の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから
October 21st, 2014
私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。
この手順の全体的な目標は、初代骨髄ニューロンマクロファージからのクリプトコッカスネオフォルマンスの非リティックエキソサイトーシスを視覚化することです。これは、最初に活性化された神経マクロファージをプレーティングして真菌細胞に感染させることで、食作用とXeominの内在化を可能にします。2番目のステップは、細胞外真菌細胞を除去して、感染したマクロファージと感染していないマクロファージの明確な単層を確保することです。
次に、マクロファージを二酸化炭素温度制御チャンバーでインキュベートし、24時間記録して、非ライト酸エキソサイトーシスやその他の相互作用のインスタンスを捕捉します。最後のステップは、24時間で作成されたすべてのフレームを圧縮してムービーを作成することです。最終的に、デジタル光学顕微鏡によるマクロファージの可視化は、マクロファージが24時間の感染を通じて受けるさまざまな非リティックエキソサイトーシスタイプを観察するために使用されます。
この方法は、細胞イベントのタイミングや定量化など、宿主病原体相互作用分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。実験の前日に、スバロ寒天プレートで増殖させたシニアフォアマンズコロニーを1個選択し、10ミリリットルのスバロブロスを接種します。書面によるプロトコルに記載されているように、マウスの安楽死後、250 RPMの速度で振とうしながら、培養物を摂氏37度で一晩成長させます。
全身を70%エチルアルコールで滅菌します。大腿骨と脛骨の両方を取り除き、骨を滅菌デュオ、修正イーグルミディアム、またはDMEMに入れます。次に、骨が完全にきれいになるまで、繊細なワイプを使用して余分な組織と筋肉を取り除きます。
70%エチルアルコールを含むシャーレに無傷の骨のみを入れ、3分間インキュベートして関連する微生物を殺します。骨を取り除き、滅菌DMEMを入れたシャーレに入れます。次に、骨の端を慎重に切ります。
氷の上に置かれたMT 50ミリリットルの円錐形チューブに骨を保持し、25ゲージの針を使用して、各骨に10ミリリットルの冷たいDMEMを慎重に洗い流します。次いで、収集した細胞懸濁液を室温で650倍Gで10分間遠心分離し、この遠心分離中に、テキストプロトコルに記載されているように骨髄マクロファージ供給培地を滅菌し、ろ過する。次に、得られたパレットを10ミリリットルの供給媒体で再懸濁します。
細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーに通して、細胞の凝集を破壊し、大きな破片を取り除きます。次いで、1ミリリットルの菌株細胞懸濁液を10ミリリットルの供給培地にプレートし、組織培養用に指定されたシャーレをシャーレとする。細胞を摂氏37度で10%の二酸化炭素で7日間接着させます。
実験の前日にテキストプロトコルに記載されているように、給餌媒体を変更します。供給培地を除去してマクロファージをプレートから分離し、細胞を5〜10分間インキュベートした後、5ミリリットルの穏やかな細胞ストリッピング試薬をプレートに加えます。摂氏37度で、穏やかなピペッティングでマクロファージを除去します。
1ミリリットルの供給培地でペレットをreus曲げる前に、10分間Gの650倍で遠心分離することにより細胞をペレット化します。1〜20希釈を用いて、底面14ミリメートルガラスを用いてヘモサイトメーターに細胞懸濁液の10マイクロリットルをピペッティングすることにより、マクロファージの濃度を計算する。ペトリ皿は、10倍から5番目のマクロファージの1倍の濃度を直接内部ウェルに入れ、最大200マイクロリットルを保持します。
この音量を超えないように注意してください。細胞をガラスのペトリ皿に接着させるには、皿を摂氏37度のインキュベーターに1時間置きます。次に、リポ多糖類を1ミリグラムあたり1ミリグラムで補充した1〜2ミリリットルの栄養培地とインターフェロンガンマを追加します。
ミリリットルあたり500ユニットで、実験の日に細胞を一晩インキュベートします。一晩接種したG細胞培養物の1ミリリットルを取り出し、酵母細胞を5分間、420回遠心分離してパルト G.To 培地と細胞外クリプトコッカス生成物を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで3回洗浄した後、前回と同様に遠心分離します。酵母細胞ペレットを1ミリリットルの滅菌PBSに懸濁させた後、1〜100希釈ピペットを作成し、希釈液10マイクロリットルをヘモサイトメーターにして細胞をカウントします。
1〜5の感染の多様性に必要な酵母細胞の濃度を計算します。計算された量のクリプトコッカス細胞懸濁液を、モノクローナル抗体、10マイクログラム/ミリリットルの濃度で18Bセブンを含む1ミリリットルの供給培地に加えます。細胞懸濁液を室温で5分間インキュベートします。
次に、ガラス製のペトリ皿から供給培地を取り出し、マクロファージを滅菌PBSで一度洗浄します。次に、100マイクロリットルのオプソナイズCminをウェルに直接加え、続いて酵母と摂氏37度および二酸化炭素10%側で2時間インキュベートします。共インキュベーション後、マクロファージが内在化されていると考えられるc eFormsが内在化されていることを顕微鏡で確認した後、大きな矢印の頭で示されているように、マクロファージの範囲内で明確に見えるはずです。
小さい方の矢印は、真菌細胞を持たない感染していないマクロファージを示しています。ペトリ皿を滅菌PBSで3回洗浄し、細胞外cネオフォルマンをすべて除去します。次に、モノクローナル抗体を含まない1〜2ミリリットルの供給培地を添加して、これらの実験を行います。
実験前には、二酸化炭素の供給と加熱ユニットを含むインキュベーションチャンバーが取り付けられた顕微鏡が必要です。インキュベートチャンバーを摂氏37度で少なくとも30分間予温します。実験の開始時に二酸化炭素単位が5%を示すことを確認します。
