関連するサンプル。関連情報は、サイトやサンプル識別、サンプラーの名、および機器のモデルとシリアル番号が含まれています。 </li><li>行に定住したすべての破片をクリアするために2〜3分間蛇口をオンにします。必要であれば、このステップの間に、ドレインに到達するために庭のホースまたは管を使用。 </li><li>サンプリング装置モジュールが接続されている場合は、それらを切断し、滅菌ホイルでカートリッジハウジングモジュールの開放端を保護する。吸気モジュールに放電モジュールを接続し、水道の蛇口の両方に接続します。放電モジュールの端に庭のホースを接続し、1Lのポリプロピレン製容器に自由端を置く。 </li><li>タップの電源をオンにし、装置を介してサンプリングされる水の少なくとも75のLを渡す。 <ol><li>ポリプロピレン容器 - 塩素残油に流れ込む水の上にフラッシュ期間中の水質パラメータを測定し、記録するUAL、pH、温度、濁度。 </li><li>水道の水を切った後は、吸気モジュールから放出モジュールを外してから、カートリッジハウジングモジュールの出口に吸気モジュールの出口と排出モジュールにカートリッジハウジングモジュールを接続する。ゼロに読んで積算をリセットします。 </li></ol></li></ol> 3.フィールドのサンプル採取<ol><li>日時とともに初期積算読書を記録した後、ゆっくりと水栓を開きます。 <ol><li>カートリッジハウジングが直立位置にあることを、それが完全に水で満たされていることを確認。いくつかのハウジングは、充填プロセス中にハウジングから空気を排出するために押すことができるベントボタンを持っている。 </li><li>完全にタップを開きます。ブロンズグローブバルブを用いて10リットル/分の流量を調整した後、初期流量を記録する。 </li></ol></li><li>使用して装置を通って地下水の1800 Lの表面水または1500の300 Lを渡す積算測定値（調整後、必要に応じて）。必要なボリューム前フィルタの目詰まりに到達し、半分以上のボリュームが収集された場合には、利用可能な場合、残りのサンプルを収集するための第二フィルターハウジングモジュールを使用する。 </li><li>サンプル量がサンプリング期間の終わりに近づくにつれて流量を観察して、サンプルタップの水の流れをオフ。最終流量が、日付、時刻、最終積算読み取り、総サンプル体積を記録する。 </li><li>タップからフィルタサンプリング装置を外します。他のモジュールからのカートリッジハウジングモジュールを外します。 <ol><li>逆さフィルタハウジング（s）をオンにし、過剰な水の両方の入口および出口ポートから排出されますそれ以上の水まで流出することを可能にする。 </li><li>直立ハウジングを回して、無菌アルミ箔で各端にクイックコネクトをカバーしています。一つ以上の密封可能なビニール袋にハウジングを置きます。 </li><li>摂取量とdから水を抜くischargeモジュール。一つ以上の密封可能なビニール袋にモジュールを配置します。 </li></ol></li></ol>フィールドサンプルの4出荷<ol><li>絶縁された貯蔵および輸送クーラーにフィルタサンプリング装置モジュールを置きます。 </li><li>サンプルが輸送中に1-10℃の間に残ることを保証するために貯蔵及び輸送クーラーに凍結したアイスパックまたは二重袋詰め氷を追加します。二つの大きなまたは6-8小さな氷のパックは十分なはずです。 </li><li>アイスパックや氷の袋に接触することなく、場所に絶縁された貯蔵および輸送胸に、温度記録装置を配置します。 注：分析実験室ですぐに到着時にカートリッジハウジングと容器の開口部の温度を測定する視覚的な赤外線温度計を使用する場合は、温度記録装置はオプションである。 </li><li>梱包材にボイドスペースを記入し、その後T ON、密封可能なビニール袋に入れて保護されたサンプルのデータシートを配置オペアンプ。それは水の漏れを防止するための絶縁貯蔵および輸送の胸やテープを閉じる。 </li><li>トランスポートまたは分析実験室にサンプルを出荷する。サンプルは、フィールドサンプル収集（ すなわち 、ステップ3.1で記録された時間）の開始後遅くとも24時間よりも分析実験室に到着しないことを確認してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

