Name: 培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶ培養細胞およびマウス組織からミトコンドリアを単離し、TMRE蛍光染料を用いて膜電位を測定する方法。差遠心分離法で機能的なミトコンドリアを精製し、細胞状態の指標となる膜電位強度を定量的に評価できます。

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この研究は、NSF助成金CHE-1229562(VDGM)、イーロン大学の学部研究室、イーロン化学科、イーロン・ルーメン賞(TLおよびTAD)、イーロン・カレッジ・フェロー・プログラム(JAC)、イーロン・カレッジ・オナーズ・プログラム(TAD)によって部分的に支援されました。

すべての動物実験は、健康ガイドラインの国立研究所に適合し、ウェイクフォレスト大学動物実験委員会によって承認された。 SOD1G93A [B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur]マウスモデルの繁殖ペアは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手した。野生型（WT）雌SOD1G93A雄非トランス[B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur] SOD1G93Aマウスおよび実験に使用した非トランスジェニックWT同腹子を生成するために飼育した。 調査のための1.モデル<ol><li>細胞培養<ol><li> 5％CO 2中、37℃でヒト胚性腎細胞（HEK-T293）を10％熱不活性化ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および1％L-グルタミンを補充したDMEM中で細胞を維持する。 </li><li> T75フラスコ中で細胞を増殖し、それらが90％コンフルエンスに到達させる。 </li><li> 5％CO 2中37℃で3〜5分間トリプシン処理（0.25％トリプシン-EDTA）を介して細胞分裂を行ってください</sub&gt;、細胞培地の等量とトリプシンの不活性化、及び4℃で700×gで5分間、細胞を遠心分離する。 </li><li>培地を吸引除去し、培養培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> T75に適切なフラスコまたはプレート7×10 4細胞における種子細胞が治療サイトカインの前に48時間をフラスコ。これは〜処理時の70％の密度を与える必要があります。 </li><li>血清飢餓細胞を24時間後に、メディアを吸引し、無血清培地を同じ体積（DMEM、無菌）で置換することができる。 </li><li> 5 PG /μL、10 ng /μLでの作業濃度で超純水を用いて凍結乾燥粉末からのTNF-α、IL1-β、およびIFN-γを、準備、および10 ng /μLで、それぞれ、ウェルに追加/フラスコ。 </li><li>直接適切なフラスコの細胞培養培地に可溶化されたサイトカインの添加により、血清飢餓細胞を治療する。治療は、個々のサイトカインの全3（「* 3」ともいう）、またはアイドルマスターのカクテルからなった（「0」と呼ばれる）、対照としてリル水。 </li><li>評価と収穫前に24、48または72時間処理した細胞をインキュベートする。 </li></ol></li><li>細胞生存率を評価<ol><li> 1×PBS中の3- 5mg / mlの溶液（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）を作る。 </li><li> 12ウェルプレートは、各ウェルにMTT溶液100μlを追加し、穏やかに均一な分布を保証するために旋回。 </li><li> 5％、37℃で15分〜1時間、CO 2用プレートをインキュベートし、紫色の存在について顕微鏡下でチェックする。紫色のが存在しない場合は、再び旋回し、紫色が観察されるまで細胞は5分間隔でインキュベートすることを可能にする。必要な時間は、各研究者によって決定されるべきである。 </li><li>反復ピペッターを使用して、各ウェルにMTTの溶媒（4mMのHClおよびイソプロパノール中の0.1％NP40）700μlを添加し、5〜10分間室温でプレート（複数可）を揺する、またはすべての紫色は、細胞を左まで。紫色の場合、色は、細胞から出てくる溶剤の追加の200μlのを追加し、旋回し続けない。 </li><li>分析のために、各ウェルから100μlのを取り、96ウェルプレートに配置し、570nmのを使用して、プレートリーダーを630nmの参照波長で読み取り、しかし595nmでの読み取り値は、一貫性のある設定で採取されることもあれば良い。 </li></ol></li><li> ALSの動物モデル<ol><li>すべての動物実験は、健康ガイドラインの国立研究所に適合し、ウェイクフォレスト大学動物実験委員会によって承認された。 