Name: の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶマクロファージからのCryptococcus neoformansの非溶解性エキソサイトーシスの可視化法。デジタル光学顕微鏡を用いて24時間のリアルタイム観察により、細胞傷害を伴わない病原体放出メカニズムを解明する。

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本研究は、NIH賞5T32AI07506、5R01AI033774、5R37AI033142、5R01AI052733によって部分的にサポートされていました。

全ての動物作業はアルバート·アインシュタイン医科大学の動物研究所の規制やガイドラインに従って行われた。 Cの 1。成長条件ネオホルマンス H99（血清型A） <ol><li>個別のC.を育てるサブロー寒天プレート上ネオフォルマンス （CN）コロニー。 </li><li>ある日、実験前に1つのコロニーを選択し、サブローブロス10mlを接種。 </li><li>文化は速度250rpmで振盪し、37℃で一晩成長させる。 </li></ol> C57BL / 6マウスから2離と初代骨マクロファージの調製<ol><li>もはや呼吸するまでCO 2チャンバー内に動物を配置することによってマウスを安楽死させる。第二の対策として、cervically解剖を開始する前に、首を脱臼。 70％エチルアルコールで身体全体を滅菌する。 </li><li>大腿骨と脛骨の両方を削除し、滅菌DMEM中で骨を置く。 </li><li>ドを使用して余分な組織や筋肉を削除する骨が完全にきれいになるまでlicateワイプ。 </li><li> 70％のエチルアルコールを含むペトリ皿にだけ無傷の骨を置き、関連する微生物を殺すために3分間インキュベートする。骨を削除し、滅菌したDMEMでペトリ皿に配置します。 </li><li>慎重に骨の端をカット。各骨を25 Gの針を用いて氷上に置い空の50mlコニカルチューブと冷たいDMEMを慎重にフラッシュ10ミリリットル以上の骨を持ってください。 注：各マウスは4骨（大腿骨2、2脛骨）が得られます。したがって1マウスの細胞懸濁液を約40ミリリットルが得られるはずです。 </li><li> 650のx gで10分間、室温で遠心細胞懸濁​​液。 </li><li>この遠心分離の間、準備し、フィルタ骨髄マクロファージは20％L929、10％ウシ胎児血清、10％NCTC-109、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES、1％L-グルタミンを補充したDMEMで構成されて媒体を供給する殺菌、非必須アミノ酸、1％、0.1％2 - メルカプトエタノール。 </li><li>メディアを送り、10 mlの再懸濁し、得られたペレット。セルsuspensを渡す細胞塊を破壊し、大きな破片を除去するために70μmのセルストレーナーを通してイオン。 </li><li>プレート（10プレートの合計）組織培養用に指定されているペトリ皿にメディアを供給する10mlの中に細胞懸濁液1ml。 </li><li>細胞を10％のCO 2、37℃で接着させる。完全にメディアやマクロファージが使用される準備ができている給餌を交換し、7日目、3日目に新鮮な給餌メディアの5ミリリットルを追加します。 </li><li>実験前の日は、給餌培地を除去することによってプレートからマクロファージを外し、プレートに試薬をリッピング優しい電池の5ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃で5〜10分間インキュベートし、穏やかにピペッティングしてマクロファージを削除します。 </li><li> 10分間650×gでの遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li>給餌培地1mlに再懸濁ペレット。 1:20希釈を使用して、血球計数器上に細胞懸濁液10μlをピペッティングすることにより、マクロファージの濃度を算出。 </li><li> 14ミリメートルのガラスを使用すると、ペトリ皿、プレートaを底直接200μlの最大を保持している内側のウェルに1×10 5マクロファージの濃度は、そのように、図4に示すように、このボリュームを超えないように十分注意してください。 </li><li>細胞は1時間37℃のインキュベーター中に皿を置くことによって、ガラスシャーレに付着させる。 </li><li> 500 U / mlで1 mg / mlのとのIFNgにLPSを添加した培地を供給する1-2 mlを加え、細胞を一晩インキュベートすることができます。 </li></ol> 3プライマリマウスマクロファージおよびCの同時インキュベーションネオフォルマンス <ol><li>実験の日に、420×gで5分間遠心分離することにより、一晩接種し、培養し、ペレット酵母細胞の1ミリリットルを削除します。 </li><li>上記の速度と同時にメディアや多糖類glucuronoxylomannan（GXM）様細胞外クリプトコッカス生成物を除去する滅菌PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li> 100希釈：滅菌PBS 1ml中に再懸濁細胞ペレットとは、1を加えます。 tはピペット10μlの彼は血球計数器上に希釈し、細胞をカウントします。 5：1のMOIで酵母細胞を追加します。例えば、1×10 5マクロファージが存在する場合、/ウェル、CNの5×10 6 / mlの細胞懸濁液を作製し、5×10 5 Cnの総額については、この溶液100μlを加える。 </li><li> 10μg/ mlの濃度でのmAb 18B7抗体による給餌培地1mlにクリプトコッカス細胞懸濁液の計算されたボリュームを追加する。 5分間室温で細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>ガラスからの給電メディアを取り出し、ペトリ皿底し、滅菌PBSで1倍を洗う。ウェルに直接オプソニンCnの100μlのを追加します。 </li><li>細胞を10％CO 2で37℃で2時間インキュベートすることを許可する。 </li><li>同時インキュベーションの後、マクロファージはCnとを内在化していることを顕微​​鏡で確認してください。内在化とみなされるには、クリプトコッカス細胞は明らかにマクロファージの範囲内で見られるべきである。 </li><li>任意およびすべてのextracellulaを除去するための無菌のPBSで洗浄するシャーレ3倍R Cnは。 </li><li>モノクローナル抗体18B7を添​​加せずにメディアを供給する1〜2mlのを追加し、顕微鏡を設定します。 </li></ol> 4。デジタル光学顕微鏡を利用したリアルタイムでの非溶解性エキソサイトーシスの可視化注：これらの実験を実行するには、CO 2の配信と加熱ユニットを含む添付インキュベートするチャンバーが付属して顕微鏡が必要となります。 <ol><li>実験の前に、37℃で少なくとも30分間インキュベートするチャンバをあらかじめ温め。 CO 2ユニットは実験開始時に5％を読み取っていることを確認してください。 </li><li>置きガラスは、CO 2を蓋でカバーし、全く熱逃げないことを保証するために、すべてのドアを閉じて、顕微鏡プラットフォーム上でペトリ皿底。 </li><li>位相差顕微鏡で10×対物レンズを用いて、感染したマクロファージのクリアフィールドに焦点を当てる。実験に基づいて、研究する必要がどのように多くのマクロファージが使用する目的を決定する。 </li><li> TAに顕微鏡ソフトウェアをセットアップします24時間の期間のために、画像ごとに4分KE。 </li><li> 24時間後、実験が完了に達しているし、361画像の総数が収集されているであろう。 5％の圧縮で.jpegsとしてこれらの画像をエクスポートします。画像Jソフトウェアを使用して、毎秒5フレームでビジュアル·スタックとして画像を表示します。映画は出版物またはプレゼンテーションのために表示する必要がある場合は、.AVIまたはフォーマットは、視聴者に最も適したかに応じてのMOVファイルのどちらとして保存します。 </li></ol>