環境水からウイルスを濃縮するための異なるフィルタタイプは、年26にわたって使用されてきた。現在の方法は、限外濾過膜27、電気陰性フィルタ13,28,29、ガラスウールフィルター23、及び電気陽性フィルタ30を使用する。電気陰性フィルタは長年広く使用されたが、塩の添加前又はサンプリング中にフィールド内の水のpHを調整するための要件は、その有用性を制限する13。フィールドサンプリングのための最も実用的なフィルタの選択は電気陽性フィルターです。これらのフィルタは、高流量で、水の任意の調節なしに大量の水のサンプリングを可能にする。グラスウールフィルタは最も安価であるが、陽性のフィルタよりも遅い流速を有しており、市販されていない。限外濾過は、水質の広い範囲にわたって最高のウイルス回収率を提供するが、装置はsampliために必要ngは、容易に携帯用フィールドれず、サンプルを収集するのに必要な時間は、27ずっと長い。方法は、最近使用現場での調整の必要性を回避するために、電気陰性のフィルタを予め調整することを開発されてきたが、これらは大量の試料28,29を収集するため適用できないかもしれない。 EPAメソッド1615は、酸化アルミニウムナノ繊維または第四級アミンのいずれかからの正電荷を得る陽性カートリッジフィルターを使用する。後者は前者の上の利点は、安価で効率的に自然なpH値30,31の広い範囲の海域からウイルスを収集することである。しかし、各カートリッジのほか、Borchardtらによって使用されるグラスウールフィルターは水23,31,32（Cashdollar、未発表データ）からのエンテロウイルスとノロウイルスの類似の回復を与える。カートリッジフィルターは、サンプルの収集を簡単にするために設計された単純なサンプリング装置内に配置されるとサンプリング中に汚染を減少させる。 大規模研究が複数の分析ラボを使用して実施された場合の標準的な方法は非常に貴重である。 EPAメソッド1615はサンプル収集中または不十分な消毒装置の構成部品からの汚染に起因するこれらの研究 - 偽陽性の結果、およびコンポーネントによってフィルター孔の目詰まりの間に収集されたデータに影響を与えることができる2つの主要なサンプル収集の問題を最小限に抑えるために、標準的な手順とガイダンスを提供しています水がサンプリングされる。 腸内ウイルスが不十分な衛生状態に人から人への普及することができるのと同様に、ウイルスは、汚染された手袋33で不十分洗浄し、手や手からのサンプルに導入することができる。これは、サンプラーは、汚染の可能性のある経路を理解し、サンプリング中に無菌技術を使用することが不可欠である。サンプラーは、手袋は、主にページへの暴露からサンプラーを保護するために使用されていないことを理解すべきである汚染からの装置をrotect。サンプリングと介護の開始が汚染を手袋に手を防ぐために、手袋の着用時に注意が必要前には手を洗浄する必要があります。彼らは、高いレベルでのエンテロウイルスまたはノロウイルスを流してできたように胃腸炎や呼吸器症状とのサンプラーは、サンプルを収集してはならない。 第二に、注意が前回のサンプリングイベントからウイルスのキャリーオーバーを防ぐために注意する必要があります。汚染のこの潜在的な源を最小にするために、方法1615でのサンプリング装置は、入口とカートリッジハウジングモジュールとの間の圧力調整器及び圧力計を含まないことによってICRのものから変更された。イベントをサンプリング中に観察された圧力は常に最大の住宅評価（5インチカートリッジハウジング用など 、125 PSI）を下回っていたので、彼らは消毒が困難であったため、これらのコンポーネントは削除されました。後者の問題は、STで機器ブランク対照を使用することにより実証されたICR 6,20に続くudies。それはICRデータに影響を与えた程度は不明であるが、可能性が小さかった。つだけ偽陽性陰性の性能評価サンプルが研究中に存在した（データは示さず）。さらに、キャリーオーバー汚染の可能性を低減するために、それはまた、入口モジュールチューブが各サンプリング事象後に交換することが推奨される。これは、装置は、ウイルスを接種した品質または性能制御のために使用された場合、適切な消毒を確実にするために特に重要である。殺菌を実行する前に、遊離塩素の濃度は、貯蔵中の任意の損失を測定すべきである。上述の装置の構成の変化に加えて、定期的な装置のブランクは消毒が有効であることを実証するために実行されることが不可欠である。方法1615機器ブランクウイルスシードの制御に使用された後に消毒された装置を用いて行うことが義務付け、それによって簡素前消毒に装置を通ってウイルスシードソリューションをパスする必要がなくなるので、手続き。この濃度は、機器上の任意の実行可能なウイルスを不活性化し、核酸を分解することの両方を必要とされる消毒剤の濃度は、方法1615のための0.525パーセントの次亜塩素酸に増加した。そのため、機器のブランクは、細胞培養および定量PCRアッセイの両方を使用して分析する必要があります。 電気陽性のフィルタのどちらのタイプは、 表1に報告された研究の間に、目詰まりの対象となった。減少したボリュームの試料の未知の数はそのような積算の誤読または別のを満たすために、サンプリングの意図的な早期の停止として、サンプリングによるエラーのためにあったかもしれない特に20 NTU未満の濁度測定値との水域の締め切り、。目詰まりの度合いは、両方のフィルタタイプ及び水質パラメータに依存している。プレフィルタは、改善のいくつかの尺度を提供するが、使用される場合、処理され、分析されるべきである別途電気陽性フィルタから。 UCMR3ための現在の推奨は、試料は、少なくとも半分のボリュームが最初のフィルターを用いて収集することができる場合、2つの酸化アルミニウムナノ繊維ベースのフィルタを使用して、プレフィルターすることなく収集することができるということである。