SOD1G93A [B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur]マウスモデルの繁殖ペアは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手した。野生型（WT）雌SOD1G93A雄非トランス[B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur] SOD1G93Aマウスおよび実験に使用した非トランスジェニックWT同腹子を生成するために飼育した。 </li><li>変異SOD1 25に対して標準プライマーを用いて遺伝子型判定を行います。 </li></ol></li></ol>ミトコンドリアの2の分離注：それはすぐに作業し、作業中は氷の上のすべてを維持することが重要である。 <ol><li>ミトコンドリアの分離バッファ（MIB）の調製、脊髄分離バッファ（SCのMIB）と実験バッファ（EB） <ol><li>先にMIBとEBのための時間の以下のストック溶液を準備します。 </li><li> H 2 O 70ml中のトリス塩基12.1gを溶解させることにより1 Mトリス/ MOPSを作るpHを7.4に取得するためにドライMOPSを追加します。最後の100ミリリットルにボリュームを調整します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li><li> KH 2 PO 4のK 2 HPO 4の80.2ミリリットルと19.8ミリリットルを混合して1 M Kphosを行います。室温で保管してください。 </li><li> H 2 O 10mlにEGTAを3.8g添加することによって0.2 M EGTA /トリス作る溶解し、〜30〜40ミリリットルまでの1Mトリス/ MOPSを追加します。 50ミリリットル、室温で滅菌フィルターとストアに調整します。 pHが〜6.7になることに注意してください。 </li><li> 10mlをすることにより1 Mグルタミン酸を作るグルタミン酸の1M溶液。フィルター滅菌し、店舗、4℃。 </li><li>リンゴ酸の1M溶液10ミリリットルを行うことで、1 Mマラテを行います。 50 mMまでのトリス/ MOPSを追加します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li><li> 200mMのスクロース、10mMのトリス/ MOPS、pHが7.4、および1mM EGTA /トリスの濃度でMIBを確認します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li><li> 250mMのスクロース、20mMのHEPES-KOH pH7.5の、10のKCl、1.5のMgCl 2、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのDTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度でSCのMIBを作る。 </li><li> 125のKClの濃度でEBを行い、10mMトリス/ MOPS、pH7.4の5mMのグルタミン酸塩、2.5mMのリンゴ酸塩、1 mMのリン酸カリウム、pH7.4で、10mMのEGTA /トリス。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li></ol></li><li>細胞を回収する前に、機器の準備。 <ol><li>小さなガラス容器と均質化乳棒を、滅菌水で3回すすぎ、氷上に置きます。 </li><li>そのような標準的なドリル、セルSCRA、必要に応じてアイテムを収集PERS、1.5ミリリットル、15ミリリットルと50ミリリットルチューブとソリューション。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの単離<ol><li>培養細胞<ol><li>各サンプルタイプのために、細胞の2 T175フラスコを使用しています。 </li><li>細胞であることを確認してください〜90％のコンフルエントと対照実験、またはプレートに使用し、ステップ1.2で上記のように扱う。 </li><li>作業台の上に、吸引メディアとの1X PBS各15mlで2回付着細胞を洗う。 </li><li>緩衝液を吸引し、フラスコの底から接着細胞を除去し、フラスコをこすり。 </li><li>氷の上円錐管と場所を、各フラスコに1×PBSの15ミリリットルを追加スワール、および個々の15​​ミリリットルに転送。 </li><li>スクレイピングは、スイングバケットローターを用いて、卓上遠心分離機を用いて、700×gで、4℃で5分間、遠心管を完了すると。 </li><li>吸引し上清とMIBの1ミリリットルの各ペレットを再懸濁。 </li><li>均質化のための小さなガラス容器に懸濁液および転送の両方を兼ね備えています。 </li><li> MIBを追加容器にバッファが最初の行に到達するまで。 3つのパスのために中程度の速度でドリルに装着乳棒で細胞をホモジナイズする。