酵母Proteinopathyモデルを用いた増強Hsp104のバリアントを分離

次の実験の目的は、タンパク質のミスフォールディング障害に関連するタンパク質の毒性を抑制する変異体の選択について、HS P 1 0 4 ライブラリをスクリーニングすることです。これは、HSP 1 0 4バリアントライブラリを酵母の疾患関連基質と共形質転換し、第2のステップとして2つのタンパク質を発現するcoexによって達成されます。選択された酵母は、HSP 1 0 4プラスミドに対してカウンター選択するために、5つのフルオリューチン酸または5つのFOAで処理されます。

次に、コロニーPCRによって変異原領域を増幅するか、HSP 1 0 4遺伝子の変異を同定することにより、ヒットの配列決定が行われます。最終的には、疾患関連基質の毒性の抑制を評価して、さらなる特性評価に最も有望なHS P 1 0 4変異体を特定することができます。この技術の主な利点は、結合ベースの選択のような既存の方法よりも、この技術により、疾患に関連する基質の毒性を抑制する変異体の選択が可能になることです。

この方法は、タンパク質のミスフォールディングを逆転させる可能性のあるタンパク質を特定することにより、タンパク質フォールディング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法はHS P 1 0 4の増強に関する洞察を提供することができますが、酵母に毒性のある任意の基質の毒性抑制のための任意のタンパク質のライブラリのスクリーニングにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個々の個人は、多くのコロニーが有効なヒットを見つけるためにスクリーニングする必要があるかもしれないので苦労するだろう プロテア毒性抑制のためのスクリーニングは、ラフィノース補充ドロップアウト培地、血清学的ピペットと滅菌木材とアプリケーターでプレートからHSP 1 0 4コロニーを洗い流すことから始める 50ミリリットルの円錐管に液体洗浄を移し、コロニーを徹底的に渦巻いて任意の細胞塊を分離する。

次に、細胞懸濁液をわずかに濁った培養物に希釈し、30°Cで振とうしながらRaffinosドロップアウト培地で細胞を一晩成長させます。このとき、HSP 1 0 4野生型コントロールとベクターコントロールも並行して育てます。次の朝のプレートでは、個々のガラクトースプレートにさまざまな細胞濃度を注入して、単一のコロニーを持つグループごとに少なくとも1つのプレートを生成します。

ベクターとHSP 1 0 4ワールドタイプの培養物をライブラリとプレートのOD600に正規化します。これらの細胞を実験的な菌株濃度と同量にして、選択を評価するためのコントロールに対するライブラリの成長を比較します。ストリンジェンシーはまた、グルコース抑制培地上のライブラリをプレートし、その後、コロニーが細胞の選択のために5つのFOAを使用するように見えるまで、30°Cで2〜3日間すべてのプレートをインキュベートします。これはもはやHSP 1 0 4を発現するプラスミドを維持しません次に、各株からの単一のコロニーを二重に維持します 30°Cでの一晩のインキュベーションごとに、二重および単一のドロップアウト培地プレートに 30°C。

これらのプレートは、プレートの乾燥を防ぐために、後でシーケンシングに使用されます。パラフィルムでSDヒスユーロプレートを包み、摂氏4度でそれらを取り付けながら、5つのFOAスクリーンを実行します。次に、SDヒスプレートから5つのFOAプレート上の単一のコロニーにコロニーをストリークし、単一のコロニーが現れるまで摂氏30度で1〜2日間のインキュベーションを行います。次に。

各5つのFOAプレートから、選択し、縞模様。3つの生き残ったコロニーを、生き残ったコロニーごとに1つのSDユーロと1つのSD hisプレートに、さらに1〜2日間の摂氏30度のインキュベーションの後。HSP 1 0 4プラスミドを失ったコロニーは、SDヒスプレート上では増殖しますが、SDユーロプレートでは増殖しません。

