Name: in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ昆虫病原線虫のin vivoおよびin vitro飼育技術。アオバネゴキブリ幼虫を用いた生体内培養と、肝臓・腎臓寒天培地を用いた生体外培養の両手法を解説。これらの方法は生物防除研究や共生細菌との相互作用解析に応用可能です。

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これらのプロトコルの多くの改善への貢献のために明ミン·リー、キャスリンPlichta、ビクトリアミランダ·トンプソンとサム·キュッキム：著者は、在庫ラボの過去のメンバーに感謝したい。この作品は、SP株に国立科学財団の助成金IOS-0840932およびIOS-0724978によって部分的に資金を供給された

彼らのSymboitic細菌と昆虫病原線虫の1。 インビボ飼育<ol><li> 100×15ミリメートルのプラスチックシャーレを反転し、皿のふたにろ紙（90ミリメートル）の2つのディスクを配置します。 </li><li>均等に濾紙上（1,000〜2,000 IJ / mlの濃度で）IJ（感染少年）水懸濁液1mlを分配する。 注：IJSは表面殺菌する必要はありません。 </li><li>皿に大きなwaxmothのハチノスツヅリガの10終齢幼虫を追加します。目標は、約100〜200 IJS /幼虫を提供することにある。 </li><li>ペトリ皿（ 図1）の底部とふたをカバーし、ペトリ皿にラベルを付ける。以下の情報に言及：線虫種名（既知の場合）;コー​​ド/指定を隔離する。日付感染トラップが設定されました。 </li><li> （水分を節約するために）緩く密封されたビニール袋の中に皿を置き、どちら室温または20〜25℃の間のインキュベーター内で暗所に保管してください。毎日の料理をチェックする 注：それは土壌中に自然感染状態を模倣として闇は、線虫の感染を容易にします。 </li><li> 3〜5日後に、変更されたホワイトトラップ7への線虫感染の兆候で死体を取り除く。 注：死体が腐敗の臭い場合、これは培養が成功しなかった、および/または汚染があったことを示す可能性があります。線虫および昆虫の新しいバッチで新しい感染室を設定します。 </li></ol>彼らの共生細菌を持つ昆虫病原線虫の2 のin vitro飼育<ol><li>肝臓、腎臓天法9,19 <ol><li>小片（2 cm 3程度以下）に肝臓と腎臓をみじん切りにし、NaCl、寒天と水300mlでブレンダーに入れ、肉が液体パルプ、濃厚なペーストやピューレになるまでブレンドする。その後、1 Lの三角フラスコに移し、混合物。 </li><li>ブレンダー容器に水の最終200ミリリットルを加え、中に残っているメディアをデカント三角フラスコ。 121°Cで15分間オートクレーブ。許可オートクレーブ後の寒天注ぐ前に触れて冷却する。 注：この培地は、肉の塊を持っている傾向があるため、媒体のピペッティングは推奨されません。 </li><li>手の攪拌または間の三角フラスコを旋回がより均質なメディアに注ぐながら5（または6）cmのペトリ皿に寒天〜20ミリリットルを注ぐ。必要になるまで寒天は4℃で固化し、店の食器を許可する 注：ペトリ皿に注ぎ、肉のいずれかの大きな塊を破壊する火炎滅菌金属スパチュラを使用してください。 </li></ol></li><li>脂質天法9,19 <ol><li>栄養ブロス、寒天及び酵母エキスを一緒に混合することにより、脂質寒天培地を準備し、2リットルの三角フラスコに混ぜ注ぐ。 121℃で15分間、H 2 OおよびMgCl 2•6H 2 O、オートクレーブ蒸留追加。 </li><li>コー​​ン油、コーンシロップミックスの無菌ミックスを加え、攪拌または均等に油滴を分散させるために積極的かつ頻繁に渦巻く。 <br/&gt;注：UVクロスリンカーに必要な容積を配置することによって、コーン油及びシロップを滅菌する。オイルが液体に溶解するが、それは小さな液滴中にあることを確認することはありません。 </li><li> 5（または6）cmのペトリ皿上に〜20ミリリットル寒天を注ぎ、必要になるまで寒天4℃で固化し、店の料理をすることができます。 </li><li>ストリークは、脂質寒天プレートに共生細菌を希望し、24〜48時間、28℃でプレートをインキュベートする。 注：一晩（12-16時間）のLBサブカルチャーの100〜200μlのスプレッド。 </li><li>翌日は、約0.4ミリリットル表面殺菌し、線虫懸濁液（卵や感染少年）のを追加し、暗いまたは22±3℃のインキュベーター内で、室温でプレートをインキュベートする。 注：それは、線虫の成長に好ましくない過度に湿潤環境を作成することができますように線虫懸濁液を超える0.4ミリリットルを追加しないでください。 </li><li>毎日文化を監視します。培養物は、約12日間（ 図2）にIJSの新世代を生成する必要があります。</li><li>線虫が変更ホワイトトラップにディッシュ（ 図3A）の側面をクロール見ているときIJS（ 図3B）を収穫する（オロスコら 12参照）寒天でボトムディッシュを転送します。