ガラス底のペトリ皿を顕微鏡プラットフォームカバーに置き、二酸化炭素を点灯させ、すべてのドアを閉めて熱が逃げないようにします 10倍対物レンズを使用して顕微鏡を位相差で使用し、感染したマクロファージの明確なフィールドに焦点を当て、顕微鏡ソフトウェアを設定して24時間4分ごとに画像を撮ります。24時間後、実験は完了し、合計361枚の画像が収集されます。これらの画像を 5% 圧縮で JPEG としてエクスポートします。
image Jソフトウェアを使用して、画像を毎秒5フレームの視覚的なスタックとして表示します。映画の最初のフレームでは、フィールド全体に多くのマクロファージが表示されており、感染していないものもあれば、クリプトコッカス細胞のサイズが異なるものもあります。映画が進むにつれて、細胞はすべてmoであり、この映画ではフィールド内を動き回っているのを見ることができ、クリプトコッカス細胞が感染したマクロファージの範囲内にあることは明らかです。
マクロファージは攪拌され、酵母細胞が見られますが、FGAゾーン内では、クリプトコッカス細胞はすぐに周囲の環境に消去されます。2番目に感染したマクロファージは非リティックエキソサイトーシスを受け、より多くの酵母細胞が細胞外空間に放出されます。宿主細胞は、クリプトコッカス・エキソサイトーシス後も生存能力を維持し、その能力が動き続けることからも
示されます。時折、マクロファージは、宿主細胞間でのクリプトコッカス細胞の移動を容易にするような方法で相互作用します。酵母細胞は細胞外環境にさらされず、宿主細胞は生存したままです。この映画では、感染した2つのマクロファージが2つの別々の機会に細胞間ブリッジを作成し、クリプトコッカス細胞を1つのマクロファージから別のマクロファージにシャトルします。
このビデオを見れば、デジタル光学顕微鏡を使用して、非溶解性エキソサイトーシスやその他の宿主病原体との相互作用を受けているマクロファージを視覚化する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、デジタル光学顕微鏡を用いて、マクロファージとCryptococcus neoformansの相互作用をリアルタイムで視覚化する手法を示しています。この技術は、感染したマクロファージを24時間観察し、様々な細胞外排出過程を捉えることができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫学
- 微生物学
背景
- マクロファージは病原体に対する免疫応答において重要な役割を果たしています。
- Cryptococcus neoformansは、免疫応答を回避できる重要な真菌性病原体です。
- 非溶解性細胞外排出は、マクロファージが細胞死を起こさずに病原体を排出するプロセスです。
- デジタル光学顕微鏡は、細胞プロセスのリアルタイム視覚化を可能にします。
研究の目的
- 活性化したマクロファージからCryptococcus neoformansの非溶解性細胞外排出を視覚化する。
- マクロファージと真菌の相互作用のダイナミクスを理解する。
- 感染中の細胞外排出の種類の多様性を記録する。
使用した方法
- 一次骨髄由来マクロファージを活性化し、真菌細胞で感染させました。
- 明確な単層を維持するために、細胞外の真菌細胞を除去しました。
- マクロファージを24時間管理された環境下で培養しました。
- デジタル光学顕微鏡を用いて画像を撮影し、それらを動画にまとめました。
主要な結果
- 非溶解性細胞外排出過程のリアルタイム視覚化に成功しました。
- 24時間の感染期間中に様々な種類の細胞外排出が観察されました。
- この方法は、真菌感染に対するマクロファージの挙動に関する洞察を提供しました。
- デジタル光学顕微鏡は細胞間相互作用の研究に効果的であることが証明されました。
結論
- この技術は、マクロファージと病原体の相互作用に関する理解を深めます。
- 非溶解性細胞外排出はCryptococcus neoformansに対する免疫応答において重要なメカニズムです。
- この研究は、感染におけるマクロファージ機能性についての広範な知識に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing non-lytic exocytosis of Cryptococcus neoformans from macrophages provides mechanistic insight into host-pathogen dynamics that can inform target validation in antifungal discovery. Real-time digital light microscopy enables quantitative tracking of pathogen release events without host cell lysis, supporting phenotypic screening and translational biomarker development. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic interactions missed in endpoint assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing pathogen expulsion mechanisms that leave both host and pathogen viable.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of exocytosis events over a 24-hour infection window.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying whether observed effects stem from lytic or non-lytic pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antifungal compound screening by establishing baseline exocytosis kinetics.