これらの株を96のラフィノースドロップアウト培地で飽和まで成長させます。2ミリリットルのプレートを30°Cで一晩中振とうしながら深く掘り下げます。次に、偽陽性を排除するために、スポッティングアッセイを実施します。

インキュベーションの終わり近くには、ウェルあたり200マイクロリットルのラフィノースドロップアウト培地を新しい96ウェルプレートに分注するためのマルチチャンネルピペットがあり、カラム1と7をきちんとした培養用に予約しています。次に、16の飽和培養物のそれぞれについて250マイクロリットルをプレートの列1および7に分注し、培養物をプレートの各列に5倍ずつ順次希釈し、マルチチャンネルピペットで完全に混合します。次に、均一なスポッティングを確保するために、希釈した培養物をカラム6と12から50マイクロリットル取り出して、各ウェルの最終容量が200マイクロリットルになるようにします。

次に、96ボルトのリプリケーターツールを使用して、SDヒスプレートとエスカルヒスプレートに重複した培養物を見つけます。摂氏30度で2〜3日間のインキュベーションを行った後、エスカルヒスプレートで毒性を示すシーケンシング株を選択します。コントロールの偽陽性株と同様に、コントロールほど毒性がなく、廃棄できます。

また、SDで成長欠陥を示す株は廃棄します。彼のプレートまたはそれは、疾患基質単独よりも大幅に高い毒性を示します。コロニーPCRによりHSP 1、0、4変異体を配列決定するためには、まず、SDヒスユーロプレートから約10マイクロリットルの酵母を3マイクロリットルの20ミリ水酸化ナトリウムに掻き取り、PCRストリップチューブで細胞を凍結融解する。

まず、ストリップをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。冷凍庫で10分間過ごした後、サーモサイクラーでチューブを摂氏99度で10分間インキュベートし、次いで高プライマー濃度のPCRグレードの水で菌株を100マイクロリットルに希釈する。次に、サンプルに対して標準的なPCRプログラムを実行し、次にアゲル電気泳動によってサンプルを分析して、適切なサイズのPCR産物の増幅を確認します。

最後に、突然変異のシーケンシングクロマトグラムを徹底的に分析するように注意しながら、PCR産物のシーケンシングを行います。突然変異は、酵母がしばしば複数のプラスミドを保有しているため、特定の部位に対する2つのヌクレオチドの混合物として観察される場合があります。この代表的な実験では、中部ドメインに無作為に割り付けられたHSP1 0 4変異体のライブラリーを構築した後、そのライブラリーをガラクトース誘導性TDP43発現のためのプラスミドを有する酵母に形質転換した。

次に、形質転換体を回収し、グルコースプレートとガラクトースプレートに播種して、スクリーンのストリンジェンシーを評価しました。ガラクトースプレートからヒットを選抜しました。最初のスクリーニングで選択されたバリアントのサブセットの5つのFOA治療スポッティングアッセイに続いて。選択した4つのコロニーのうち、2つはHSP 1 0 4を示し、TDP 43毒性抑制を媒介したことを示しました。

1つは偽陽性で、もう1つは毒性の増強を示しました。5回のFOA処理に続いて、2つの真のヒットをコロニーPCRによって配列決定し、中間ドメインの変異を同定しました。これらのHS P 1 0 4突然変異は、その後、親HSP 1 0 4プラスミドで部位特異的突然変異誘発によって作製することができ、その毒性抑制を確認するために、この技術を一度習得すると、5つのFOで一度に最大200のヒットをスクリーニングするために使用され、それが適切に行われれば1〜2週間の経過を経るステップである。

この手順を試みる際には、この手順に従ってプラスミドの混合物が得られることが多いため、シーケンシング結果を慎重に分析することが重要です。蛍光顕微鏡などの他の方法を実行して、HSP 1 0 4変異体が疾患関連基質の凝集にどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、HSP 1 0 4バリアントのライブラリーをスクリーニングして毒性サプレッサーを選択する方法についてよく理解できるはずです。