Name: 網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶブタまたはウシの網膜から感光体外側セグメントを超遠心分離で精製する方法。網膜色素上皮細胞の貪食アッセイに必要な大量のPOSを調製し、-80℃で長期保存可能です。

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この作品は、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ジュンヌChercheuses / EFNへジュンヌChercheurs）、財団VOIRらEntendreと財団ベッテンコートSchueller（EFNに若手研究グラント）、センター国立デラルシェルシュ科学研究（CNRS、EFNのための恒久的な位置）によってサポートされていました、および国立衛生研究所の国立眼研究所（SCFにR01-EY13295）。さらに、研究所·デ·ラ·ビジョンは、デ·ラ·サンテらデ·ラ·ルシェルシュMédicale、大学ピエールマリー·キュリー·パリ6、センター国立デラルシェルシュ科学研究やデパート·ド·パリ研究所国立によって資金を供給されている。

このPOS分離実験は時間がかかり、POSは保存前標識されている場合は、完了するために12時間まで必要な場合があります。プロトコルは、1987年31でRSモルデイらによって発表された論文から適応し、1997年10でSC Finnemannらによって修正されている。 動物は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科（ARVO）計算書の研究のための協会による取り扱った。プロトコルは大学ピエールとマリー·キュリー·パリ06とフォーダム大学施設内動物管理使用委員会から見直し、チャールズ·ダーウィン倫理委員会によって承認された。 1.一般セットアップ<ol><li>できるだけ早く屠殺した後、新鮮な80新鮮な豚や牛の目を入手して、暗闇の中で冷蔵保管してください。会社が同じように進行するようにプロバイダに指示を与える。このプロトコルは、80の目のために最適化されています。へもっと目を進め、より大きな株式を取得する（ 例えば、160目から）、ソリューション量を倍増し、超遠心分離の2ラウンドを行う。プールのサンプルは、後の収集ステップ（ ステップ2.2.2を参照）。 </li><li>赤いセーフライトランプ、吸収パッドはベンチに設定し、（ 材料表 ） を拭き取る。廃棄物収集（未使用の眼の部品、ガラス質の...）のために15cmの皿とバイオハザードバッグを準備します。タイトフィットlabcoat、手袋、スリーブプロテクタとゴーグルを着用してください。 </li><li>注意事項： <ol><li>すべてのソリューションは、すべてのステップの間に冷たいそれらを保つ事前冷やす。できるだけ多くの氷上で冷却目とグラデーションにしてください。 </li><li>視覚色素と光色素の活性型のオレンジ-ピンク色の損失の光退色を避けるために、超遠心分離後の回収工程まで、可能な限り多くの暗闇の中で目や由来の組織にしてください 。 </li></ol></li></ol> 2.プロトコルアクション<ol><li> ソリューションや勾配を準備します。 <ol><li> 37℃の水浴を用いて完全にタウリンストックを解凍する。 </li><li>ストック溶液（ 表1、ストック溶液）からのすべてのソリューションを準備し、各ソリューションのための磁気攪拌機を使用して他の成分で十分にショ糖を混ぜて。 <ol><li> 20％ショ糖の最終濃度に均質溶液15mlを調製し、20 mMのは、2のMgCl 2、10mMのグルコースおよび5mMのタウリンを酢酸pH7.2のトリス。 </li><li> （70％スクロースストックを使用して）、25％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリン、最終濃度25％スクロース溶液を調製する。 </li><li> （ショ糖粉末を使用して）60％のショ糖の最終濃度は60％スクロース溶液を調製し、20mMの酢酸塩pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリントリス。 </li><li> 20 mMのトリス酢酸pHは7.2と5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄1溶液を調製する。 </li><li>ウォッシュ2溶液を準備10％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度にした。 </li><li> 10％スクロース、20mMのリン酸ナトリウムpH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄3溶液を調製する。 </li></ol></li><li>マグネチックスターラー上勾配メーカーを着実にし、60％溶液が挿入される出口に最も近いチャンバー内の攪拌棒を挿入します。適切な鋳造速度を達成するために、チューブの出口に配置されたカットオフP200のピペットチップを使用してください。 </li><li>予備冷却超遠心チューブに各溶液から12ミリリットルを用いて25％の1（80目のためすなわち、合計6管）60％ショ糖溶液を希釈し、攪拌することにより微妙に線形グラデーションをキャストします。よく徐希釈60％スクロース溶液を撹拌した。速すぎてスムーズにしない溶液を注ぐ、勾配流速を安定。 注：連続、線形勾配を得るために、右全体勾配のための溶液の表面にピペットチップ開口部を維持formatioN。 </li><li>勾配が安定化のために約1時間、氷の上に座ってみましょう。ロードされるまで冷やし勾配を保管してください。勾配の破壊を防ぐために、チューブを振らないでください。 </li></ol></li><li> 組織収集： <ol><li>暗赤色灯の下での組織を収集します。片手に目を取り、離れて目を保持しながら、カミソリの刃のエッジと正面を突く（飛散を避けるために、 図1）。 2半分（角膜プラス強膜に少なくとも5ミリメートル）に前方眼球をカットするカミソリの刃を使用してください。レンズを取り外し、それは、このように網膜を露出する1指の先端の上に保持できるように裏返しにアイカップを反転。 </li><li>角度でカミソリの刃を使用して、優しく簡単に取り外しとタペート表面から、ピンクがかった層として現れると視神経乳頭（ 図1）で切断、網膜をこすり。 2×50ミリリットル管氷上で均質化溶液15mlを含む各内のすべての網膜を収集します。 </li><li> 網膜ホモgenization： <ol><li>異なる細胞層を破壊PR細胞、断片POSの残りからPOSを破壊し、網膜の懸濁液を均質化するために、2分間手で激しく懸濁液を振る。 </li><li>大きな組織片を除去し、清潔な50mlチューブ（ 図1）において、フロースルーを収集するために清潔なガーゼの二重層を通して3回濾過する。収量を最大化するために、非常に厚いという網膜の懸濁液は、静かにそれぞれの濾過後に残った断片化された組織を解放するためにガーゼに押します。 </li></ol></li></ol></li><li> 光受容体外側セグメント断片（POS）の分離： <ol><li> 60％ショ糖勾配（ 図1） -各生鮮冷蔵連続25の24ミリリットルを含む超遠心チューブ、チューブあたり7mlの30×6オーバーミリリットルを-優しく6の周囲に、原油網膜の準備を築く。ローターを使用するために、必要に応じて、対向するチューブのバランスをとる。 4℃で50分間の106000×gで超遠心機。 </li&gt; <li>吸引（ 図2A）により勾配の上部3分の1で、オレンジ·ピンクバンド上記溶液の大部分を削除します。ビーカーにカットオフP1000の先端でオレンジ - ピンクバンドを収集します。漂白剤（生物学的な廃棄物）を使用して中和した後、残りを捨てる。 </li><li>氷冷洗浄1溶液の5ボリューム - 〜4で希釈します。必要な数の30ミリリットルチューブに区切ります。 4℃で10分間3000×gで遠心し。注意深く上清を捨てる。 </li><li>上記で詳述したように10ミリリットル中に再懸濁ペレットを10分間3000×gで2溶液とスピンを洗ってください。 15ミリリットルに再懸濁ペレットは3を洗浄し、10分間3000×gで再びスピン。ウォッシュ2に遠心分離前に必要な管の数を減らし、3ソリューションを洗浄するためにいくつかのペレットからの懸濁液を組み合わせる。 </li></ol></li><li> 標識なし等分POS： <ol><li> 20mlのDMEM - 10に再懸濁POS。 490μlのDMEM中で事前希釈10μL（1:50）とに長いだけでなく、旋回POSをカウント細胞計数室（ 図2B）。 mL当たりPOS粒子中の収量と濃度を算出する。 注： - 80ブタの目から8×10 9 POS収率は例えば 、豚/牛や目の大きさの年齢および株にほとんどが異なり、良い準備が5の範囲である。 </li><li>最終DMEM量を決定（典型的には10〜20ミリリットル）および2.5％スクロースの最終濃度を得るためにスクロースを加える。 </li><li> /ウェル40μlの96ウェル実験用の2ミリリットルの再懸濁ボリュームの所望の大きさの分量を準備し、 例えば、チューブ当たり5×10 7 POS。 RTで2300×gで5分間の1アリコートをスピンし、ペレットサイズを評価する。 POSは二回凍結融解されるべきではない別のアプリケーションボリュームのための様々な分量のサイズを準備します。 </li><li>さらに使用するまで-80℃でのPOSアリコートをフリーズします。 注：一定量を何ヶ月も安定している。私たちの手では、未標識または標識POSは少なくとも1年間保存することができる。 </li></ol></li><li> POS標識および分注 ： 注：我々は、典型的には、食作用アッセイの定量化のためにPOSを標識するためにFITCを使用するが、他の染料は、必要に応じて用いてもよい。 <ol><li> 1.4ミリリットルの0.1MのNa 2 CO 3のpH 11.5（ 表2、ストック溶液）で2.6ミリリットルの0.1MのNaHCO 3 pHが8.4を混合することにより、0.1MのNa炭酸緩衝液pH 9.5で2.5 mg / mlの濃度で再懸濁し、1 10mgのFITCバイアル。非再懸濁FITC固形物をペレット化し、最大速度で5分間光とスピンから保護しながら室温で1時間回転させます。 </li><li>ウォッシュ3溶液（またはDMEM）10ml中のPOSペレットを再懸濁し、80目にFITC溶液の2ミリリットルを追加します。 -80℃で凍結残り物FITC保管してください。 RTで少なくとも1.5時間、回転させます。アルミ箔を用いて光から保護する。 </li><li> セクション2.3.4で説明したようにほとんど無料でFITCが上澄みFで見られなくなるまで、その後一度か二度DMEM中で、二回洗浄3溶液を用いて標識POSを洗うraction。 DMEMに再懸濁POSおよび計数及び分注（ セクション2.4）のために、非標識POSのための手順。 </li></ol></li><li> 実験でPOSを使用する： <ol><li>解凍RTでPOS、それらが蛍光標識である場合、できるだけ多くの暗所に保管してください。 RTで2300×gで5分間スピン。上清を吸引除去する。 </li><li>実験によって決定されるように、すぐにアッセイ溶液の適切な容量の懸濁します。 POSチャレンジの異なる時間の場合には、ストアは、数時間の時間点の間暗所でRTにてPOSを再懸濁した。 </li></ol></li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