人間の腸内ウイルスは、消化管内で複製し、糞口経路を通じて広がっている。これらのウイルスは、多くの場合、高濃度1-3に下水に記載されています。彼らは、下水の排水4,5に固執し、表面6,7、地面8-10で、かつ11水を飲んで治療することができます。存在する場合、米国の環境水中のウイルスの濃度は、典型的には直接測定12,13には低すぎる。これはウイルスが大量の水から濃縮されている必要があります。情報収集ルール（ICR）は、米国環境保護庁（USEPA）14が行ったモニタリング中に、感染単位の19.7最確数に全国の0.009の範囲であった大型のユーティリティのソース水中での陽性検体のウイルス濃度（MPN）/ L.陽性サンプルの中央値と平均濃度は、流れストリームからのソース水用0.01 0.03 0.17 MPN / Lであった湖沼や貯水池からのそれらのための0.07 MPN / L、及び地下11（2000年4月25日付けのICR AUX1 18月のAccessデータベースからデータ）を用いてそれらのための0.04から0.74 MPN / Lである。国の地下水のUSEPA研究から陽性サンプルのウイルス濃度は中央値0.13と0.29感染単位/ L 8の平均濃度で0.009から2.12感染単位/ Lの範囲であった。正の地下水試料中のウイルスの濃度は、流動流中のものよりも高かった。これらの研究における地下水を使用して施設の大半は、カルスト領域に位置する帯水層から水を得た。これらには、石灰石と結晶に所在する（破断岩盤）とともに設定が他の設定8,15,16よりも高いウイルス濃度を有する可能性がある。 USEPAウイルス法は、地表水の200 L 300 Lへ（ICR）（1615年法）と地下水17,18の千L 1500 Lへ（ICR）（1615年法）のサンプリングボリュームを指定。しかし、用いて大量の試料は、ほとんどの表面と地下水試料は、ウイルス8,11,19,20について陰性である。 地表水に存在するウイルスは、飲料水の消費者への潜在的な健康リスクをもたらす。表面水処理ルールは、少なくとも4対数によりウイルス濃度を減少させるために、表面の水を使用して、すべての処理プラントを必要とする。でも、4-logの減少で、0.0044 MPN / Lと小さい源水で感染性ウイルス濃度は、平均曝露と治療条件やロタウイルス11,21の用量応答パラメータを仮定して一日あたり1感染につながる可能性があります。未治療の地下水でウイルスからのリスクとは、治療及びウイルスの発生がないためにさらに大きくなる可能性があります。 Borchardtらは、成人における急性胃腸炎の22％および63％までの小児では5年未満が未処理地下水19を使用して、コミュニティで飲料水中のウイルスが原因である可能性がありと推定している。 USEPA Method 1615はBorchardtの調査結果や同僚19,23にフォローアップの国家として未規制汚染物モニタリング規制の第三の監視サイクル（UCMR3）22時のエンテロウイルスとノロウイルスを検出するために開発されました。 USEPA法は、主に、未処理の地下水を使用して、システム内のウイルスを測定するために設計されたが、他の水の行列タイプが含まれるように、より一般的に書かれた。新しい方法は19,23。ICR 17、Borchardt らの方法に基づいて、分子の手順の追加時に使用される前のウイルス法から多くの成分を保存するハイブリッドで、ノロウイルス24のための追加のプライマーセット。本稿の目的は、サンプリング手順及び収集と出荷中にサンプルの完全性を維持するために必要な手順を記述することである。方法全体の評価はCashdollar ら 25に記載されている。このプロトコルは、単純なフィールドをカバーコレクション5ポンプとプレフィルタが不要であり、調整はpHまたは水中の消毒の存在を必要としない場合の表面と接地水のnがサンプリングされる。より複雑なサンプリング要件はFoutがら、17,18に記載されている。

