培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

この手順の全体的な目標は、培養細胞またはマウス組織から呼吸するミトコンドリアを分離し、細胞の状態の尺度としてそれらの膜電位の強度を評価することです。培養細胞の場合、これは最初にプレーティングを行い、次に細胞を処理することによって達成されます。次に、細胞を均質化し、均質化物を針に通して、細胞からミトコンドリアをさらに放出します。

マウス組織の場合、肝臓をマウスから切除し、次に両方のタイプの出発物質を用いて氷上で均質化します。次に、示差遠心分離を使用して、残りの細胞内容物からミトコンドリアを単離します。ミトコンドリアに膜電位感受性蛍光色素の添加を含む何らかの処理を施した後、TMRE蛍光測定を行い、膜電位の強度を計算します。

最終的に、ミトコンドリア機能とミトコンドリア膜電位の摂動は、蛍光プレートリーダーと組み合わせて膜電位感度蛍光色素を使用して評価することができます カプラーや阻害剤の一般的なミトコンドリアで処理すると、この方法はサイトカイン誘発性アポトーシスとミトコンドリアの機能不全についての洞察を提供することができますが、LS.It は、次のような2つ以上の異なるサンプル間の比較を求める他のシステムにも適用できます健康な動物と病気、または代謝率の異なる2つの異なる種。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。ミトコンドリアの分離手順を学ぶのは難しいです。

これは、従来のメソッドセクションでは見落とされがちなテクニックを実行する際に、多くのニュアンスがあるためです。この手順は、サイトカイン処理プレート、160,000個の細胞をT 1 75フラスコに入れて治療時に約70%の密度をもたらす48時間前にテキストプロトコルに記載されているように、ヒト胚性腎臓細胞を成長させることから開始します。次に、血清は24時間後に培地を吸引し、同量の無血清培地と交換することにより、細胞を飢餓状態にします。

最後に、可溶化したサイトカインを細胞培養培地に直接添加して血清飢餓細胞を処理し、ミトコンドリアの単離を行います。まず、培地を吸引し、付着細胞を15ミリリットルの1 x リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで2回洗浄します。洗浄後、毎回バッファーを吸引し、フラスコをこすり落として、底から付着細胞を取り除きます。

次に、各フラスコに15ミリリットルのXPBSを1つ加え、渦巻き、氷上の個々の15ミリリットルの円錐管に移します。掻き取りが完了したら、遠心分離後にスイングバケットローターを備えた卓上遠心分離機を使用して、チューブを摂氏4度のGの700倍で5分間遠心分離し、上清を吸引して再排します。各ペレットを1ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーに懸濁します。

次に、両方の懸濁液を組み合わせ、ミトコンドリアで均質化するための小さなガラス容器に移し、溶液が最初のラインに到達するまでガラス容器にミトコンドリア分離緩衝液をドリルに取り付けた状態で、氷上で細胞を中速で3回のパスで均質化します。乳棒を溶液に入れるときは、液体の上の乳棒を取り除くのではなく、気泡を取り除くように注意し、連続パスで安定した速度で使用するように注意する必要があります。均質化された溶液を50ミリリットルの円錐管に移します。

次に、18ゲージ、1つの半インチの針を使用して溶液を3ミリリットルの注射器に引き込み、27ゲージの半インチの針で氷上の円錐管に戻します。チューブの内壁に対して溶液を排出するように注意して、その力を細胞膜の破壊に利用してください。シリンジのステップを合計5回繰り返した後、溶液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、スイングバケットローターを使用して卓上遠心分離機でG摂氏4度の600倍で5分間遠心分離します。

この最初の低速スピンの後、ミトコンドリアは上清の中にあり、一部の膜と壊れていない細胞はペレット化されていますが、上清を慎重に取り除き、3本の1.5ミリリットルのチューブに分配します。次に、固定角度ローターで3本のチューブをGの4°Cで5分間遠心分離します。培養細胞のミトコンドリアは白っぽい色に見えます。

各動物から肝臓を切除し、カルシウムやマグネシウムを含まない氷冷したXPBSを1つ置いて、血液を洗い流します。肝臓組織を氷の上の離れた皿に移し、新鮮なかみそりの刃を使用して1分間細かく刻みます。次に、組織と適切な緩衝液を、緩衝液が最初のラインに到達するまで血管に加えます。

乳棒で氷上の組織を手で5回均質化します。乳棒を溶液に入れるときは、液体の上の乳棒を取り除くのではなく、気泡を取り除くように注意し、連続パスで安定した速度で使用するように注意する必要があります。テキストプロトコルで要請されているように、遠心分離と均質化でサンプルの処理を続けます。

新しい上清を各サンプルの最初の上清と組み合わせた後、固定角度ローターでチューブを10,000倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ピペットチップを使用して、またはチューブの側面に押し込むことで、上部の白いふわふわの層を慎重に吸引します。次に、残りの上澄みをそっと注ぎ、蘇生します。

肝臓のミトコンドリアペレットを500マイクロリットルのミトコンドリア分離物に懸濁します。肝臓の緩衝ミトコンドリアは茶色です。反応がセットアップされる直前に、サンプルを氷上にすばやく置きます。

ミトコンドリアを0.5ミリグラム/ミリリットルに希釈します。実験用バッファーによる作業濃縮。テキストプロトコールに記載されている適切な処理を、希釈したミトコンドリアの総量である10分の1でチューブを分離します。

次に、希釈したミトコンドリアを各反応チューブに入れ、各チューブを穏やかに攪拌して適切に混合します。反応をベンチトップで7分間インキュベートします。次に、等量の2マイクロモルテトラエチル、ロッドドミン、エチルエステル、略してTMREをミトコンドリア反応量に加えます。

再び、各チューブを穏やかに攪拌して、適切に混合されるようにします。反応をベンチトップでさらに7分間インキュベートした後、固定角度ローターでG4°Cの10,000倍で5分間遠心分離することによりミトコンドリアをペレット化する。次に、各サンプルの上清量の半分を3 84にロードします。

ウェルプレートは、サンプルの蛍光を読み取り、次に、TNF、α、IL、1ベータ、およびIFNガンマを用いたHEK 2 93 T細胞のテキストプロトコル処理で説明されているように、コントロールと各処理との間の蛍光の倍率差を計算します24〜48時間は、細胞死の進行性をもたらします。細胞生存率は、24時間治療で細胞生存率が約10%減少し、約20%減少することが一貫して実証されているMTTアッセイを使用して評価されました。48時間処理では、同様の濃度で処理した細胞は、48時間で同様の細胞死結果をもたらします。

また、個々のサイトカインによる治療では、生存率の低下は組み合わせ効果によるものであることが明らかになりました。生存率は、3つの別々の実験の平均標準偏差を表しています。各実行が3回で、エラーバーのタイトさがデータの再現性を示しています。

サイトカイン処理細胞から単離されたミトコンドリアの膜電位の減少率は、サイトカイン処理によってミトコンドリアの健康が影響を受けたことを意味し、この手順に続く生存率データを裏付けています。TPの生成、合計、TP、または酸素消費量の評価などの他の方法を形成して、異なるサンプル間でどのようなエネルギーと呼吸の違いがあるかなどの追加の質問を評価できます。このビデオを見れば、無傷の機能的ミトコンドリアを単離する方法と、細胞の状態を反映してその膜電位の強度を評価する方法について十分に理解できるはずです。