マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

この手順の全体的な目標は、蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛を 5 日間にわたって 30 分間隔で画像化することです。これは、最初に蛍光レポーターマウスから胚の13日目の蝸牛を採取することによって達成されます。次に、蝸牛をin vitroで培養します。

次に、蝸牛explan培養物をインキュベーター顕微鏡に入れます。最後に、自動イメージングルーチンが設定され、蝸牛Eがイメージングされます。最終的には、人工内膜エクスプラン培養の長期タイムラプスイメージングを使用して、蝸牛上皮全体の形態形成運動、レポーター遺伝子発現の経時変化、および遅効性薬理学的薬剤の影響を示すことができます。

この手法は、Xファンドの文化を時間経過で手作業で撮影するなど、既存の方法よりも優れている点は、このシステムが完全に自動化されていることです。これにより、より多くのタイムポイントを収集することができ、不規則な組織培養インキュベーターで増殖しながら、蝸牛または細胞のセットの同じ領域がすべてのタイムポイントで同じ向きでイメージングされるようになります。KOの修正イーグル培地またはDMEMとハンクのバランス塩溶液またはHBSSを付属のテキストプロトコルに従って補充した後。

層流フードの下で、5ミリリットルのウンス補充DMEMを使用して再懸濁し、200マイクロリットルの基底膜基質ピペット150マイクロリットルを直径35ミリメートルのガラス底培養皿の各10ミリメートルウェルの中央に注入します。CO2インキュベーターで35°Cの40分間インキュベートします。ワークステーションとツールを準備するには、層流クリーンベンチをオンにし、70%エタノールを使用してスプレーし、鉗子、スプーン、および黒いシリコンコーティングされた皿を浸します。

清潔なワークステーションで、氷の中で適切な妊娠の胚を採取します。コールドHBSSは1%ヒープで補完されました。蛍光実体顕微鏡を使用して、外部または可視臓器内でレポーター活性を示す胚を特定し、冷たい光源と細い鉗子を使用して、側頭骨を収集するための1%ヒープの新鮮な氷冷HBSSに移します。

頚椎と顎の下にクリップして頭を集めるためにすばやく作業します。テキストプロトコルに従って胚の頭部を採取した後、頭蓋骨を慎重に開き、頭蓋骨の前面から脳のトリムを取り除き、後頭蓋骨を新鮮な氷の入った皿に移します。寒い。HBSSは、ピーナッツの形をした側頭骨を慎重に解剖し、前庭系を無傷に保つように注意します。

蝸牛を解剖するには、側頭骨を氷のように冷たいHBSSヒープ内の黒いシリコンエラストマーコーティング皿に移します。側頭骨を安定させ、鉗子のためのスペースを作るために、斜めの角度でピンを挿入して骨の前庭領域を固定します。次に、蝸牛の基部の外縁にある軟骨に鉗子のタイを1本挿入し、軟骨に穴を開けて、蝸牛を囲む軟骨を慎重に取り除きます。

上部を横切って水平にクリップし、カプセルの前部を斜めに持ち上げて慎重に持ち上げます。残った軟骨と管の間に鉗子の突起を挟み込み、残った軟骨をやさしく切り取ります。蝸牛の頂端面が露出しています。

基部から始めて、ダクトの屋根が蝸牛上皮と出会う領域をつかみ、蝸牛管を開きます。必要に応じて、屋根のトリミングを完全に取り外すまでそっと剥がします。ダクトの内側に残っている膜の部分を切り取ります。

次に、過剰な間葉系組織の管を清掃し、前庭系から管を培養インプラントに取り外します。基板コーティングされたガラス底培養皿の中央に1つの管腔表面を置きます。液体を慎重に引き出し、2分間放置します。

その後、ドロップワイズ。X explanに150マイクロリットルのサプリメントDMEMを追加し、基質に落ち着くように邪魔しないように注意してください。ガラス底の皿を直径12センチの深いシャーレに置き、湿度を保つために滅菌水の小さな皿を入れます。

培養物を摂氏35度のインキュベーターに一晩入れて、エクスプランを基質に付着させ、平らにしてライブイメージングを行います。サンプルを選抜した後、蛍光実体顕微鏡を使用して、外植された各蝸牛の状態を評価し、ダクトが損傷せず、基部から頂点までガラスに付着している外植片のみを選択します。インキュベーターを摂氏35度にセットし、5%CO2を培養します。

蝸牛組織は、培養物から補充された DMEM を穏やかに吸引し、少なくとも 500 マイクロリットルの新鮮な培地と交換します。explanがゆるく取り付けられている場合は、皿の端にミディアムのリングをピペットで取り付けます。この余分な液体は、マトリックスに付着し続ける間、explanを乱すことなくミニチュアの加湿チャンバーを作ります。

この例の顕微鏡には、層流フードの下に 8 つの 35 mm サンプル皿を保持する回転プラットフォームがあります。プラスチック製の蓋をガラス製の蓋に交換し、皿をsに挿入しますampリッシュホルダー。実験の過程で培地を交換する必要がある場合。

エクスプランの邪魔にならないように、ディッシュを顕微鏡に取り付けたまま蓋を開けることができるヒンジ付きディッシュカバーを使用し、サンプルディッシュホルダーをインキュベーター顕微鏡の中に配置し、ディッシュの底からexplanが外れたり、培地を乱したりしないように注意してください。イメージングルーチンを設定するには、顕微鏡のUVランプとカメラの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。配置された各サンプルについて、開始時のエクスプランのビューだけでなく、実行中に組織がどのように動くかも念頭に置いて、焦点と露出のイメージング領域平面を選択します。

蛍光チャンネルで、選択した焦点面を中心にZスタックを設定します。次に、実験のサンプリングの周波数と長さを設定します。これは、タイムラプス期間の終了時に画像を収集してムービーを生成するのにかかる時間によって制限されます。

METAMORPHなどのソフトウェアを使用して、サンプルの画像ファイルをフレームごとに開きます。目的の細胞集団を示すのに最適な焦点面を選択します。最後に、画像をドットVIファイルに変換するか、モンタージュとしてエクスポートして、画像処理ソフトウェアで開いて分析したり、他の形式に変換したりできる一連の画像を生成します。

ここに示されているのは、器官型蝸牛エクスプランがメッキされた場合にどのように成長するかを示す動画です。E 13.5では、SOX 2レポーターマウスを使用して、非感覚領域の細胞が分裂して移動する際の緑色で見られるpros感覚領域を視覚化しました。緑色の非増殖性感覚領域は、組織の再配列と収束的な伸展運動を受けます。

2 回目のタイムラプス実験では、異なる人工内耳の基部の中央部を中心に、長所が拡張すると、最初に培養したときに感覚領域が狭くなることが示されています。組織の厚さにより、個々の細胞ではなく、発現領域を特定することができます。

しかし、培養で3日後には、組織はかなり平らになり、この手順に従って個々の蛍光細胞を視覚化することが可能になりました。免疫蛍光染色やタンパク質およびRNA抽出などの他の方法を実行して、分子レベルでの遺伝子発現の変化を評価することができます。このビデオを見た後、蝸牛の解剖と培養の方法と、インキュベーター顕微鏡を使用して数日間にわたって全体のexplanでライブイメージングを実行する方法についてよく理解しているはずです。