<ol><li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li>
<li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+interactions+with+macrophages%3A+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li>
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<li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li>
<li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li>
<li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2%2F3+complex-mediated+actin+polymerisation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li>
<li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li>
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<li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+genetics+and+biology%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li>
</ol>

著者は、私たちは、競合金融利害やその他の利害関係がないことを宣言します。

ここでは、真菌 - マクロファージ相互作用が24時間の期間にわたってリアルタイムで記録し、分析することができる方法を記載している。私たちの研究室では、非溶解性エキソサイトーシスの時間的な側面の多くを研究するために、このプロトコルを使用しており、このプロセスを囲む形態学的要素を確認するために、リアルタイムの顕微鏡を使用し続けます。 この技術は理想的な結果をもたらすために、特別な注意がプロトコルにおける特定のステップに与えられるべきである。個別のセルの動きとの相互作用の視聴が妨げられるようにあまりにも少数の細胞が重要ではないデータを生成するかもしれない非常に多くの細胞が、使用できないムービーを作成することができますので、前の晩にメッキされているセル密度が重要です。目標は、個別のマクロファージが感染期間の間、続くことができるように、マクロファージの等間隔のフィールドを達成することである。その同じ静脈では、細胞外Cnを離れて洗浄して元のような重要なステップであるtracellular Cnは、フィールドを不明瞭にし、マクロファージの可視性の損失につながる可能性が時間をかけて分割します。映画...