<table><tbody><tr><td>1-L ポリプロピレン ボトル</td><td>Nalgene</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>アルミ ホイル スクエア</td><td>コール パーマー</td><td>06275-40</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Steris</td><td>Amsco ラボ シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>プチプチ</td><td>U.S. プラスチック</td><td>50776</td><td></td></tr><tr><td>クローザブル バッグ</td><td>Uline</td><td>S-12283</td><td></td></tr><tr><td>クローザブル バッグ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td></td>S31798C</tr><tr><td>業務用アイスパック</td><td>コール・パーマー</td><td>06345-20</td><td></td></tr><tr><td>クール・セーフ・ボックス</td><td>ダイバーシファイド・バイオテック</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ・スポンジ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>メスシリンダー</td><td>コール・パーマー</td><td>06135-90</td><td>4-L 以上</td></tr><tr><td>ハイプ・ワイプ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>14-412-56</td><td></td></tr><tr><td>iButtons温度データロガー</td><td>マキシム</td><td>DS1921G</td><td></td></tr><tr><td>断熱保管および輸送チェスト</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-676-12</td><td></td></tr><tr><td>パッキングテープ</td><td>米国プラスチック</td><td>50083</td><td></td></tr><tr><td>ポータブル塩素比色計IIテストキット</td><td>Hach</td><td>5870062</td><td></td></tr><tr><td>ポータブルpHおよび温度プローブ</td><td>オメガ</td><td>PHH-830</td><td></td></tr>ポータブル<tr><td>濁度計</td><td>オメガ</td><td>TRB-2020-E</td><td></td></tr><tr><td>PTFEスレッドテープ</td><td>コールパーマー</td><td>08270-34</td><td>すべてのネジ接続に使用</td></tr><tr><td>ポンプ、遠心磁気駆動</td><td>コールパーマー</td><td>72010-20</td><td></td></tr><tr><td>リダクションニップル</td><td>コールパーマー</td><td>06349-87</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)</td><td></td><td></td><td>地元で入手可能な家庭用漂白剤を使用</td></tr><tr><td>チオ硫酸ナトリウム (Na2S2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217247</td><td></td></tr><tr><td>手術用手袋</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>防水マーカー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-290546</td><td></td></tr><tr><td>媒体</td><td>組成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.525% 次亜塩素酸ナトリウム (NaClO)</td><td>家庭用漂白剤をdH2Oで1:10に希釈することにより、0.525%NaClO溶液を調製します。0.525% NaClO溶液を室温で最大1週間保存してください。</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1 M チオ硫酸ナトリウム (Na2S2O3) pentahydrate</td><td>248.2 g の Na2S2O3 を dH2O.&nbsp;チオ硫酸ナトリウムは室温で最大6か月間保存します。</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