メディアの汚染を減らすために、層流フードの下に、この手順を実行します。 </li><li>出現時に変更されたホワイトトラップからIJSを収集し、あらゆる媒体破片を除去するIJサスペンションをすすぐ。ストア（コールド温度インキュベーターまたは低温室）で10℃での滅菌蒸留水にIJまたは必要に応じてすぐに使用しています。 注：研究の目的に応じて、シンビオント·保菌またはaposymbiotic線虫のいずれかでプレートをシード。 </li></ol></li></ol> 3 インビトロ Aposymbioticの飼育（共生フリー）昆虫病原線虫<ol><li> 10-20 G.に感染希望線虫種のIJSとmellonella幼虫 （セクション1を参照）。 3または4日後（この時点でIJSは成熟しているはず第一世代の成人に）死体を収集します。 注：卵の適切な数を得るために必要な雌の成熟度と数に時間が種によって異なります。より多くのGを感染させるmellonella幼虫必要であれば、彼らは右の発達段階にあるかどうかを評価するために、早ければ48時間後に感染症などの解剖を開始します。 </li><li>生理食塩水（M9バッファ18）とのペトリ皿に個別に死体を置きます。先端の細い鉗子で頭を引いて、死体を解剖。 </li><li>細い針（好ましくはL字型）で、少なくとも20（内側卵）妊娠、女性を集め、M9バッファー（ 図4A）の10ミリリットルを含む時計皿に置いてください。 </li><li>以下の成分を考慮してaxenizing溶液を調製：蒸留水6.75ミリリットル、1.25ミリリットル5NのNaOH、および2.25ミリリットルの市販の漂白剤溶液を3％の次亜塩素酸を希釈した。 注：NaOHを塩基性溶液、手袋、ゴーグルや他の適切な保護である衣服は着用してください。 注：漂白剤は、光の中で分解する、新鮮なaxenizing液を毎回準備します。 axenizing液のいくつかのバッチを用意し、複数の時計皿に卵の表面殺菌や収穫を行う。 </li><li> M9バッファは緩衝液で時計皿を充填し、ピペットを用いてバッファを吸い取って、女性には少なくとも3回洗浄します。女性は時計皿に残っていることを確認します。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>すぐにaxenizingソリューションを追加し、女性は10〜15分を超えないために、この溶液中に残存することができます。 （axenizing液に抵抗性である）卵は無傷のままでいる間に崩壊し始めて線虫の組織を観察します。 </li><li>手動で針またはメス（ 図4B、C）でそれらを切断することによって、プロセスをスピードアップするために女性の身体を破壊する。未溶解組織を加える避け、1.5mlのマイクロチューブにそれらをピペッティングすることにより、卵を除去します。 注：Mとして使用卵を収集し、卵の生存能力として、迅速に作業するために、必要に応じて、任意のマイクロチューブはaxenizing溶液への曝露の長期間にわたって減少します。 </li><li> 「高速設定」を使用して15秒間ボルテックスチューブは、更に、卵に付着線虫組織を除去した。別の方法として、渦が利用できない場合、解決策を上下にピペットを数回。 </li><li>で約18000グラムで2分間の遠心分離によってペレット卵。卵は十分にペレットされない場合は速度を上げてください。 axenizing液を取り出し、1分間900×gで滅菌蒸留水と遠心機1のより多くの時間をマイクロチューブに充填することにより二回すすいでください。 </li><li>最後の洗浄後、滅菌蒸留水300〜500μlの卵を再懸濁し、滅菌3センチメートルペトリ皿または滅菌時計皿に置いてください。卵は今表面殺菌であることを忘れないでください、そう卵の清浄度を維持するために、滅菌ピペットおよび/またはpippetterのヒントや水を使用しています。 </li><li>彼らは（ 図4D）は無傷であることを確認するために解剖顕微鏡（30-50X倍率）の下で卵を調べ、肝臓、腎臓寒天と5cmのプレートに移す（セクション2.1を参照） 注：それは寒天が過度に濡れになりますので、プレート上の卵の懸濁液の400以上のμLを追加しないでください。 </li><li>適切な情報をラベルプレート、28℃の暗所で直立に格納します。卵の孵化することは明白で、一晩でなければなりません。 注：水は皿の蓋の上に凝縮することがありますが、それは1日または2日後に蒸発する。この時、寒天の水分を保持し、その乾燥を避けるために、ビニール袋に皿を置く。 </li><li>定期的に料理を守り、真菌や細菌汚染の兆候を示すあらゆる料理を捨てる。 IJSがペトリ皿の壁を移行見たら、ふたを取り外して、修正されたホワイトトラップ12に寒天でボトムディッシュを転送します。 modifieに皿を転送する際に、無菌状態を考慮してくださいdはホワイトトラップが露出メディアの汚染を回避する。 </li><li>必要に応じてホワイトトラップと収穫IJの​​監視を続けます。 注：Aposymbiotic線虫は何日あっても数週間ホワイトトラップの水の中に移動していきます。 </li></ol>