クリプトコッカス細胞とマクロファージ間の真菌感染症のステージはよく1-3文書化されています。酵母細胞は、マクロファージによって摂取された後、相互作用の多様が発生することがあります。マクロファージは、細胞外空間に、その真菌負荷を解放する溶解もあれば、その細胞膜4の範囲内で酵母細胞を維持することによって感染を制御することができる。非溶解性エキソサイトーシス、マクロファージは、周囲の環境や隣接セルへクリプトコッカス細胞の一部またはすべてを抹消し、ホストおよび病原体の両方が5生存し続けるするプロセス：しかし、数年前に新しい結果が二つのグループによって独立して記述された-8。いくつかの研究は、この相互作用の背後にある分子メカニズムを理解しようとしましたが、私たちはまだこの現象をドライブかについての完全な理解していません。 リアルタイムで画像をキャプチャし、その後、複数の未感染を分析する能力マクロファージ編は、1つのタイミング、空間的な能力、真菌感染中のマクロファージの形態の変化、さらにはストレスに関して、非溶解性エキソサイトーシスを取り巻く物理的特性についての多くの質問に答えることができます。細胞がインキュベーターに匹敵する環境内に収容されるようにすることによって、私たちはマクロファージ真菌細胞相互作用の動的性質を垣間見ることができる。研究者は、このプロセスのさまざまなコンポーネントを研究するためにこの技術を使用している。別のグループは非溶解性エキソサイトーシスは、タンパク質ドメインの核WASH 10を削除して持っていた細胞内でブロックされたことを示すために、このメソッドを使用しながら、このプロセスにおけるファゴソームの役割は、蛍光染色およびアクチンブロッキング剤9を使用して明らかにされました。サイトカインシグナル伝達の効果もリアルタイム顕微鏡11を用いて確認された。このプロセスは、C.に限定されるものではないそれはまた、 カンジダ·アルビカンス、anotheで観察されたようネオフォルマンスマクロファージ12に感染する能力を有する真菌病原体rを。 これらの知見は、この方法は私達がそんなに少し知っ領域に豊富な情報を提供する方法の例です。

<table><tbody><tr><td>Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>DF0109-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Dextrose Broth</td><td>BD</td><td>DF0382-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 109</td><td>Invitrogen</td><td>21340-039</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES バッファー</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CL</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>有毒</td></tr><tr><td>な 3003 組織培養ペトリ皿&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Mat-Tek ガラス底培養皿</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L3137</td><td></td></tr><tr><td>マウス IFN-g</td><td>ロシュ</td><td>NC 9222016</td><td></td></tr><tr><td>mAb 18B7</td><td>当研究室</td><td></td><td></td>で生産した非商業抗体</tr><tr><td>Axiovert 200Mインキュベーティングチャンバー付き顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

クリプトコッカス·ネオフォルマンスによるマクロファージの感染の多くの側面が広く研究と明確に定義されています。しかし、明確に理解されていない一つの特定の相互作用は、非溶解性エキソサイトーシスである。このプロセスでは、酵母細胞は、マクロファージ及びCnの生存の両方を残すあまり理解機構によって細胞外空間に放出される。ここでは、時間の経過顕微​​鏡による24時間の感染期間ごとに個別に感染したマクロファージを大量に従う方法について説明します。感染したマクロファージは、細胞培養インキュベーター中と同じ条件を提供し、顕微鏡に取り付けられたCO 2雰囲気で加熱室に収納されている。ライブデジタル顕微鏡は、静止画像からは使用できませんホストと病原体との間の動的相互作用に関する情報を提供することができる。各感染細胞を可視化することができれば、マクロファージは真菌感染、およびその逆を処理する方法の手がかりを提供することができます。この技術iは複雑な現象の背後にある力学を研究する上でのsa強力なツール。

この技術は、生成した画像は、細胞がC.貪食された後に何が起こるか、周囲の情報を収集するためのさまざまな方法で分析することができるネオフォルマンスは、 図1に見られるように、感染したまたは感染していないのいずれかである約100マクロファージである。これらのマクロファージのそれぞれは、視聴者に非常にミクロなレベルでの宿主 - 病原体相互作用を研究する機会を与えてくれます。 図2及び図3のように、マクロファージおよび酵母細胞の間で、さらにはマクロファージマクロファージとの間で発生する可能性が異なる結果があります。マクロファージは、非溶解性エキソサイトーシス、細胞 - 細胞伝達、または発生する可能性のある他の細胞過程を経るとしてスコアすることができます。感染の間のこのようなイベントのタイミングは、映画が記録されているときに設定されたパラメータに基づいて確認することができる。 <i...