容器は、液体の上乳棒を削除するには、連続パスで安定した速度を使用しないように、このステップの間に氷の上にあることを確認します。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに均質化されたソリューションを転送します。 </li><li> 18ゲージ1½インチの針を用いて3ミリリットル注射器にソリューションを描画し、27ゲージ1/2インチの針を氷上に戻って円錐管にそれを追放。細胞膜破壊のためにその力を利用するように、管の内壁に対してソリューションを追放するように注意してください。 </li><li> 5回の合計のための注射器の手順を繰り返します。 </li><li>スイングバケットローターを使用して、テーブルトップ遠心機で600×gで、4℃で5分間15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に溶液を移す。 </li><li>注意深く上清を除去し、3 1.5ミリリットルのチューブの間で分配する。 注：Mitocho細胞膜および未破壊細胞をペレット化している間ndriaは、この最初の低速回転後の上清中にある。 </li><li>万XG、5分間、4℃で固定角ローターで遠心管。 </li><li>吸引し上清と100μlのMIBにペレットを組み合わせて、すぐに氷上に置きます。 注：ミトコンドリアは、この高速スピンした後のペレットである。ミトコンドリアは、典型的には、単離後2-3イオン氷〜のためのそれらの膜電位を維持し、MIB中の濃縮ストック溶液として最も安定しているであろう。 </li></ol></li><li>マウス組織からミトコンドリア単離<ol><li> IACUCプロトコルに従って、マウスを麻酔。麻酔を誘導するために5.0％で気化器を設定します。目に近づいたり、綿棒でタップされると動物が足のピンチまたは点滅反射のために反射の欠如によって麻酔をかけていることを確認した。 1.5％と2.0％の間で気化器を保つことによって全体の外科的処置のために麻酔下でマウスを保管してください。 </li><li> EXC氷の中に個別に各動物と場所から肝臓および脊髄冷たい1×PBS ISE - / - すべての血液を洗い流すために。 </li><li>肝臓は、氷上で計量皿に組織を転送し、1分間新鮮カミソリの刃を使用して細かく切る。 </li><li>バッファは最初の行に到達するまで容器に組織し、適切なバッファー（脊髄のために肝臓またはSC MIBのMIB）を追加します。 5パス手で乳棒で組織をホモジナイズする。容器は、液体の上乳棒を削除するには、連続パスで安定した速度を使用しないように、このステップの間に氷の上にあることを確認します。 </li><li>ホモジネートを15 mlチューブをきれいに転送します。 </li><li> 750×gで固定角ローター中で遠心管、4°Cで10分間。 </li><li>きれいなチューブに上清を保存して、氷の上に置きます。 注：細胞膜および未破壊細胞をペレット化しながらミトコンドリアは、この最初の低速回転後の上清中にある。 </li><li>脊髄ペレットを再懸濁ISC MIBのN 500μL。 </li><li>唯一のSC MIBと血管ハーフウェイこの時間を埋める、各3回を再均質化する。 </li><li>新しいチューブに新しいホモジネートを転送します。 </li><li>遠心機750×gで固定角ローターで、4℃、10分間。 </li><li>各サンプルからの最初の上清と、より多くのミトコンドリアが含まれているこれらの新しい上清を、結合します。 </li><li>万XG、5分間、4℃で固定角ローターで遠心管。 </li><li>吸引し上清と500 MIBのμLと50μlのSC MIBの脊髄ペレットに肝臓ペレットを再懸濁し、直ちに氷上に置きます。 注：ミトコンドリアは、この高速スピンした後のペレットである。ミトコンドリアは、典型的には、単離後2-3イオン氷〜のためのそれらの膜電位を維持し、MIB中の濃縮ストック溶液として最も安定しているであろう。 </li><li>溶液中のミトコンドリアの濃度を推定するためのタンパク質濃度のアッセイを行う。指示に従う商業的タンパク質アッセイキット又は類似の方法26を使用するための。ミトコンドリアの典型的な濃度は以下のとおりです。2 T175フラスコの収量〜2 mg / mlの、1マウス肝臓〜3-5 mg / mlの、そして1マウス脊髄〜1-3 mg / mlの。 </li></ol></li></ol></li><li> （製造業者によって提供されたプロトコルから適応）のQuantikine ELISAキットC R＆Dラット/マウスチトクロームを使用してシトクロム cアッセイ。 <ol><li>すぐに反応をセットアップする前に、EBと0.5 mg / mlの作業濃度にミトコンドリアを希釈し、反応（チューブあたりミトコンドリアの一般的に30〜50μl）を1.5 mlチューブに希釈したミトコンドリアを配布。 </li><li>希釈されたミトコンドリアに、全体積の1％で、EBまたはDMSOのいずれかを追加し、7〜10分間、ベンチトップでの反応をインキュベートする。