<ol><li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.%2C+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes%2C+Neoaplectana+and+Heterorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li>
<li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Nematol%22%5BJournal%5D)">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li>
<li>Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+N+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Prokaryotes%22">The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).</li>
<li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+%28Diptera%29+and+Galleria+mellonella+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control.+Boca%22">Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca</a>. , CRC Press. Raton, FL. (1990).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Manual of techniques in insect pathology</a>. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoppenh%C3%B6fer%2C+H+%22Entomopathogenic+Nematodes%3A+Systematics%2C+Phylogeny+and+Bacterial+Symbionts%22">Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts</a>. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).</li>
<li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li>
<li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae%2C+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+%28Steinernematidae%3A+Nematoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li>
<li>Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+%28Achromobacteriaceae%3A+Eubacteriales%29+associated+with+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Bull.+Bacteriol.+Nomencl.+Taxon%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li>
<li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila%2C+its+nematode+vector%2C+and+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li>
<li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernema%29+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+%28Xenorhabdus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li>
<li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).</li>
</ol>

利害関係が宣言されていない。

適当な宿主を使用すると、EPNの生体内で飼育することに成功するための重要な要因である。通常、両方steinernematidsとheterorhabditidsを再現することができますし、正常に高いワックス蛾、 ハチノスツヅリガ （鱗翅目：メイガ）の幼虫で、そのライフサイクルを完了。しかし、異なるファミリーおよび/または指図から他の昆虫種が考えられる。現在記載され線虫種のいくつかは、特定の昆虫宿主に対する特異性を有することが知られている。例えば、S. kushidaiとS. scarabaeiは鱗翅目の幼虫に非常に病原性はなく、そのような実験室で成功した飼育用のコガネムシの幼虫（コガネムシ科）などの甲虫の幼虫を必要としています。別の種、S. scapterisciは、コオロギやケラなどの直翅目の昆虫を好む。 適切なホストが使用できないか、実験条件は、それを必要とする際に、 インビトロ法は、EPの飼育のために使用することができる場合にはN.これらの方法は、線虫...