- Operational Value: Delivers quantitative, time-resolved outputs (e.g., event frequency, timing) suitable for assay standardization and reproducibility.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a dynamic readout that distinguishes between cytotoxic and non-cytotoxic mechanisms of action.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using primary bone marrow-derived macrophages infected with clinically pertinent Cryptococcus neoformans strains.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by capturing dynamic host-pathogen interactions over time.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether test compounds alter exocytosis without inducing macrophage death.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, where dynamic visualization of non-lytic exocytosis supports hypothesis testing and biological de-risking before compound progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct observation of whether pathogens are expelled via lytic or non-lytic mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of exocytosis events per macrophage over time.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., exocytosis event count, latency) that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary macrophages and pathogenic fungal strains reflective of human infection contexts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple host-pathogen systems beyond Cryptococcus neoformans.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen interaction studies.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through controlled environmental incubation and automated time-lapse imaging.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds that inadvertently trigger lytic pathways and associated inflammation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying molecules that modulate exocytosis without compromising host cell viability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary macrophage isolation, fungal pathogenesis, and live-cell imaging techniques.
- Dependent on stage-top incubators with precise CO2 and temperature control for 24-hour imaging.
- Necessitates standardized operating procedures for extracellular pathogen washing to ensure clear monolayers.
- Involves adaptation considerations when translating to other macrophage sources or pathogen species.
- Limited by phototoxicity risks over extended imaging periods, requiring optimization of light exposure and frame rate.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Isolation and Preparation of Primary Bone Macrophages from C57/B16 Mice
4:51
Co‐incubation of Primary Murine Macrophages and C. neoformans
6:56
Visualizing Non‐lytic Exocytosis in Real‐time Utilizing Digital Light Microscopy
8:11
Results: Primary Murine Macrophages Undergo Different Types of Non‐lytic Exocytosis of C. neoformans
9:36
Conclusion