エンテロウイルスと文化およびrt-qpcrによる水中のノロウイルス発生のepaメソッド1615測定。ウイルスサンプルのi.コレクション

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中のエンテロウイルスやノロウイルスを測定するための標準的な方法を提供することを目標に開発されました。この方法の標準化されたサンプリング成分は、電気陽性カートリッジフィルターを通る最小指定量の水の通過によって、水中に存在する可能性のあるウイルスを濃縮します。地表水と完成水/地下水の最小指定容量は、それぞれ300 Lと1,500 Lです。主な分析法の制限は、サンプル量の要件を満たす前にフィルターが詰まる傾向があることです。2つの異なる(しかし同等の)カートリッジフィルターオプションを使用した研究では、フィルターの目詰まりが、一方のフィルタータイプのサンプルで10%の問題であったのに対し、もう一方のフィルタータイプでは6%であったことが示されました。目詰まりは濁度とともに増加する傾向にありますが、濁度測定だけでは予測できません。コストの観点からは、フィルターオプションの1つが他のオプションよりも望ましいですが、フィルターを選択する際には、サンプリングする水質と水システムの経験を考慮に入れる必要があります。

フィルタの目詰まりが詰まり、フィルタを通る水の流量を減少させる方法1615で発生することができる主要な潜在的な問題である。場合によっては、これは、より大きな流れを可能にするグローブバルブを開くことによって克服することができる。必要な体積が通過した前に、他の例では、フィルタが完全に目詰まりします。 表1は、フィルタの種類、水の種類、及び濁度の関数として減少する容積を有するサンプルの割合を示す。詰まりが逆地表水試料の場合とながら地下水試料について、第四級アミンベースのフィルタを上回る酸化アルミニウムナノ繊維ベースのフィルタと、地下水及び表面の両方水試料で発生した。酸化アルミニウムナノ繊維ベースのフィルタに収集されたサンプルの10％が目詰まりするのに必要な最小限の指定されたボリュームを満たすことができなかった一方、全体的な、第四級アミンベースのフィルタを使用して収集されたサンプルの6％は、体積が欠損していた。属で詰まりlは、濁度を増加したが、異なる構成要素の数が濁度に寄与し、これらのいくつかは、目詰まりを生じない。例えば、ICRの試験中に発生するすべての詰まり事象の43％が（データは示していない）は、2つの河川系に限られていた。 ICRの間に地表水の最小ターゲット·ボリュームは研究中に収集された平均体積は208 L（2000年4月25日付けのICR AUX1 18月のAccessデータベースからのデータ）の中央値の体積とL 217±32だった200 L.だった。したがって、完全なボリュームは、高濁度と多くの水から採取することができる。 濁度が75 NTUを超えていたときICRは、プレフィルターを使用するためにサンプラーを必要としたが、さらにプレフィルターで、75以上の濁りと海域で採取したサンプルの34％がNTU詰まっ。方法1615は50 NTU以上の海域とのプレフィルターの使用をお勧めします。しかし、この方法1615の出版以来、方法に記載されていることに加えて、いくつかの異なるプレフィルタオプションはされているテストした。これらはいずれも、試料容量（データは示さず）において有意な改善をもたらしていない。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52067/52067fig1.jpg"> 図1.標準的なフィルタ装置。標準フィルタ装置は、吸気、フィルターハウジング、及び排出モジュール（各モジュールの説明については、補足資料を参照）で構成されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52067/52067fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 総サンプル A </td><td> 欠損サンプル B の数 </td><td> パーセント欠損サンプル </td><td> 濁度（NTU） </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> NanoCeramを使用した地下水フィルタC </td></tr><tr><td> 113 