3段階の条件が最適化された精製のために重要である：収集ステップまでの勾配鋳造の品質と繊細なグラデーション管操作、チルド組織を維持し、暗闇の中で、PRの残りの部分から適切なPOSアイソレーションを得るために、網膜ホモジネートの揺れの強さセル。いくつかの問題が適切にオレンジ色のバンドを見に発生した場合、それらは、上記の3つの理由の1（また結果セクションの第二段落を参照）する可能性が最も高い。 50％スクロース勾配濃度32または33,21のOptiPrepステップ勾配の-特定の条件のいくつかの変形例27のように使用可能である。 いくつかの注意がPOSは二回凍結融解してはならないように、実験用の分量については注意が必要です。したがって、異なるアプリケーションボリュームの様々なサイズを用意することが有用である。 POSプレラベリングは注意して使用する必要があります。共有結合性のラベリングは、共局在の研究を困難にする非常に高い蛍光POSを生成します。また、予...

網膜では、ビジョンは、脳内の視覚野までの神経細胞との間で伝送することができる信号に変換される前に、オプシンと呼ばれる感光性分子の異性化によって誘発される。これらの分子は、光受容細胞の外節部（PRの）を構成するパンケーキに似た膜状ディスクのスタック内に埋め込まれている。光酸化ストレス、したがって、かなりのレベルまで一定の曝露を受けること、PRは、連続的に潜在的な酸化的損傷を制限するために、それらの外側のセグメントを更新する。光受容体外側セグメントは、隣接する網膜色素上皮（RPE）細胞の頂端微絨毛に密着している。 RPE細胞は、血液網膜関門の外側部分を構成し、このようなメラニン色素、光反応性オプシン成分レチナールの再異性化、栄養素を提供するとgを介して光線を急冷などの光受容体の健康と機能1に重要である多数のタスクを確実にPR代謝物処分に参加し、要因をrowth。 また、RPE細胞は、POSを過ごしたとそのコンポーネント、哺乳類の網膜2,3に概日リズムによって調節されている毎日の占領をリサイクルなくす。小屋のPOSのクリアランスは、PRの生存のために絶対に必要である。それが完全に廃止されると、POSの破片が蓄積し、PRSは急速な失明の4,5の原因と縮退。リズミカルなプロファイルが失われ、一定の活動に置き換えている場合は、PRおよびRPE欠陥が6歳に蓄積する。したがって、その機能不全にリンク表現型を理解するために、インビトロでの RPEの食作用の分子の調節を特徴づけるために非常に重要である。興味深いことに、RPE細胞における分子機構は、アポトーシス細胞をクリアするためにマクロファージによって使用されるものと非常に似ており、両方とも、食破片7-9の露出したホスファチジルセリンの認識に依存している。それでも、RPE細胞およびマクロファージがphを調節マクロファージが遭遇時のアポトーシス細胞の即時撤廃を選ぶようagocytosisは異なって、RPE細胞は、リズミカルに外節との永続的な接触にもかかわらず、一日一度だけPOSを巻き込むながら。これは、まだ完全に理解されていない特定の調節メカニズムを示唆している。 RPEの食機械に関与する分子の多くは、孤立したPOSおよび細胞培養食作用アッセイの使用のおかげで同定または検証されています。 RPE頂端細胞表面に位置alphavbeta5インテグリン受容体は、そのリガンドMFG-E8と連携して、その後MERTKチロシンキナーゼ受容体13-15を介して内在化されるPOS 10-12に特異的に結合する。 CD36スカベンジャー受容体は、POS摂取に関与し、その速度16,17に影響を与えることが示されており、POS面18における酸化リン脂質のセンサーとして機能するかもしれない。内在化は、F-アクチン細胞骨格-尻の動員を必要とするそのようなアネキシン2 19、ミオシンII 20とミオシンVIIA 21,22としてociatedタンパク質。 インビトロでのネイティブまたは酸化POSも乏しい消化酸化さPOS 23-28の蓄積に連結されたインビボでの RPE細胞の老化の表現型を理解するために利用される。幹細胞由来のRPE細胞の生成は、それらが動物または患者29,30,27に移植する前に、細胞の機能性を証明するために使用される単離されたPOS用の新しいアプリケーションを開始した。 まず1987年31モルデイらによって記載され、ウシPOSの単離のためのプロトコルは、（11- シスレチナールを運ぶ）無漂白レチナール光色素の特徴オレンジ色の外観の観察と連続ショ糖勾配上の網膜ホモジネートの超遠心分離ステップを兼ね備えています。過去10年間に、狂牛病の危険性を最小限にするために取ら予防のためには、ブタの眼の使用がincreasiとなっているngly目立つ。ここで説明するプロトコルは、ブタまたは等分して、長期間保存することができるウシ目からPOSを大量に取得する方法を示します。これは、POS調製及びアッセイ32,33,21,22当たり多数の動物を使用する必要が齧歯類目からPOSを用意する必要がなくなる。また、蛍光分子を使用して保存前のPOSラベル付けについての詳細は食作用アッセイ32,10の後、標識POSに比べていくつかのアプリケーションのために簡略化し、比較可能な方法でPOSを定量化し、可視化するために、与えられている。