より長い時間枠が必要な場合、これらの反応は、室温で最大30分間安定である。 </li><li>ペレットを10,000×gでの固定角ローターで遠心分離によるミトコンドリア、4℃で5分間、慎重LY上清を分離し、独立した1.5​​ミリリットルのチューブにそれぞれ配置します。 注意：チューブのいずれか後の分析のために-20℃で凍結するか、または直ちに使用することができる。 </li><li>ペレットおよび上清27にシトクロムc の濃度を比較することにより、シトクロムc の放出を決定します。 <ol><li> 1×PBS中0.5％のTx-100との反応の元のボリュームでペレットを可溶化することにより、サンプルを準備します。 </li><li>各サンプルについて、 シトクロム cジュゲートの100μlの（直ボトルから使用）プラス0.5％TX-100μlを添加することによって反応をELISAプレート上に2つのウェル、現在可溶化ペレット用と上清のための1つを準備する1×PBSで100、その後、すべてのペレットまたは上清サンプルの。 </li><li>静かに、カバーを混ぜ、1時間、37℃でインキュベートする20秒間プレートを低く設定（レベル2-4）ボルテックス。 </li><li>次に、機械製造に応じて希釈した洗浄緩衝液でプレートを4回洗浄ER者の説明。ペーパータオル上のウェルをタップして余分な溶液を除去。 </li><li>各ウェルに1 A + B現像液、室温、暗所で20〜30分間静置します：次に、1の150μlを添加する。 </li><li>最後に、各ウェルに50μlの停止溶液を追加し、マイクロプレートリーダーを用いて540nmでの吸光度の読み取りを行う。各反応の上清対ペレット中のシトクロムcの量を比較することによって、 シトクロム c の放出の量を計算する。 </li></ol></li></ol></li></ol>ミトコンドリアの3。評価（DYS）関数<ol><li>反応は、（通常はミトコンドリアの30〜50μlのチューブごとに使用されている）、セットアップEBと0.5 mg / mlの作業濃度にミトコンドリアを希釈し、反応のために1.5ミリリットルチューブ内に配置されます直前。 </li><li>ミトコンドリア治療<ol><li> 50 nMのバリノマイシンと混合FCCP適切な治療法を追加します（EB制御、1μM、10μMロテノン、5μMのオリゴマイシン、2 mMのKCN、または200μMのADP、最終濃度）が希釈されたミトコンドリアの総容量番目の 1/10での反応を分離する。 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。 注：有害である可能性があり、皮膚を通して誤飲や吸収などのこれらの物質を取り扱う場合は注意が必要です。 </li><li> 100μMの作業濃度で滅菌水で再構成し、2μMに、-20℃で保存し、TMREを希釈し、ミトコンドリアの反応容量に等しいボリュームを追加。 </li><li> 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。 </li><li>万XG、5分間、4℃で固定角ローターでの遠心分離によってペレットのミトコンドリア。 </li><li>負荷396ウェルプレート上の各サンプルの上清容量の半分と蛍光を読み取る。 注：TMREの励起および発光波長は、のために使用されるボリュームとプレートを用いて、製造者の指示に従って最適化されるべきであるアッセイ。励起/発光波長を用いて、1μMTMREを25μlを標準384ウェル黒色プレート（最終反応濃度）最も強い信号が得られたを使用して&#160; 485ナノメートル/ 535 nmの。 </li><li>コントロール（EB）と対照サンプルからRFUによる実験サンプルのためのプレートリーダーから得られた相対蛍光値（RFU）で割ることにより、各治療の間の蛍光の倍率差を計算する。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

組換えサイトカインとHEK-293T細胞の治療は、48時間（ 図1）を介して細胞死の程度の量を引き起こす。 TNF-α処理により誘導される細胞死の量は、以前に報告された研究30と同様であり、細胞の生存率は、単独でも、文献31,32と一致する任意のサイトカインと総括量よりも大きい複数のサイトカインの同時投与後に減少する。サイトカイン治療の量およびタイプを調整するだけでなく、個々のサイトカインのカクテルを比較する能力は、腎臓細胞に対するサイトカインの曝露の特定の効果を研究するために、この細胞培養モデルは魅力的である。さらに、結果は、非常に再現性であり、容易に（ 図2）を達成した。心に留めておくべき検討事項は、細胞の合流が含まれています。 70〜80％のコンで処理した場合、例えば、100％コンフルエンスで処理した細胞は、サイトカインの同じ濃度に同様に応答しないフルエンス。細胞応答は、おそらく（解凍以来超える8-12週間）が長すぎるために培養液中でされていた影響を与えることができたようにさらに、細胞が介して行っているの通路の数は、追跡...