私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

この手順の全体的な目標は、初代骨髄ニューロンマクロファージからのクリプトコッカスネオフォルマンスの非リティックエキソサイトーシスを視覚化することです。これは、最初に活性化された神経マクロファージをプレーティングして真菌細胞に感染させることで、食作用とXeominの内在化を可能にします。2番目のステップは、細胞外真菌細胞を除去して、感染したマクロファージと感染していないマクロファージの明確な単層を確保することです。次に、マクロファージを二酸化炭素温度制御チャンバーでインキュベートし、24時間記録して、非ライト酸エキソサイトーシスやその他の相互作用のインスタンスを捕捉します。最後のステップは、24時間で作成されたすべてのフレームを圧縮してムービーを作成することです。最終的に、デジタル光学顕微鏡によるマクロファージの可視化は、マクロファージが24時間の感染を通じて受けるさまざまな非リティックエキソサイトーシスタイプを観察するために使用されます。この方法は、細胞イベントのタイミングや定量化など、宿主病原体相互作用分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。実験の前日に、スバロ寒天プレートで増殖させたシニアフォアマンズコロニーを1個選択し、10ミリリットルのスバロブロスを接種します。書面によるプロトコルに記載されているように、マウスの安楽死後、250 RPMの速度で振とうしながら、培養物を摂氏37度で一晩成長させます。全身を70%エチルアルコールで滅菌します。大腿骨と脛骨の両方を取り除き、骨を滅菌デュオ、修正イーグルミディアム、またはDMEMに入れます。次に、骨が完全にきれいになるまで、繊細なワイプを使用して余分な組織と筋肉を取り除きます。70%エチルアルコールを含むシャーレに無傷の骨のみを入れ、3分間インキュベートして関連する微生物を殺します。骨を取り除き、滅菌DMEMを入れたシャーレに入れます。次に、骨の端を慎重に切ります。氷の上に置かれたMT 50ミリリットルの円錐形チューブに骨を保持し、25ゲージの針を使用して、各骨に10ミリリットルの冷たいDMEMを慎重に洗い流します。次いで、収集した細胞懸濁液を室温で650倍Gで10分間遠心分離し、この遠心分離中に、テキストプロトコルに記載されているように骨髄マクロファージ供給培地を滅菌し、ろ過する。次に、得られたパレットを10ミリリットルの供給媒体で再懸濁します。細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーに通して、細胞の凝集を破壊し、大きな破片を取り除きます。次いで、1ミリリットルの菌株細胞懸濁液を10ミリリットルの供給培地にプレートし、組織培養用に指定されたシャーレをシャーレとする。細胞を摂氏37度で10%の二酸化炭素で7日間接着させます。実験の前日にテキストプロトコルに記載されているように、給餌媒体を変更します。供給培地を除去してマクロファージをプレートから分離し、細胞を5〜10分間インキュベートした後、5ミリリットルの穏やかな細胞ストリッピング試薬をプレートに加えます。摂氏37度で、穏やかなピペッティングでマクロファージを除去します。1ミリリットルの供給培地でペレットをreus曲げる前に、10分間Gの650倍で遠心分離することにより細胞をペレット化します。1〜20希釈を用いて、底面14ミリメートルガラスを用いてヘモサイトメーターに細胞懸濁液の10マイクロリットルをピペッティングすることにより、マクロファージの濃度を計算する。ペトリ皿は、10倍から5番目のマクロファージの1倍の濃度を直接内部ウェルに入れ、最大200マイクロリットルを保持します。この音量を超えないように注意してください。細胞をガラスのペトリ皿に接着させるには、皿を摂氏37度のインキュベーターに1時間置きます。次に、リポ多糖類を1ミリグラムあたり1ミリグラムで補充した1〜2ミリリットルの栄養培地とインターフェロンガンマを追加します。ミリリットルあたり500ユニットで、実験の日に細胞を一晩インキュベートします。一晩接種したG細胞培養物の1ミリリットルを取り出し、酵母細胞を5分間、420回遠心分離してパルト G.To 培地と細胞外クリプトコッカス生成物を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで3回洗浄した後、前回と同様に遠心分離します。酵母細胞ペレットを1ミリリットルの滅菌PBSに懸濁させた後、1〜100希釈ピペットを作成し、希釈液10マイクロリットルをヘモサイトメーターにして細胞をカウントします。1〜5の感染の多様性に必要な酵母細胞の濃度を計算します。計算された量のクリプトコッカス細胞懸濁液を、モノクローナル抗体、10マイクログラム/ミリリットルの濃度で18Bセブンを含む1ミリリットルの供給培地に加えます。細胞懸濁液を室温で5分間インキュベートします。次に、ガラス製のペトリ皿から供給培地を取り出し、マクロファージを滅菌PBSで一度洗浄します。次に、100マイクロリットルのオプソナイズCminをウェルに直接加え、続いて酵母と摂氏37度および二酸化炭素10%側で2時間インキュベートします。共インキュベーション後、マクロファージが内在化されていると考えられるc eFormsが内在化されていることを顕微鏡で確認した後、大きな矢印の頭で示されているように、マクロファージの範囲内で明確に見えるはずです。小さい方の矢印は、真菌細胞を持たない感染していないマクロファージを示しています。ペトリ皿を滅菌PBSで3回洗浄し、細胞外cネオフォルマンをすべて除去します。次に、モノクローナル抗体を含まない1〜2ミリリットルの供給培地を添加して、これらの実験を行います。実験前には、二酸化炭素の供給と加熱ユニットを含むインキュベーションチャンバーが取り付けられた顕微鏡が必要です。インキュベートチャンバーを摂氏37度で少なくとも30分間予温します。実験の開始時に二酸化炭素単位が5%を示すことを確認します。ガラス底のペトリ皿を顕微鏡プラットフォームカバーに置き、二酸化炭素を点灯させ、すべてのドアを閉めて熱が逃げないようにします 10倍対物レンズを使用して顕微鏡を位相差で使用し、感染したマクロファージの明確なフィールドに焦点を当て、顕微鏡ソフトウェアを設定して24時間4分ごとに画像を撮ります。24時間後、実験は完了し、合計361枚の画像が収集されます。これらの画像を 5% 圧縮で JPEG としてエクスポートします。image Jソフトウェアを使用して、画像を毎秒5フレームの視覚的なスタックとして表示します。映画の最初のフレームでは、フィールド全体に多くのマクロファージが表示されており、感染していないものもあれば、クリプトコッカス細胞のサイズが異なるものもあります。映画が進むにつれて、細胞はすべてmoであり、この映画ではフィールド内を動き回っているのを見ることができ、クリプトコッカス細胞が感染したマクロファージの範囲内にあることは明らかです。マクロファージは攪拌され、酵母細胞が見られますが、FGAゾーン内では、クリプトコッカス細胞はすぐに周囲の環境に消去されます。2番目に感染したマクロファージは非リティックエキソサイトーシスを受け、より多くの酵母細胞が細胞外空間に放出されます。宿主細胞は、クリプトコッカス・エキソサイトーシス後も生存能力を維持し、その能力が動き続けることからも示されます。時折、マクロファージは、宿主細胞間でのクリプトコッカス細胞の移動を容易にするような方法で相互作用します。酵母細胞は細胞外環境にさらされず、宿主細胞は生存したままです。この映画では、感染した2つのマクロファージが2つの別々の機会に細胞間ブリッジを作成し、クリプトコッカス細胞を1つのマクロファージから別のマクロファージにシャトルします。このビデオを見れば、デジタル光学顕微鏡を使用して、非溶解性エキソサイトーシスやその他の宿主病原体との相互作用を受けているマクロファージを視覚化する方法を十分に理解できるはずです。