したがって、これらの大型株を実験の多くの異なる種類で再現性と使いやすさを可能にする。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Specific 材料/機器</td></tr><tr><td>2チャンバーグラデーションメーカー</td><td></td><td></td><td>30mlチャンバー付きグラデーションメーカー</td></tr><tr><td>3mm径のシリコンチューブ</td><td></td><td></td><td>グラジエントキャスティング用</td>チューブ</tr><tr><td>小型マグネティックスターバー</td><td></td><td></td><td>グラジエントメーカーチャンバーにフィットするスターバー</td></tr><tr><td>赤色セーフライトランプ</td><td></td><td></td><td>解剖用インアクチニックランプダーク</td></tr><tr><td>ウルトラクリア 25 x 89 cm チューブ</td><td>ベックマン</td><td>344058</td><td>超遠心チューブ</td></tr><tr><td>PP オークリッジチューブ</td><td>ナルゲン</td><td>3119-0050</td><td>30 ml 遠心チューブ</td></tr><tr><td>オプティマ LE-80K</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>365668 超遠心分離</td></tr><tr><td>機 SW 32Ti スイングローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369694</td><td>超遠心分離機用スイングローター</td></tr><tr><td>アバンティ J-26 XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>393124</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>JA-25.50 ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>363058</td><td>アバンティ J-26 XP 遠心分離機</td></tr><tr><td>FITC 異性体 I</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>F-1906</td><td>蛍光色素</td></tr><tr><td colspan="4">その他の材料/機器</td></tr><tr><td>計数室 (ノイバウアーやマラセスなど)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓋</td><td></td><td></td>付きダークアイス バケツ<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>スケール</tr><tr><td>マグネチックスターラーと支持極</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigated microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80°;C冷凍庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">消耗品、</td></tr><tr><td>白衣</td><td></td><td></td><td>、健康と安全</td></tr><tr><td>、手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>スリーブプロテクター、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゴーグル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、吸収パッド、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオハザード、ゴミ袋、ゴミ箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weck-Prepブレード</td><td></td><td>解剖</td><td>60mm/2.25インチ幅 カミソリ刃</td></tr><tr><td>15cmプラスチック皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼシート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mlと50mlのチューブ</td><td></td><td></td><td>一般的な消耗品</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