生きている細胞は、脂肪や炭水化物の形で代謝エネルギーを銀行と生合成、膜輸送や移動のためにこのエネルギーを使用しています。いくつかのエネルギーは、解糖の間に直接ATPへの栄養糖の変換によって細胞質ゾルが得られる。しかし、細胞内のATP産生の主な供給源は、ミトコンドリア呼吸鎖1を介してミトコンドリア内活かされている。ミトコンドリアのアーキテクチャは、効果的かつ効率的なATP産生に必要な空間的な方向性を提供します。ミトコンドリアは、膜間スペースと一緒にマトリックスと、最も内側のミトコンドリアのコンパートメント、家のコンポーネントで区切って二重膜を有し、ATP生成に関与する化学反応を調整する。内膜は、呼吸鎖ならびにATPシンターゼ、ATPの形成のために一緒にADP及びPiのをもたらすタンパク質複合体を含む膜結合タンパク質複合体のシリーズを含んでいる。宿小胞体膜はクリステに折り畳まれ、電子はシトクロム c、膜間空間内での複合体との間で移動する可溶性電子伝達体を介して呼吸鎖複合体に沿って渡される。電子が移動すると、還元当量の酸化が発生し、水素イオンは、膜間空間にマトリックスからポンピングされる。膜間空間内の高イオン濃度の結果として、電気化学的勾配は、ミトコンドリア内膜（Δψ）2を横切る膜電位をもたらす構築する。酸素は、電子伝達鎖の最終的な電子受容体であり、水素イオンがバックマトリックス間腔からATPシンターゼを流れ、そうすることによって、直接ATPの形成を引き起こす。その全体が説明されているように、このプロセスは、酸化的リン酸化として知られている。クリステのひだは、最大電子輸送及び内ATP生産を可能にする、内膜の表面積を増加させる各ミトコンドリア。タンパク質、酵素、および酸化的リン酸化に関与する他の分子は、核およびミトコンドリアの両方の遺伝子に由来する。ミトコンドリアは、自分の環状DNA、13タンパク質のためのコード化だけでなく、ATP産生3のために必要なtRNA及びmRNAを含んでいます。しかし、より多くのタンパク質が必要とされ、従って符号化された核である。これらの核コードタンパク質の大部分は、前駆体タンパク質のN末端 ​​プレ配列を用いることにより、ミトコンドリアマトリックスに標的化され、それらのインポートはΔψ4,5によって部分的に駆動される。 細胞の生体エネルギーに寄与超えて、ミトコンドリアはまた、TCAおよびβ酸化、カルシウムの調節を介して細胞内シグナル伝達、ならびにアポトーシス6において重要な役割のような主要な代謝プロセスに影響を及ぼす。具体的には、細胞ストレスの時代に、上に存在するか、または、BCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリアを引き起こす可能性がミトコンドリア外膜に対話外膜透過（MOMP）7,8。 MOMP中は、 シトクロム cおよび他のタンパク質が細胞質ゾル中に放出され、一緒にいくつかの細胞質のタンパク質との複合体が、アポトソーム9,10と呼ばれる形成する。アポトソームは、アポトーシスの実行段階中に細胞タンパク質とDNAを切断するために行くカスパーゼを活性化させる。 MOMPが発生するとすぐに、ΔΨが崩壊され、ATP産生が停止。アポトーシスが開始されるように、このように、ミトコンドリアの機能が損なわれ、ΔΨの変化はミトコンドリアおよび細胞の健康12と相関させることができる。アポトーシスは、多くの疾患モデル内のエンドポイントであるが、ΔΨのミトコンドリア機能および変更はまた、疾患の発信および/または進行に関する貴重な情報を得ることができる。例えば、ミトコンドリアの構造的および機能的変化は、神経変性疾患13,14の過程で記録されている。 プロトコルの最初の部分では、ISO彼らのΔΨを保持無傷ミトコンドリアの設置とが記載されている。 HEK-293T細胞は、アポトーシスを誘導するために、異なる濃度の組換えTNF-α、IL1-βおよびIFN-γの組合せに曝露した。それらはしばしば、その受容体6への結合TNF-αとの相互作用によって誘発され得る初代ヒト敗血症サンプル15およびアポトーシスの外因性経路において高いことが報告されているので、これらのサイトカインは、選択された。培養した細胞と比較して、一次組織から機能的ミトコンドリアを単離するために必要な微妙な変化があるため、多くの研究は、動物を使用しているため、そして、プロトコルは、肝臓及び側索硬化症（ALS）マウスモデルを前方の脊髄からミトコンドリアを単離する方法を記載している。 プロトコルの第2の部分は、蛍光プレートリーダーを用いて電位感受性蛍光色素を使用して、ミトコンドリア膜電位摂動をモニターするために開発した。違い細胞状態（不健康対すなわち 、健常）との間の、ミトコンドリア膜電位の損失を引き起こす全てが脱共役剤、呼吸鎖阻害剤複合体の阻害剤およびイオノフォアと併せて単離されたミトコンドリアのΔΨの強度を定量することによって区別される。ミトコンドリア健康な、ミトコンドリア阻害剤で処理するとΔΨの変化が大きいので、ミトコンドリアの応答は、ミトコンドリア（DYS）機能の指標として用いることができる。 むしろ機能のその場評価に比べて単離されたミトコンドリアの使用は、病状または治療が直接細胞小器官16-18への変更を調節することを決定的な証拠を提供しています。培養細胞からミトコンドリアを単離するための文献中に記載された方法があるが、それらは17曖昧であり、および/ ​​または特殊な装置16を利用する。このプロトコルは、具体的に単離方法を記載している一次組織および培養13,14,19,20を含む他の細胞株に容易に適合。多くの単離されたミトコンドリアの研究は再び機器の非常に具体的かつ専門的な部分である、（21文学の多くの論文の代表例である）、このプロトコルではなく、クラーク電極を使用したのと同じミトコンドリアの脱共役剤および阻害剤を利用する。