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center">地表水NanoCeramフィルターCを使用して</td></tr><tr><td> 83 </td><td> 12 </td><td> 14 </td><td> &lt;20 D </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 20 - &lt;50 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 83 </td><td> ≥50 D </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="230px" style="text-align:center">総NanoCeram C </td></tr><tr><td> 210 </td><td> 22 </td><td> 10 </td><td> ≥0 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> 1MDSフィルタc を用いて地下水</td></tr><tr><td> 374 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr>1MDSフィルタc を用いてセンター"&gt;表面水：EXT-整列</tr><tr><td> 269​​3 </td><td> 27 </td><td> 1 E </td><td> &lt;20 E </td></tr><tr><td> 505 </td><td> 36 </td><td> 7 F </td><td> 20 - &lt;50 F </td></tr><tr><td> 122 </td><td> 19 </td><td> 16 E </td><td> 50 - &lt;75 グラム </td></tr><tr><td> 175 </td><td> 60 </td><td> 34 E、F </td><td> ≥75 E、F、G </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="240px" style="text-align:center">総1MDS C </td></tr><tr><td> 3869 </td><td> 217 </td><td> 6 </td><td> ≥0 </td></tr></tbody></table> 表1.フィルタの容量サンプルは、使用可能なボリュームと濁度データから以下の研究から、次のとおりです。1）USEPAのICRスタディ（4/2付けのICR AUX1 18月のAccessデータベースからのデータ2000分の5）、2）USEPA地下水調査8、3）USEPAローレンスとローウェル、マサチューセッツ州の研究（未発表データ）、4）USEPAミシシッピ川の研究（未発表データ）、5）USEPA飲用水処理プラントの研究（未発表データ）、 6）USEPAメソッド1615評価調査25、および7）は、各研究のために指定された水の最小容量の前に目詰まりしたフィルターが収集されたUCMR3監視の最初の3ヶ月（未発表データ）。Bサンプル。これは地表水と地下水のために1500 L、200 Lだったが、USEPA ICRとUSEPAの地下水研究のための1893 Lの下に地下たソース水200 Lであった。完全な最低限指定されたボリュームを収集する機能が有意に異なるされているCサンプルは、マン·ホイットニー順位和検定を使用してNanoCeramと1MDSフィルタ（P = 0.002）を使用し、地表水と地下水の両方全体的な（P &lt;0.001）との間で、各フィルタタイプ（P &lt;0.001）のために収集。D＆＃8211、同じ上付き値を持つGグループ（P &lt;0.05）順位検定で分散のクラスカル·ワリスOneウェイ分析とダンのペアワイズ多重比較手順に従って著しく異なっている。全ての統計的検定のために、従属変数はなく、1.0の最大値、最小値、指定されたボリュームの割合としてフィルタを通過体積である。

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを濃縮するために、電気陽性フィルターを使用します。この原稿では、メソッド 1615 分析用のサンプルを収集する手順について説明します。

