生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定ネッタイシマカ

この手順の全体的な目標は、昆虫の味覚ニューロンの応答を観察し、味覚組織での遺伝子発現を測定することです。これは、最初に、異なる濃度のいくつかの味に対する特定の味覚毛の応答を記録することによって達成されます。2番目のステップは、味覚組織を注意深く解剖することです。

次に、サンプルを性別と付属物で分けます。次に、各組織サンプルから全RNAを単離し、次世代シーケンシングおよびQPCR用のCD NA調製物を作成します。最後のステップは、遺伝子発現データを解析し、発現したケモス感覚遺伝子が昆虫の味覚に対する生理学的反応をどのように媒介するかなどの仮説を立てることです。

最終的に、電気生理学的記録を使用して昆虫の味覚系の受容範囲を示し、味覚組織のRNAシーケンシングを使用して、味覚受容の最も重要な遺伝的要素を強調します。一般的に、これらの方法に不慣れな個人は、昆虫の化学療法のサイズが小さいため、苦労します。感覚付属物。

小さな昆虫の臓器を解剖するか記録するかにかかわらず、患者での実践がこれらの技術を習得するための鍵です。この手順を開始するには、ガラスキャピラリーを備えたピペットプーラーで細い先端記録電極を解剖顕微鏡で引っ張ります。電極の先端を慎重に折って、その開口部がターゲットの中心を包み込むのに十分な幅を持ち、隣接する構造に接触しないように十分に小さくします。

次に、マイナス20°Cの冷凍庫で2〜4匹の成虫に2〜4匹の昆虫に麻酔をかけます。その後、セロハンテープの小さなストリップでカバースリップを使用して、昆虫の1つを固定します。顕微鏡下で。

ターゲットセンサーをその形態と位置で識別し、電極の侵入角度から動物が自由にアクセスできるように向きを変えます。次に、タングステンワイヤーを背側胸部に挿入します。接地電極として機能するには、先端からのガラス電極に目的の刺激溶液を充填します。

先端を押さえながら気泡をはじき出します。電極に銀線を挿入して、記録電極と刺激電極として機能します。その後、電極をプリアンプに接続すると、ニューロンの活動を捕捉するためのセトリング時間を短縮できます。

プリアンプは、電気信号を収集、保存、および分析するためのスパイク録音ソフトウェアを備えたコンピューターに接続されています。次に、制御ソリューションでCentumを刺激して、その機能を確保します。スティミュラス アーティファクトの 200 ミリ秒後から始まるスパイクをカウントします。

用量反応結果を得るため。Centumを実験用化学物質の濃度の増加にさらし、刺激の間に最低3分の間隔を空けて、適切な回復を確保します。この手順では、ドライアイスを入れた浅いクーラーを用意します。

組織採取チューブには、さまざまな種類の組織を採取するための1.5 mL RNAフリースナップキャップチューブをラベル付けします。過度の結露を避けるために、チューブを閉じたままにしてください。次に、マイナス20°Cの冷凍庫で30〜40匹の蚊に15〜30秒間麻酔をかけます。

次に、麻酔をかけた蚊を寒い段階に移し、性別で分類します。昆虫の翅をつかんで背側を下に向け、味の付属器を傷つけないように注意します。解剖顕微鏡下で、ラベルのすぐ近位にある蚊のプロボアを優しくつかむことにより、男性または女性のいずれかの男性または女性からペアのラベルベラまたはタルシを解剖します。

ベラは、内側のスタイラスを露出させ、他の鉗子のペアでラベルを取り外すための鉗子の1対。次に、組織を足根組織用のコールドコレクションチューブに入れます。脛骨と最初の足根骨セグメントの接合部で蚊の足をそっとつかみ、足根骨を取り除きます。

次に、組織を冷たい標識チューブに入れます。0°C遠心分離機で0°C遠心分離機で1分間コレクションチューブを回転させ、チューブの底に組織を保ちます。解剖中に採取チューブに水分が蓄積した場合は、採取した組織を覆って保護するために、50マイクロリットルの冷たいトリオール試薬を追加してください。

液体窒素が入った1.5ミリリットルのチューブラックでチューブを凍結します。その後、組織破壊の前にドライアイスで冷却することにより、ぴったりとフィットするRNAフリーの乳棒を準備します。次に、ティッシュを微粉末に粉砕し、もう一度繰り返します。

トリオールの総量を1ミリリットルにして復活させます。ボルテックスにより、地上組織を懸濁します。その後、粉砕組織に200マイクロリットルのクロロホルムを加え、よく混ぜます。

室温で5分間後、摂氏4度の遠心分離機で重力の11,000倍で15分間回転させます。水層をゲノムDNAフィルターカラムに直接慎重に追加します。次に、重力の11,000倍で5分間回転させます。

同量のRNAを含まない70%エタノールをフロースルーに加え、ピペッティングで混合します。液体をRNAコレクションカラムに移し、RNA抽出を続けます。その後、精密分光光度計で全RNAの純度を定量および評価し、標準的なRNAシーケンシング法に進みます。

エイドのE GTI味覚刺激性イラからの活動電位の微量記録は、さまざまな化学物質による直接刺激の有効性を示しています。この手法は、500ミリ秒未満の妥当な時間範囲で特定の振幅と持続時間のスパイクをカウントすることにより、任意の刺激化学物質に対する応答を定量化するために使用できます。これらの3つのスパイクは、感度の異なる3つの感覚ニューロンサブタイプに対応しています。

RNA-Seqデータセットの生物学的複製は、組織収集のコストや難易度によって制限される場合があります。Q-R-T-P-C-Rは、全遺伝子発現の小さなサブセットを低コストで検証する能力を提供し、必要なソースも少なくて済みます。左パネルに並べて示したRNAは、RN Aeqで決定される相対発現とQ-R-T-P-C-Rで決定される相対発現の比較です。

これら 2 つの方法は、遺伝子存在量の推定に異なるケミストリーに依存しています。右側のパネルにグラフィカルに表示された統計的同等性関数は、各ケースの確実性の限界を示しています。このビデオを見た後、昆虫組織を解剖してRNAを分離する方法と、生きた昆虫の味覚毛からの神経信号を記録する方法をよく理解しているはずです。