さらに、この伝統的な方法は、低いスループットと高い複雑22,23として制限があり、ミトコンドリアのかなりの量（〜500μgの/反応）が必要です。このプロトコルでは、蛍光膜電位感知プローブTMREは多くの研究所において標準機で蛍光プレートリーダーと一緒に使用される。それはすぐに細胞および単離されたミトコンドリアに入り、低濃度24で使用することができるので、TMRE広くみなされている。複数の反応が迅速にタンデムに設定することができ、バッチは、このプロトコルを使用して分析した。また、反応Sは、単離されたミトコンドリア（〜10μgの/反応）の多くは、少量を必要とする。より少ない材料を必要とすることによって、より小さな組織または細胞培養試料がミトコンドリアの単離のための出発点として利用することができ、より多くの複製または反応をセットアップすることができ、そのようなATPの生産、酸素消費量、またはインポートのような他の単離されたミトコンドリアの実験のために潜在的に十分な材料アッセイが可能である。

<table><tbody><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>シグマ</td><td>G1251</td><td>代わりにカリウム塩を使用できます。</td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>シグマ</td><td>M8304</td><td>代わりにカリウム塩を使用することができます。</td></tr><tr><td>KH2PO4Σ</td><td></td> <td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4Σ</td><td></td> <td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Σ</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>ΣT6066</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Σ</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Σ</td><td>C2920</td><td>100に希釈&nbsp;&#956;エタノールの作動株としてのMと-20&nbsp;&#176;C.</td></tr><tr><td>バリノマイシン</td><td>Σ</td><td>V0627</td><td>DMSOで製造し、5&nbsp;&#956;Mワーキングストック。-20&nbsp; で保存&#176;C.</td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>フィッシャー</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>マリンクロット</td><td>6379</td><td>エタノールで濃縮ストックを作り、水で希釈します&nbsp;</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ</td><td>R8875</td><td>非常に有毒です。エタノール製。</td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>非常に有毒です。エタノール製。</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>8717-25mg</td><td>希釈 100&nbsp;&#956;使用直前にEB入りのMストック。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>1xレギュラー(高グルコース)。</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャー</td><td>SH3002101</td><td>-20&nbsp;&#176;C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ロンザ</td><td>14-501F</td><td>米国原産、プレミアム品質。熱不活性化と-20&nbspでアリコートの保存。&#176;C.</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIgma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Protien Assay Dye (5x)</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>任意のタンパク質アッセイで代用できます。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1600-100</td>タンパク質<td>アッセイのために水に2mg / mlのストックを作ります。</td></tr><tr><td>MTTパウダー</td><td>シグマ</td><td>M2128</td><td>フィルターは、PBS製の5mg / mlストックを滅菌します。アリコートを-20&nbsp;&#176;C;4&nbsp;&#176;Cは最大1週間。