昆虫病原性線虫（EPN）SteinernemaとHeterorhabditis属 。 （Steinernematidae、Heterorhabditidae）とそれらの細菌の共生、XenorhabdusとのPhotorhabdus属（腸内細菌）が陸生動物-微生物共生関係2-4,6,10,19。XenorhabdusとのPhotorhabdus属の創発モデルと考えられている。また、感染性若年性（IJ）として知られている線虫の唯一の自由生活段階、または第3段階感染幼若8,10,13の腸内に共生として保有されている。細菌線虫ペアは昆虫の広い範囲の病原性であり、成功裏に6,8、世界中の生物学的制御と統合された害虫管理プログラムに実装されています。 ここで私たちは、生体内で 、頻繁に実験室条件下でEPNの飼育のために行使されたインビトロ技術での選択を示している。 私をnは、生体内の方法は、線虫の飼育用の昆虫宿主を企図している。通常、さまざまな昆虫の受注（ すなわち鱗翅目 、 甲虫目 、 双翅目 、 等 ）の未成熟な段階は、適切なホストとみなされます。メソッドは、通常、実験室での線虫の培養物の維持のために考慮されるインビボ 。線虫の量産を考慮した場合、この方法は適切でないかもしれない。昆虫宿主の大量のは、より多くの時間と昆虫飼育に関連する追加費用を要求して、この目的のために必要な場合があります。 昆虫病原性線虫には、いくつかのメディアに対してインビトロで培養することができる。研究の目的に応じて、 インビトロ法で 、またはメディア内共生細菌の混入を考慮することができる。この発表では、EPNの伝播のための2つの一般的に使用される方法が記載されている。培地の成分は、共生細菌aの栄養素の供給源を提供ND線虫用のステロール源。 インビトロ法は、昆虫宿主なしで優位にEPNの飼育を提供します。 適切な昆虫宿主が利用できない場合、もともと開発されたインビトロでのメディアの多くは、EPNの乗算のために使用した。しかし、過去数年間にわたり、in vitroでの飼育方法が広くEPNとその共生細菌17,19間の共生関係を理解することを目指して研究に採用になっている。 このプレゼンテーションで詳述技術は、さまざまな著者によって記載され、証券研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）によって洗練ものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">In vivo 感染症</td></tr><tr><td>100 x 15 シャーレ</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>濾紙、9 cm グレード 1 セルロース</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>グレード 1 濾紙推奨</td></tr><tr><td>昆虫ホスト</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Galleria mellonella推奨</td></tr><tr><td colspan="4">肝臓腎臓寒天培地用(500ml用)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm シャーレ</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>牛レバー、50 g</td><td>地元産、肉屋またはスーパーマーケット</td><td></td><td>残りは冷凍および解凍して将来の使用のために保存することができます</td></tr><tr><td>牛肉腎臓、50 g</td><td>地元産、肉屋またはスーパーマーケット</td><td></td><td>残りは、将来の使用</td></tr><tr><td>のために冷凍および解凍して保管できます塩化ナトリウム 2.5 g (0.5% 最終濃度)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>任意の研究グレードの NaCl を使用できる</td></tr><tr><td>寒天、7.5 g (1.5% 寒天、最終濃度)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>任意のメディアグレードの寒天</td></tr>を使用できる <tr><td>500 ml 蒸留 H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">For Lipid Agar (for 1 L)</td></tr><tr><td>100 x 15 シャー</td>レ <td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>栄養ブロス、8 g</td><td>BD / VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr>酵母<tr><td>抽出物、5 g</td><td>EMD / VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム六水和物10 ml(0.2 g / ml)</td><td>EMD / VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr>コーン<tr><td>油、4 ml</td><td>任意のブランド</td>地元<td>産、スーパーマーケット</td><td>コーン油の任意のブランドを使用できます</td></tr><tr><td>コーンシロップ、96 ml 7 ml コーンシロップを 89 ml 加熱 H2O と渦巻き模様で均質性</td><td>Karo</td><td>地元産; スーパーマーケット</td><td></td></tr><tr><td>寒天、15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>任意のメディアグレードの寒天</td></tr>を使用できます <tr><td>蒸留 H2O、890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（steinernematidaeとheterorhabditidae）

