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脊椎動物がもつ複雑な神経系の構造は、細胞の増殖、遊走、形態学的変化といった一連のプロセスを経て形成されていきます。これらのプロセスを研究することは、神経系機能についての理解と発達異常に起因する疾患の診断と治療につながります。しかしながら、特に哺乳動物の胎児がもつ神経組織へのアクセスは非常に難しく、実験操作を加えることが困難です。そこで、組織培養が利用されるようになりました。「器官培養」と呼ばれる培養法は、細胞構造を維持したまま生体から組織を取り出して実施し、神経発生過程を調べることができます。一般的に組織培養とは、神経組織を丁寧に分離し、実験に最適な栄養培地中で行うin vitro実験です。
このビデオでは、神経組織培養法の概要と他のin vitro実験より優れている点、そして健康な組織を維持するための注意点を解説しています。それからマウス胎児の脳を用いる組織培養の一般的なプロトコルを紹介しています。ここでは、母親からの胎児の単離や脳の解剖についてご覧いただけます。また、神経系組織を薄くスライスすることで成長している細胞がより視覚的に観察できる「スライス培養」についても解説しています。最後に、このテクニックを用いた神経発生研究例をご覧いただけます。
組織培養は特定の細胞集団や神経構造の発生を調べるためのテクニックとして利用されます。胎児から神経組織を切り出し培養することで生体外でも発生を継続させることができます。この培養法を用いるとin vivo実験では不可能な発生中の組織の操作および観察が可能となります。このビデオでは、組織培養を行う際の注意点と2種類の組織培養法のプロトコル、そしてこのテクニックのアプリケーション例を紹介していきます。
詳しい手順の前に、基本原理を簡単に解説しておきます。
組織培養法で、多くのモデル生物の様々な臓器や組織を体外で培養することが可能となります。
一般的な手順は、まず胎児から神経組織を丁寧に取り出し、それから目的の部位を切り出して人工的に培養します。
組織を薄く切り出したスライスを用いる培養法を「スライス培養」。また、 生体内環境を模倣した状態で 器官全体を用いて行う培養法を「器官培養」と呼びます。
開始前に使用する器具を70%エタノールで消毒しておきます。次にラボのマニュアルに従い妊娠マウスを安楽死させます。そして子宮を取り出し氷冷したバッファー中に入れておきます。ディッシュを解剖顕微鏡に移動させ、卵黄嚢から胎児を取り出します。次に、脳を単離し目的の部位を慎重に切り出し培養液の入ったディッシュに移します。
その後は37℃、CO2濃度5%で2〜3週間インキュベートし、その間2〜3日おきに培養液の50%を交換して下さい。
脳のスライス培養にはさらに数ステップが加わります。セクショニング前に、脳をアガロースに包埋し、組織を補強することでスライスするときに崩れににくくなります。
まずはアガロースが溶解するまで温め1.5%低融点アガロース溶液を調製します。次にアガロースを型に流し込み、組織の損傷を避けるために少し冷まします。
その後組織をゆっくりとアガロース中に沈めたら、固まるまで待ちます。
できあがったブロックを試料台に固定しビブラトームを使ってセクショニングしていきます。
これは刃を振動させることで生体組織を薄くスライスできる装置です。作製したスライスを培養液を入れたコーティングプレートに移し前述の通りインキュベートします。
組織培養をin vivoおよび in vitro実験に適用するメリットはたくさんあります。第一に体外へ分離された組織は様々な実験に適応しやすいことです。また、取り出してきた神経組織を用いることで、神経が発達している段階での複雑な細胞間の相互作用を研究できます。
さらに培養液の組成を調製できるため、組織片を利用して特定条件下での組織発生への影響を調べることができます。
しかしながら、自然な環境から取り出された組織は、その機能を維持するために特別な環境が必要になります。細胞外マトリックス又はECMは細胞の活動に影響を与える重要な因子であり、精製したECMたんぱく質は培養ディッシュのコーティング剤としてよく利用されます。
もう一つ注意しておきたいのが、組織片を浸す溶液です。一般的には細胞培養液が用いられますが、中には神経系を循環する体液に近い溶液を必要とする実験もあります。例えば、脳脊髄液はこのビデオに登場する実験系にとってとても重要な試薬となります。
組織培養法について学んだところで実験例を見ていきましょう。
細胞遊走の実験では組織片を利用し神経細胞の移動に関わる反発性および誘引性シグナルの研究が行われています。ここでは前もって成長因子に浸しておいたビーズを脳組織片の後ろ側に移植し神経細胞の遊走を調べています。
そして3〜4日後に共焦点顕微鏡を使って神経のイメージングを行います。運動神経細胞は血管内皮増殖因子がついたビーズに向かって遊走しますが、そうでないビーズの方には遊走していないことが分かります。
共培養法を利用して発生中の細胞間の相互作用を明らかにすることができます。ここでは、脊髄分節を筋細胞層の上で培養し脊髄運動ニューロンと骨格筋とのつながりを調べています。
早ければ培養後2日で、神経から突起が伸びているのが観察できます。
そして5日以内には筋細胞層の収縮を調整する神経ネットワークが構築されるのが確認できます。
神経系で発達中のニューロンは軸索を伸長し、目的組織と中枢神経系のネットワークを形成していきます。この複雑なシステムを研究する手段の一つは、軸索ガイダンスの解析です。組織片を用いた実験により、軸索を適切な場所へと誘導する神経由来因子およびその周辺の因子を明らかにすることができます。