</td></tr><tr><td>テルジトール溶液 (NP-40)</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-1B</td><td>Gibco</td><td>PCH08014</td><td>開封後 -20&nbsp;&#176;C</td></tr><tr><td>組換えヒト TNF-α</td><td>Gibco</td><td>PHC3015L</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IFN-γ</td><td>Gibco</td><td>PHC4031</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (-/-)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>Mg2+ および Ca2+ イオンがないことを確認してください。</td></tr><tr><td>サイトクロム c ELISAキット</td><td>R&</td><td>HEK-293T細胞用の</td>Dシステム<td>DTC0</td>ヒト&nbsp;</tr></tbody></table>

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

細胞の状態を決定するためには、健康なグループと病気のグループなど、2つ以上の異なるグループ間の比較が必要です。ミトコンドリアは、細胞代謝とエネルギー生産の両方、およびアポトーシスの制御における役割により、細胞の健康の中心にあります。したがって、単離されたミトコンドリアとミトコンドリアの摂動を直接評価することで、オルガネラ特異的な(機能不全)が発生しているかどうかを判断することができます。このプロトコルに記載されている方法には、HEK培養細胞およびマウスの肝臓および脊髄からの無傷の機能的ミトコンドリアの単離が含まれますが、他の培養細胞または動物組織での使用に容易に適応させることができます。TMREによって評価されるミトコンドリア機能、および一般的なミトコンドリアアンカプラーおよび阻害剤を蛍光プレートリーダーと組み合わせて使用することで、このプロトコルは汎用性が高く、ほとんどの研究室でアクセス可能であるだけでなく、高いスループットを提供します。

200 pg / mlでTNF-α、40 / mlのIL1-β、および75 / mlのIFN-γとHEK-293T細胞の処理（* 3）24〜48時間、細胞死の進行量（ 図1Aにつながる）。細胞生存率はMTTアッセイを用いて評価し、一貫〜24時間の処理による細胞生存率の10％減少し、48時間の処理で〜20％の減少があることを実証した。同様な濃度で処理した細胞（100 pg / mlでTNF-α、40 / mlのIL1-β、および75 / mlのIFN-γ）48時間で同様の細胞死の結果が得られ、そして個々のサイトカインでの治療はの減少することを明らかにし生存率は、組み合わせに起因していること（ 図1B）に影響を与える。 図1Bにおける生存率のデータは、3回の別々の実験を三連にて各ランの平均+/-標準偏差を表し、エラーバーの気密性 ​​は、データの再現性を実証する。サイトカインの量をさらにelucidatこの治療プロトコルを調整することができる電子細胞死に対する各サイトカインの寄与、およびさらなるサイトカインまたは他の因子もまた限り、適切な...

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

この手順の全体的な目標は、培養細胞またはマウス組織から呼吸するミトコンドリアを分離し、細胞の状態の尺度としてそれらの膜電位の強度を評価することです。培養細胞の場合、これは最初にプレーティングを行い、次に細胞を処理することによって達成されます。次に、細胞を均質化し、均質化物を針に通して、細胞からミトコンドリアをさらに放出します。マウス組織の場合、肝臓をマウスから切除し、次に両方のタイプの出発物質を用いて氷上で均質化します。次に、示差遠心分離を使用して、残りの細胞内容物からミトコンドリアを単離します。ミトコンドリアに膜電位感受性蛍光色素の添加を含む何らかの処理を施した後、TMRE蛍光測定を行い、膜電位の強度を計算します。最終的に、ミトコンドリア機能とミトコンドリア膜電位の摂動は、蛍光プレートリーダーと組み合わせて膜電位感度蛍光色素を使用して評価することができます カプラーや阻害剤の一般的なミトコンドリアで処理すると、この方法はサイトカイン誘発性アポトーシスとミトコンドリアの機能不全についての洞察を提供することができますが、LS.It は、次のような2つ以上の異なるサンプル間の比較を求める他のシステムにも適用できます健康な動物と病気、または代謝率の異なる2つの異なる種。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。ミトコンドリアの分離手順を学ぶのは難しいです。これは、従来のメソッドセクションでは見落とされがちなテクニックを実行する際に、多くのニュアンスがあるためです。この手順は、サイトカイン処理プレート、160,000個の細胞をT 1 75フラスコに入れて治療時に約70%の密度をもたらす48時間前にテキストプロトコルに記載されているように、ヒト胚性腎臓細胞を成長させることから開始します。次に、血清は24時間後に培地を吸引し、同量の無血清培地と交換することにより、細胞を飢餓状態にします。最後に、可溶化したサイトカインを細胞培養培地に直接添加して血清飢餓細胞を処理し、ミトコンドリアの単離を行います。