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

この手順の全体的な目標は、EPA メソッド 1615 に基づいて、腸内ウイルスの発生について環境水と飲料水をサンプリングするための標準化されたアプローチを提供することです。これは、最初にサンプリング装置を組み立て、装置のインテークモジュールとカートリッジハウジングモジュールを滅菌し、次に滅菌エレクトロポジティブカートリッジフィルターを無菌的に追加することによって達成されます。次に、規定量の水をサンプリング装置に含まれる電気陽性フィルターに通します。その後、余分な水は装置とカートリッジフィルターハウジングから排出され、サンプリングされた量はサンプルデータシートに記録されます。最後に、サンプリング装置のコンポーネントは、摂氏1〜10度に保たれたクーラー輸送コンテナに梱包され、分析ラボに配送されます。最終的に、環境水および飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスは、全体的な方法の一部としてこのサンプリング手順を使用して測定されます。この手順では、電気陽性フィルターを使用してウイルス、一部の環境飲料水を濃縮します。この手順を実行するために使用できるフィルターの種類は他にもいくつかあります。1つはウルトラフィルターで、もう1つは負に帯電したフィルターです。エレクトロ・ポージー・フィルターがウルトラ・フィルターよりも優れているのは、サンプリングが約2.5倍速いことだ。負電荷フィルターを使用したウイルスの収集には、塩の添加にpH調整が必要です。フィルターを正に充電する利点は、サンプル収集前に調整する必要がないことです。一般的に、この手順に不慣れな人は、無菌性の維持や、サンプル収集に便利なタップがないなどの予期しない条件に苦労します。今日、手順を実演するのは、私自身、sha out、Jennifer Cash dollar、Eunice VERのギースです。私たちは皆、オハイオ州シンシナティにあるEPAの国立被ばく研究所の専門スタッフです。サンプル収集の準備をするには、テキストプロトコルの補足資料に記載されているように、インテークモジュール、カートリッジハウジングモジュール、および排出モジュールで構成される、ここに示すように標準的なフィルター装置を組み立てます。サンプリングに流量を使用します。流量計トータライザーを初めて使用する前に、排出モジュールを吸気モジュールに接続し、次に吸気モジュールをタップに接続して校正します。蛇口を完全にオンにしてから、ブロンズグローブバルブを使用して流量を毎分10リットルに調整します。流量が毎分10リットルで安定したら、流量計の積算計をリセットして総量を読み取ります。次に、排出モジュールの出口を4リットル以上のメスシリンダーに配置し、同時にトータライザーをゼロにリセットします。4リットルのマークでトータライザーの読み取り値と、シリンダーの4リットルのマークに到達するために必要なタイマーを測定します。トータライザーの読み取り値が3.96リットル未満または4.04リットルを超える場合は、観測された差を調整するために必要な補正係数を計算します。例えば、流量計の積算計がメスシリンダーの4リットルのマークで3.9リットルを読み取る場合、補正係数は1.026または4を3.9で割ったものになります 標準的なフィルター装置を滅菌し、サンプル収集のために準備するには、0.525%次亜塩素酸ナトリウムを使用して、インテークモジュールとカートリッジハウジングモジュールを完全に浸し、少なくとも30分間浸します。または、ポンプを使用して溶液をモジュール内を循環させます。滅菌DH 2 Oを使用してモジュールをすすぎ、滅菌試薬グレードの水1リットルあたり50ミリリットルの1モルチオ硫酸ナトリウムの滅菌溶液を使用して5分間脱塩素します。次に、滅菌アルミホイルを使用してフィルターサンプリング装置を覆います。モジュールは無菌的に終了します。エレクトロポジティブカートリッジフィルターをカートリッジハウジングモジュールに追加し、正しく装着されていることを確認します。ハウジングには、サンプルデータシートに固有のサンプル番号を記録し、その後、フィルターサンプリング装置、サンプルデータシート、およびサンプル収集に関する必要な指示をフィールドサンプルを収集する個人に出荷します収集場所に到着し、手を洗った後、サンプル汚染を最小限に抑えるために手術用手袋を夜明けにします。特に水道の蛇口や汚染されている可能性のあるその他のアイテムに触れた後は、手袋を頻繁に交換してください。次亜塩素酸ナトリウムを含むパッドを使用して、タップを滅菌しますampsamp庭のホースと内側の糸。サンプルデータシートには、サイトとサンプルの識別、サンプラー名、装置モデル、シリアル番号など、関連するサンプル追跡情報を記録します。ガーデンホースを蛇口に取り付けます。ホースの出口を水を安全に排出できる場所に置き、水をオンにします。2〜3分間タップして、ラインに沈殿した破片を取り除きます。排出モジュールを吸気モジュールに接続し、次に両方を給水栓に接続します。ガーデンホースを排出モジュールの端に接続し、自由端を1リットルのプロピレン容器に入れます。次に、蛇口をひねり、サンプリングする水の少なくとも75リットルを装置に通します。