visualizing-non-lytic-exocytosis-cryptococcus-neoformans-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

このビデオでは、マクロファージにおける病原菌であるCryptococcus...

マクロファージにおけるCryptococcus neoformans感染を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

ここでは、イメージサイトメトリー、培養中の宿主細胞に対応付けて病原性真菌の定量に使用することができる方法を示す。この技術は、CFU列挙の代替として使用することができる。...

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

この記事では、マクロファージをCryptococcus neoformansに感染させるためのプロトコルについて説明します。また、マクロファージからのステロールの枯渇方法についても説明します。これらのプロトコルは、in...

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

ここでは、真菌、カンジダ・アルビカンス、およびザイモサンやIgGコーティングビーズを含む0.5μmを超える微粒子などの病原体の食作用中の初期のカスケードを視覚化し、定量化するための顕微鏡ベースの技術について説明します。...

食作用の初期段階の可視化

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

本論文では、静止画、蛍光画像、高解像度透過電子顕微鏡画像を用いて研究されたクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を調製するためのプロトコルについて詳しく述べたい。次に示すように、定量的データがこのような定性的情報を補完する方法について説明します。...

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

学ぶマクロファージからのCryptococcus neoformansの非溶解性エキソサイトーシスの可視化法。デジタル光学顕微鏡を用いて24時間のリアルタイム観察により、細胞傷害を伴わない病原体放出メカニズムを解明する。

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

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