ここまで組織培養についてご覧いただきました。このビデオでは組織培養の利点、培養方法、2種類の一般的なプロトコルと組織片を取り出す手順、そしてこのテクニックを利用した今日の研究を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。
外植片培養は、特定の細胞集団や神経構造の発達を調べるための技術として役立ちます。発生神経科学の実験では、外植片は、in vitroで継続的な発生のために胚から切除された神経組織です。これらの培養物により、研究者は、生体内では不可能な方法で発生中の組織を操作し、視覚化することができます。このビデオでは、外植組織の取り扱いの背後にあるいくつかの重要な原則、外植片培養への2つのアプローチの段階的な手順、およびこの技術の応用を紹介します。
方法を掘り下げる前に、いくつかの基本原則を確認しましょう。外植片は、多数のモデル生物および様々な組織タイプから確立することができる。一般に、培養物は、胚から神経組織を慎重に取り除き、関心のある領域を解剖し、人工環境に置くことによって作成されます。
組織は、薄いシートに切片化して「スライス培養」で成長させることもできます。培養環境は臓器全体の生体内条件を模倣するように設計されているため、この培養戦略はしばしば「器官型」と呼ばれます。
始める前に、必ず70%エタノールで器具を滅菌してください。次に、研究室の好みの方法を使用して妊娠中のマウスを安楽死させます。次に、子宮を外科的に切除し、氷のように冷たい緩衝液に入れます。皿を解剖顕微鏡に移し、個々の胚を卵黄嚢から取り出します。次に、脳を分離し、関心のある領域を慎重に解剖し、培地が入った培養皿に移します。外植片は37で維持することができますか?2〜3日ごとに培地の50%を交換することにより、数週間5%CO2を含むCインキュベーター。
脳組織のスライス培養には、いくつかの追加ステップが必要です。切片作製に先立ち、組織はアガロースに埋め込まれ、組織を支えて、スライス中も無傷のままです。これを行うには、1.5%の低融点アガロース溶液をアガロースが溶解するまで加熱します。次に、アガロースを埋め込み型に移し、組織の損傷を避けるためにわずかに冷却します。
その後、組織を慎重に沈め、アガロースを硬化させます。得られたブロックをトリミングし、標本ステージに接着し、振動するブレードを使用して生体組織の薄いスライスを切断する器具であるビブラートを使用して切片化します。スライスが生成されると、それらは培養培地を含むコーティングされたプレートに慎重に移され、前述のように培養されます。
外植片培養を使用することには、in vivoや他のin vitro法に比べて多くの利点があります。まず、外植組織の細胞は、実験ツールにアクセスしやすくなります。第二に、外植片が発達中の神経組織の複雑な細胞構造を維持しているという事実は、細胞間相互作用を研究することができることを意味します。第三に、培地の化学組成を制御できるため、科学者は外植片を使用して、特定の化合物が組織の発生に及ぼす影響を試験できます。
それにもかかわらず、それは自然環境から取り除かれているため、試験管内で幸せで健康な組織を維持するために特別な注意を払う必要があります。例えば、細胞外マトリックス(ECM)の存在は細胞の挙動に大きな影響を与えるため、精製されたECMタンパク質は培養皿のコーティングによく使用されます。もう一つの重要な考慮事項は、外植片が入浴する溶液です。従来の細胞培養培地がよく使用されますが、一部の実験では、中枢神経系を循環する液体によく似た溶液、つまりこれから見るような実験で重要な試薬である脳脊髄液が必要です。
さて、外植片の培養方法を見てきましたが、これらの技術がどのように使用されているかを見てみましょう。
細胞遊走アッセイは、外植組織を使用して、神経細胞の運動に関与する反発性シグナルと引力シグナルを調べます。この実験では、以前に成長因子に浸したビーズを後脳外植片に埋め込むことで、神経細胞の遊走を調べます。3〜4日間の曝露後、ニューロンを共焦点顕微鏡を用いて画像化した。その結果、運動ニューロンは血管内皮増殖因子に浸されたビーズに向かって移動するが、緩衝液に浸されたコントロールビーズは移動しないことが示されました。
共培養アッセイは、開発中の細胞間相互作用を調査するためによく使用されます。この例では、脊髄のセグメントを筋肉細胞の層の上で培養し、脊髄運動ニューロンと骨格筋の間の接続がどのように作られるかを調べました。インキュベーション後2日という早い時期に、ニューロン(神経突起とも呼ばれる)からの突起が外植片から出現するのが見られます。5日以内に、筋肉細胞層の収縮により機能神経支配が観察されます。
神経系の発達中、ニューロンは軸索を伸ばして、標的組織と中枢神経系との間の接続を確立する必要があります。この複雑なプロセスを研究する1つの方法は、軸索誘導アッセイを使用することです。研究者は、外植組織を使用して、軸索を適切な位置に導くのに役立つニューロン内および周囲の環境の要因を調べます。
JoVEの神経組織の外植片培養のガイドをご覧になりました。このビデオでは、外植片培養の利点、培養戦略、一般的に使用される2つの外植片手順の段階的なプロトコル、およびこれらの技術が今日の研究室でどのように使用されているかについて概説しました。
ご覧いただきありがとうございます!
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