網膜色素上皮（RPE）細胞は、光受容体の外側セグメント（POS）の過ごし熟成末端断片の食作用の重要な機能の一つの分析は、 インビトロで行うことができる。光伝達機構を含む膜状のディスクのスタックを持つ光受容体の外側セグメントは、連続して網膜にリニューアルされている。使用済みPOSは、RPE細胞によって毎日排除される。齧歯類、ブタ/ウシおよびヒトRPE細胞は、同様に、様々な種からのPOSを認識する。小さな変動を用いた実験の大規模シリーズを実行しやすくするために、POSの大きい株式は、ブタの眼から単離し、そしてアリコートで凍結保存することができる。このプロトコルは、暗所に保存するとき、オレンジ色を表示する光色素の特性を利用しています。暗赤色灯の下では、半分にカットしオープンしたアイカップからバッファに網膜収集されます。網膜細胞懸濁液を均質化し、濾過し、そして連続的なスクロース勾配上にロードされる。 CENの後trifugationは、POSを特徴オレンジ色のグラデーションの上部に分離したバンドに位置している。 POSは、次いで、収集紡糸、洗浄緩衝液で連続的に再懸濁し、計数し、等分している。このようにして得られたPOSは、POSチャレンジ後の種々の時点で食作用アッセイおよびタンパク質活性化、局在、または相互作用の分析のために使用することができる。代替的に、POSは、フルオロフォア、 電子 。 グラムで標識することができる。、FITC結合POSまたは飲み込みの後続の蛍光定量に等分する前に。他の可能な用途は、酸化的ストレスまたはRPE細胞の老化の影響を研究するためにストレス条件と組み合わせて改変POSまたはPOSチャレンジの使用を含む。

線形スクロース勾配超遠心分離の組み合わせは、密度による網膜懸濁液の異なる成分の分離を可能にする。ヘビー大きな網膜破片とRPE細胞は、勾配（ 図2A）の底にまたはその近くに沈む。網膜からライターPOSおよび軽量化、個々の細胞または細胞破片を遠心分離期間の終了により勾配の上半分に到達するために別々のバンドとして移動する。遠心分離工程後まで目、暗所でサンプルを保持することによって、POSを含むバンドは直ちに明るいオレンジ色によって認識することができる。このバンドの幅と強度が勾配品質とチューブ高さ（89ミリメートルの高さが好ましい）に依存します。適切に単離されたときの顕微鏡スライド（ 図2B）で観察された場合、通常、POSは直線状または曲がった、細長く表示されます。顕微鏡上の焦点面に応じて、彼らは暗いまたは光沢のあるのいずれかを表示することができます。そうでない場合resus適切に保留、彼らは塊のままになります。彼らは（下の段落を参照）破損している場合、彼らは少し「ほこり」の背景などはるかに小さい部分を、表示されます。 発...