フラッシュ期間中、プロピレン容器に流入する水、塩素残留pH、温度、濁度について、以下の水質パラメータを測定し、記録します。蛇口の水を止めた後、排出モジュールを吸気モジュールから外し、カートリッジハウジングモジュールを吸気モジュールの出口に接続し、排出モジュールをカートリッジハウジングモジュールの出口に接続します。次に、トータライザーの読み取り値をゼロにリセットします。フィールドサンプルの収集を開始します。最初のトータライザーの読み取り値を日付と時刻とともに記録し、次にゆっくりと水道の蛇口を開きます。カートリッジ・ハウジングが直立位置にあり、完全に水で満たされていることを確認します。次に、タップを完全に開き、ブロンズグローブバルブを使用して流量を毎分10リットルに調整します 初期流量を記録する前に。トータライザーの読み取り値を使用して、300リットルの地表水または1500〜1800リットルの地下水を装置に通します。サンプル量がサンプリング期間の終わりに近づくと流量を観察し、サンプルタップで水の流れをオフにして、最終流量、日付、時刻、最終トータライザーの読み取り値、および総サンプル量を記録します。フィルターを外すampリング装置をタップから。カートリッジハウジングモジュールを他のモジュールから切り離します。フィルターハウジングを逆さまにして、入口ポートと出口ポートの両方から水が排出されなくなるまで、余分な水が流出するのを待ちます。ハウジングを直立させ、滅菌ホイルを使用して両端のクイックコネクトを覆います。ハウジングを1つ以上の密封可能なビニール袋に入れます。吸気モジュールと排出モジュールから水を排出します。モジュールを1つ以上の密封可能なビニール袋に入れて、サンプルを出荷用に準備します。フィルターサンプリング装置モジュールを断熱された保管および輸送クーラーに入れます。冷凍アイスパックまたは二重袋入りの角氷を保管および輸送クーラーに追加して、サンプルが摂氏1〜10度に保たれるようにします。配送中。隙間を梱包材で埋めてから、サンプルデータシートを密封可能なビニール袋に入れ、梱包材の上に置きます。断熱保管および輸送チェスト輸送を閉じるか、サンプルを分析ラボに発送します。チェストを発送する場合は、漏れを防ぐためにテープで密封してください。サンプルがフィールド収集の開始から24時間以内に分析ラボに到着することを確認してください。フィルターの目詰まりは、水の流量を減少させるため、方法1615で遭遇する可能性のある主要な潜在的な問題です。この表は、フィルターの種類、水の種類、および濁度の関数として、容量が減少したサンプルの割合を示しています。地下水サンプルをろ過する場合、ナノイルミナ繊維を含むフィルターは、第四級アミンベースのフィルターよりも優れた性能を発揮しました。アリーアミンベースのフィルターは、地表水サンプルのろ過に適していました。全体として、四次平均ベースのフィルターを使用して収集されたサンプルの 6% は、量が不足していました。酸化アルミニウムで採取したサンプルの10%は、ナノファイバーベースのフィルターが目詰まりにより必要な最小指定量を満たせませんでした。この手順を試みている間は、無菌状態を維持することを覚えておくことが重要です。これは、全体的な方法の最初の手順にすぎません。この手順に続いて、フィルター溶出、二次濃縮、および全培養ウイルス、アッセイ、分子アッセイなどのアッセイが行われます。これらの後のアッセイは、ウイルスの発生と濃度を実際に測定するために必要です。このビデオを見れば、環境水や飲料水からウイルスサンプルを採取する方法を十分に理解できるはずです。ウイルス性病原体を扱うことは危険な場合があり、この手順を実行するときは常に手袋の使用などの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

環境

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

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ろ過水のサンプルおよび環境DNAの抽出のためのフィルターカートリッジの使用

この論文は、多くの試料を用いた研究において土壌微生物群集構造を決定するために、総脂質と指標脂質の相対存在量の両方を特徴づける微生物の細胞膜から脂質を抽出するための努力と正確さとをバランスさせながらスループットを増加させる方法を記載している。...

多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法

環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA...

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

学ぶ EPA法1615による環境水・飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスの標準サンプリング手法。電気陽性フィルターを用いたウイルス濃縮と無菌採取技術を習得し、水質モニタリングの精度を向上させる。

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

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