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

昆虫病原性線虫（EPN）（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）は 、腸内細菌科にグラム陰性ガンマプロテオバクテリアと共生のパートナーシップを持っている。 フォトルハブダスは heterorhabditidsの共生している間Xenorhabdus細菌がsteinernematids線虫に関連付けられています。一緒線虫や細菌は親密で、特定の提携で昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体を形成する。ここで、私たちは、生体内で 、一般に実験室条件下で、これらの線虫の飼育に使用されるインビトロ技術で実証している。さらに、これらの技術は、EPN培養の確立に成功するための重要なステップを表し、また、研究のために、これらの生物を利用する他のバイオアッセイの基礎を形成する。 aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の生産は、多くの場合、深いと共生の研究に多面的なアプローチのために重要である。このプロトコルは、抗生物質の添加を必要とせず、標準的な実験装置を用いて短時間で行うことができる。貯蔵におけるそれらの生存が使用される種に依存して変化し得るが、このようにして製造線虫は、比較的ロバストである。このプレゼンテーションで詳述技術は、P株価の研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）により、さまざまな著者によって記載され、洗練されたものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。

in vivoでの飼育方法は、線虫の成長と再生のための宿主としてのライブ昆虫を使用しています。感染室は昆虫のIJSを露出させるための効率的な方法である。これは別の昆虫宿主から細菌共生ベクトル線虫のライフサイクルにおける唯一のステージである。1は感染室だけでなく、このチャンバーを構築するために必要な材料のために設定示しています。 インビトロ飼育方法を許可EPN昆虫宿主なしで成長するだけでなく、aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の飼育のために実装されています。 図2を参照すると、別の線虫のステージを有する脂質寒天プレートを示している。寒天プレート脂質はまた、生物種の概念に基づいて、線虫のアイデンティティを検証するために必要とされるクロスハイブリダイゼーション試験において考慮することができる。肝臓、腎臓寒天法は、もともとPoinar·トーマス（1966）14によって記載された。この方法では、線虫が成熟しreproducすることができます昆虫宿主なしで、電子とその共生細...

このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

この手順の全体的な目標は、腸内病原性線虫の飼育のためのin vivoおよびin vitro技術を実証することです。in vivo法は、最初にオオオガリアメラノーマの幼虫を感染性の幼虫またはIJ懸濁液でインスターインキュベートすることによって達成されます。次に、線虫に感染した死体を改造したホワイトトラップに移して収集できるようにします。in vitro培養法は、まず肝臓、腎臓、脂質寒天板を修復し、目的の共生菌を縞状に抽出して行います。次に、IJ懸濁液をプレートに加え、線虫を成長させます。最後に、寒天皿を改変された白いトラップに移し、線虫を収穫します。最終的に、これらの技術はEPN培養の確立に成功し、これらの生物を研究に利用する他のバイオアッセイの基礎も形成します。本発表で紹介したinbivo法およびin vitro法は、病原性線虫の研究だけでなく、ProCardとeary interactionsの理解を目的とした幅広い実験にも活用できます。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるジョン・マクマレンです。腸内病原性線虫の生体内飼育を開始するには、100×15ミリメートルのプラスチック製シャーレを反転させ、ディッシュの蓋に2枚の濾紙を置き、感染性の幼体またはIJ懸濁液1ミリリットルを均等に分配します。濾紙に、オオアオワガガガリアメラノーマの星の幼虫の最後の10個を皿に加えて、約100〜200個のIJsパル溶岩を作成します。蓋をシャーレの底で覆い、ラベルを付けます。次に、皿をビニール袋に入れ、ゆるく密封し、摂氏20〜25度の暗闇でインキュベートします。3〜5日後、線虫感染の兆候がある死体を改変された白いトラップに移し、線虫を細菌でin vitroで飼育するための肝臓腎臓法を実施します。肝臓と腎臓を細かく刻み、塩化ナトリウム寒天のブレンダーに入れ、肉が液体パルプ、濃厚なペースト、またはピューレになるまで300ミリリットルの水をブレンドします。混合物をマイヤーフラスコに移し、200ミリリットルの水を使用してブレンダー容器をすすぎます。メディウムをフラスコにデカントします。混合物を摂氏121度で15分間オートクレーブします。約20ミリリットルの寒天を5〜6センチメートルのシャーレに注ぎ、寒天を固めるのを待ってから、必要になるまで摂氏4度で皿を保管します。脂質寒天法ストリークを用いて線虫を調製するには、所望の共生細菌を脂質寒天プレート上に作製し、プレートを摂氏20〜25度の暗所で24〜48時間インキュベートする。翌日、卵または感染性の幼体のいずれかで構成される表面滅菌線虫懸濁液の約0.4ミリリットルで、プレートを室温で暗所またはインキュベーター内で摂氏23度±3度でインキュベートします。IJの生成については、培養を毎日監視し、約12日後に発生するはずです。線虫が

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

間の共生を研究するために、...

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

昆虫病原性線虫、昆虫の広い範囲に寄生する土壌に生息する回虫です。それぞれ、土壌サンプル、感染昆虫死体から線虫の回復のために、昆虫苦しませると変更されたホワイトトラップ：我々は2つ​​の技術を使用した土壌からこれらの線虫を分離するために使用されるサンプリング方法を示しています。...

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

野生 のカエノルハブディティス...

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。...

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

本稿では、昆虫病原性線虫(EPN:昆虫寄生)線虫であり、新たな遺伝モデルである Steinernema hermaphroditum におけるCRISPR-Cas9媒介ゲノム工学を実証しています。この技術は変異体の作成に有用であり、相利共生および寄生共生に関連する線虫生物学の遺伝子機能の解明を可能にします。...

CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

私たちは、生物殺虫剤として昆虫病原性線虫を大量増殖させるための農家向けの2つの方法を提案します。最初の方法はポリアクリルアミドゲルを線虫培養基質として使用し、2つ目はポリマーコーティングされた綿を培養基質として使用します。いずれの方法も昆虫死体内で線虫の生 体内...

昆虫病原性線虫の栽培者ベース in vivo 増殖

灌流細胞化は、臓器の細胞外マトリックスの組成とマイクロアーキテクチャを保持する全体の肝臓の足場を生成する新規な手法です。ここで、肝細胞で灌流細胞化およびその後の再投入を使って臓器全体の足場を準備する方法について説明する。機能性と移植肝移植は、このテクニックを使用して生成することができます。...

全肝臓の細胞化とRecellularization

金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。...

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。...

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

そのまま孤立ランゲンドルフ灌流マウス心臓における本論文では詳細解剖の手順を、楽器のセットアップ、および実験条件膜電位の光学マッピング（VM）の間と細胞内カルシウムトランジェント（CAT）。...

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

学ぶ昆虫病原線虫のin vivoおよびin vitro飼育技術。アオバネゴキブリ幼虫を用いた生体内培養と、肝臓・腎臓寒天培地を用いた生体外培養の両手法を解説。これらの方法は生物防除研究や共生細菌との相互作用解析に応用可能です。

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

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