この記事では、ホモジナイゼーションとショ糖勾配遠心分離を用いたブタ/ウシ網膜からの超遠心分離による光受容体外側セグメント断片(POS)の精製のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルにより、標識付きまたは標識なしのPOSアリコートを大量に調製し、-80°Cで保存することができます。

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

この手順の全体的な目標は、戦争の兆候、またはウシの目から精製された光受容体の外側セグメントの大規模なストックを生成することです。網膜色素、上皮細胞、それらのリズミカルな毎日のOC酸活性の最も重要な機能の1つを研究すること。これは、最初に25〜60%のスクロースを超遠心チューブで勾配をキャストすることによって達成されます。次に、ブタまたはウシの目を解剖し、レイを採取して均質化します。次に、reをろ過し、ショ糖勾配にロードし、遠心分離して光受容体の外側セグメントを分離します。最後に、光受容体の外側セグメントを含むオレンジ色の帯は、アリコートに集められたまま保存されるか、またはアリの前にラベル付けされ、引用および保存されます。最終的には、自動蛍光スキャン、蛍光顕微鏡法、または免疫ブロッティングを使用して、細胞株、幹細胞由来の分化細胞、または初代培養のさまざまな条件での食作用活性を研究します。この手法は、各実験で質量や目から自動車セグメントを分離するよりも主な利点は、同じ材料プールを複数の実験に使用できるため、より高い再現性が得られることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、分離された外部セグメントの範囲を調整するため、イオンキャスティングに重要なステップがあるため実用的です。手順を実演するのは、大学院生のセリア・パリーノと、私の研究室の技術者です テキストプロトコルに従って80個の新鮮な豚または牛の目を取得した後、それらを暗闇に置き、できるだけ氷の上で冷やします。視覚顔料の写真退色やベンチに設置されたオレンジピンクの色の損失を避けるために、赤い安全なライトランプは吸収パッドとワイプを点灯します。廃棄物収集用の15センチ皿のバイオハザードバッグとかみそりの刃を準備します。すべての溶液が準備されたら、テキストプロトコルに従って、それらを事前に冷やし、すべてのステップで冷たく保ちます。グラジエントメーカーを磁気攪拌板に安定させ、60%溶液が注がれる出口に最も近いチャンバーに攪拌棒を挿入します。チューブの出口に配置されたカットオフP 200ピペットチップを使用して、各25%および60%のショ糖溶液を12ミリリットルで適切な鋳造速度を達成します。そして、60%溶液を攪拌しながら、あらかじめ冷却した遠心分離チューブに線状のショ糖勾配をキャストし、ピペットチップの開口部を連続的に上昇する勾配溶液の表面に保ちます。ティッシュコレクションを行うには、薄暗い赤色の光の下でぴったりとフィットする白衣、手袋、スリーブプロテクター、ゴーグルを着用し、片手で目を持ち、切断面を背にして、かみそりの刃の端を使用して目の前面を突き刺します。次に、かみそりの刃を使用して、前方の眼球を2つに切ります。レンズを取り外し、アイカップを裏返して、指先1本にかざすようにします。したがって、カミソリの刃を斜めに使用して網膜を露出させ、網膜をそっとこすり落とすと、網膜は簡単に剥がれ、テトゥン表面からピンクがかった層として現れ、視神経頭で切断されます。網膜を、氷上に15ミリリットルの均質化溶液を含む2〜50ミリリットルのチューブのいずれかに移します。すべての網膜を採取した後、懸濁液を手で2分間激しく振る。異なる細胞層を破壊するために、光受容体の外側セグメントまたはPOSを残りの光受容体から切断し、POSを断片化し、網膜懸濁液を均質化します。大きな組織の破片を取り除くには、清潔なガーゼの二重層を使用して、懸濁液を50ミリリットルのチューブに3回ろ過します。ガーゼをそっと押して、残っている断片化された組織を解放します。各ろ過後、粗い網膜調製物を6〜24ミリリットル、25〜60%のスクロース勾配に穏やかに置きます。チューブのバランスを取った後、ウルトラは摂氏4度で50分間106、000Gで遠心分離します。スピンが完了したら、グラデーションの上3分の1にあるオレンジピンクバンドの上の溶液の大部分を吸引します。次に、P 1000チップを使用して、オレンジピンクのバンドをビーカーに集めます。約4〜5容量のウォッシュワンを使用して溶液を希釈し、必要な数の30ミリリットルチューブに分注します。3000GSで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を慎重に捨てます。次に、洗浄2液で、ペレットを懸濁してから再度回転させます。ペレットを洗浄するために洗浄3溶液を使用してください。3回目です。10〜20ミリリットルのDMMを使用して細胞を再懸濁します。次に、490マイクロリットルのDMMを使用して10マイクロリットルの細胞を希釈し、1ミリリットルあたりのPOS粒子の収率と濃度を再計算します。