まず、培地を吸引し、付着細胞を15ミリリットルの1 x リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで2回洗浄します。洗浄後、毎回バッファーを吸引し、フラスコをこすり落として、底から付着細胞を取り除きます。次に、各フラスコに15ミリリットルのXPBSを1つ加え、渦巻き、氷上の個々の15ミリリットルの円錐管に移します。掻き取りが完了したら、遠心分離後にスイングバケットローターを備えた卓上遠心分離機を使用して、チューブを摂氏4度のGの700倍で5分間遠心分離し、上清を吸引して再排します。各ペレットを1ミリリットルのミトコンドリア分離バッファーに懸濁します。次に、両方の懸濁液を組み合わせ、ミトコンドリアで均質化するための小さなガラス容器に移し、溶液が最初のラインに到達するまでガラス容器にミトコンドリア分離緩衝液をドリルに取り付けた状態で、氷上で細胞を中速で3回のパスで均質化します。乳棒を溶液に入れるときは、液体の上の乳棒を取り除くのではなく、気泡を取り除くように注意し、連続パスで安定した速度で使用するように注意する必要があります。均質化された溶液を50ミリリットルの円錐管に移します。次に、18ゲージ、1つの半インチの針を使用して溶液を3ミリリットルの注射器に引き込み、27ゲージの半インチの針で氷上の円錐管に戻します。チューブの内壁に対して溶液を排出するように注意して、その力を細胞膜の破壊に利用してください。シリンジのステップを合計5回繰り返した後、溶液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、スイングバケットローターを使用して卓上遠心分離機でG摂氏4度の600倍で5分間遠心分離します。この最初の低速スピンの後、ミトコンドリアは上清の中にあり、一部の膜と壊れていない細胞はペレット化されていますが、上清を慎重に取り除き、3本の1.5ミリリットルのチューブに分配します。次に、固定角度ローターで3本のチューブをGの4°Cで5分間遠心分離します。培養細胞のミトコンドリアは白っぽい色に見えます。各動物から肝臓を切除し、カルシウムやマグネシウムを含まない氷冷したXPBSを1つ置いて、血液を洗い流します。肝臓組織を氷の上の離れた皿に移し、新鮮なかみそりの刃を使用して1分間細かく刻みます。次に、組織と適切な緩衝液を、緩衝液が最初のラインに到達するまで血管に加えます。乳棒で氷上の組織を手で5回均質化します。乳棒を溶液に入れるときは、液体の上の乳棒を取り除くのではなく、気泡を取り除くように注意し、連続パスで安定した速度で使用するように注意する必要があります。テキストプロトコルで要請されているように、遠心分離と均質化でサンプルの処理を続けます。新しい上清を各サンプルの最初の上清と組み合わせた後、固定角度ローターでチューブを10,000倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ピペットチップを使用して、またはチューブの側面に押し込むことで、上部の白いふわふわの層を慎重に吸引します。次に、残りの上澄みをそっと注ぎ、蘇生します。肝臓のミトコンドリアペレットを500マイクロリットルのミトコンドリア分離物に懸濁します。肝臓の緩衝ミトコンドリアは茶色です。反応がセットアップされる直前に、サンプルを氷上にすばやく置きます。ミトコンドリアを0.5ミリグラム/ミリリットルに希釈します。実験用バッファーによる作業濃縮。テキストプロトコールに記載されている適切な処理を、希釈したミトコンドリアの総量である10分の1でチューブを分離します。次に、希釈したミトコンドリアを各反応チューブに入れ、各チューブを穏やかに攪拌して適切に混合します。反応をベンチトップで7分間インキュベートします。次に、等量の2マイクロモルテトラエチル、ロッドドミン、エチルエステル、略してTMREをミトコンドリア反応量に加えます。再び、各チューブを穏やかに攪拌して、適切に混合されるようにします。反応をベンチトップでさらに7分間インキュベートした後、固定角度ローターでG4°Cの10,000倍で5分間遠心分離することによりミトコンドリアをペレット化する。次に、各サンプルの上清量の半分を3 84にロードします。ウェルプレートは、サンプルの蛍光を読み取り、次に、TNF、α、IL、1ベータ、およびIFNガンマを用いたHEK 2 93 T細胞のテキストプロトコル処理で説明されているように、コントロールと各処理との間の蛍光の倍率差を計算します24〜48時間は、細胞死の進行性をもたらします。細胞生存率は、24時間治療で細胞生存率が約10%減少し、約20%減少することが一貫して実証されているMTTアッセイを使用して評価されました。48時間処理では、同様の濃度で処理した細胞は、48時間で同様の細胞死結果をもたらします。また、個々のサイトカインによる治療では、生存率の低下は組み合わせ効果によるものであることが明らかになりました。生存率は、3つの別々の実験の平均標準偏差を表しています。各実行が3回で、エラーバーのタイトさがデータの再現性を示しています。サイトカイン処理細胞から単離されたミトコンドリアの膜電位の減少率は、サイトカイン処理によってミトコンドリアの健康が影響を受けたことを意味し、この手順に続く生存率データを裏付けています。TPの生成、合計、TP、または酸素消費量の評価などの他の方法を形成して、異なるサンプル間でどのようなエネルギーと呼吸の違いがあるかなどの追加の質問を評価できます。このビデオを見れば、無傷の機能的ミトコンドリアを単離する方法と、細胞の状態を反映してその膜電位の強度を評価する方法について十分に理解できるはずです。

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