最終的なDMM容量を決定し、スクロースを最終濃度2.5%まで追加し、目的のアリコートを準備します。1つのアリコートを2,300GSで室温で3〜5分間紡糸します。ペレットのサイズを評価し、凍結融解が複数回行われるのを避けるために、さまざまなアリコート量を準備します。Eloqua ワッティングの前にセルをラベル付けします。0.1モルの炭酸ナトリウム緩衝液を使用して、10ミリグラムのZIバイアル1本を1ミリリットルあたり2.5ミリグラムの濃度に再懸濁します。.暗所で室温で1時間回転させ、最高速度で5分間回転させて、残りのZI固形物をペレット化します。10ミリリットルのウォッシュス3溶液またはDMMを使用して、POSペレットを再懸濁し、80眼に2ミリリットルのファイト溶液を追加します。アルミホイルを使用して光から保護し、少なくとも1.5時間回転させます。室温で。ビデオで前述したように、ウォッシュスリー溶液を使用して細胞を2回洗浄し、その後、上清に遊離菌がほとんど見られなくなるまでEMを1〜2回DMします。DM EMを使用してPOSを一時停止し、ここに示すようにラベルなしのPOSと同様のクワットをカウントします。遠心分離ステップが終わるまで目とサンプルを暗所に置いておくことで、POSを含むショ糖勾配禁止剤は、その明るいオレンジ色ですぐに認識できます。また、損傷している場合は、ほこりっぽい背景のように、はるかに小さなピースとして表示されます。通常、適切に分離されると、POSは細長い、まっすぐな、または曲がって見えるはずです。顕微鏡で観察すると、顕微鏡の焦点面に応じて、暗く見えるか光沢があるかのどちらかになります。適切に再懸濁しないと、それらは塊のままになります。単離されたPOSは、変異型RPE細胞の食作用能を直接試験するのに役立ちます。この例では、POSは野生型マウスの初代RPE細胞によって容易に食作用しますが、β 5インテグリンおよびMFG 8ノックアウトマウスの細胞は、同じ時間でPOSが少なくなります。POS食作用の定量化は、蛍光強度を測定することによって顕微鏡画像上でFSE標識POSを手動でカウントするか、細胞トリプシンの後にフローサイトメトリーによって行うことができます。この図は、免疫蛍光法、共局在化アッセイを用いてタンパク質リクルートメントを解析し、免疫沈降後の免疫ブロック上でのタンパク質リクルートメントまたは活性化、またはその開発後のリン酸化のチェックにより検証することができます。この技術は、リン酸塩セイン媒介性食作用の分野の研究者が、網膜色素花弁細胞の分子機構を探索および特徴付け、その結果をマクロファージなどの他の食細胞と比較する道を開きました。

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このビデオは、採取したウシの目から網膜色素上皮細胞(RPE)細胞と虹彩色素上皮細胞(IPE)を単離する手順を示しています。単離された細胞を培養して、眼疾患の治療におけるそれらの役割を研究することができます。...

ウシ眼からのRPEおよびIPE細胞の単離:ウシ初代色素上皮細胞の採取および培養手順

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。...

非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。...

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。...

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

ここでは、初代ブタ網膜色素上皮細胞を 試験管内で 培養するためのわかりやすい方法が提示されている。...

ブタ網膜色素上皮細胞の初代培養

我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。...

モルモットの目からの網膜色素上皮細胞の分離

このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。...

高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

このプロトコルは局部的に供給されたブタの目から第一次網膜の色素の上皮(RPE)のセルを得、培養するためのプロシージャを概説する。これらの細胞は、幹細胞の高品質な代替品として機能し、 in vitro...

In vitroモデリングのための初代ブタ網膜色素上皮細胞の単離

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

学ぶブタまたはウシの網膜から感光体外側セグメントを超遠心分離で精製する方法。網膜色素上皮細胞の貪食アッセイに必要な大量のPOSを調製し、-80℃で長期保存可能です。

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

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