RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

この手順の全体的な目標は、RNAシーケンシング技術を使用して、マウスEML細胞の自己複製と分化の潜在的な主要な調節因子を特定することです。これは、まず、表面マーカーに基づいて系統陰性CD34陽性および系統陰性CD34陰性EML細胞を分離することによって達成される。2番目のステップは、mRNAを単離し、mRNAをcDNAに変換し、シーケンシング用のライブラリを準備することです。

次に、DNAライブラリーをハイスループットシーケンシングにかけます。最後のステップは、シーケンシング結果を解析し、発現差のある転写因子を探すことです。最終的に、RNAシーケンシング技術を使用して、系統陰性CD34陽性および系統陰性CD34陰性EML細胞において発現差のある転写因子を示します。

マイクロレイなどの他のG発現プロレン法に対するRNAシーケンシングの主な利点は、感度、精度、ダイナミックレンジが広く、既存の遺伝子アノテーション情報に依存しないことです。この方法は、細胞の自己複製と分化を調節する主要な転写因子は何かなど、幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、造血前駆細胞を制御する主要な調節因子、自己再生および分化についての理解を深めることが効果的な治療法の開発につながる可能性があるため、血液疾患の治療にまで及びます。

一般に、この方法に不慣れな個々の人は、シーケンシング分析にさまざまなバイオフォーマティクスツールが必要なため、苦労します。幹細胞因子収集用の赤ちゃんハムスター腎臓またはBHK細胞は、25平方センチメートル、摂氏37度、CO25%のフラスコに10%FBSを含むdmem培地で培養されます。細胞が80〜90%のコンフルエンストリプシンアイに達し、室温で5分間200Gで遠心分離してそれらを収集したら、スナットを廃棄し、細胞パレットを10ミリリットルの新鮮なBHK細胞培養培地に再懸濁します。

2ミリリットルの細胞懸濁液を新しい75平方センチメートルのフラスコアプリに移し、48ミリリットルの新鮮なBHK細胞培養液を添加します。フラスコ文化への媒体。BHK細胞を2日間。

2日後、培地を回収し、ポイント45マイクロメートルフィルターに通します。メディウムは摂氏マイナス20度で保管してください。このプロトコールで使用されるマウス赤血球、骨髄、およびリンパ球またはEML細胞は、摂氏37度および5%CO2のBHK細胞培養培地を含むEML塩基性培地中で懸濁液中で培養されます。

EML細胞を低細胞密度に維持し、ピーク密度はミリリットルあたり600,000細胞未満です。細胞を2〜3日ごとに1〜5の割合で細胞に穏やかに分割しますが、系統陽性細胞を枯渇させるためには10世代を超えないようにします。EML細胞を200Gで5分間遠心分離して

細胞をPBSで一度洗浄し、上清を捨てた後、再度遠心分離します。PBSで細胞を懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞をカウントします。細胞数は、後続のステップで抗体濃度を決定するために必要です。

製造元の指示に従って、系統抗体カクテルと磁気活性化細胞選別システムを使用して、系統陰性細胞またはライン陰性細胞を単離します。この手順を開始するには、lin陰性細胞を200Gで5分間スピンダウンします。PBSで細胞ペレットを再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞をカウントします。

セルをファックスバッファで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を200Gで5分間ペレット化します。5本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに、それぞれ1、2、3、4、5の番号を付けます。

適切な量のファクトバッファーで細胞を100マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度に再懸濁します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を5本のマイクロ遠心チューブのそれぞれに分注します。1 μg の抗マウス CD 34 FE 抗体をチューブ 1 とチューブ 2 に加えます。

チューブを混合し、すべてのチューブを摂氏4度で暗闇で1時間静かにインキュベートします。次に、ポイント25マイクログラムのPE標識アンティカ、1つの抗体、およびPC標識系統の20マイクロリットルを追加します。カクテル抗体を2つ1つに、PC標識系統のチューブ3と20マイクロリットルにPE標識アンティカ1抗体のポイント25マイクログラムを追加します。

チューブ4に対するカクテル抗体。チューブを穏やかに混合し、細胞を摂氏4度で暗所でさらに30分間インキュベートします。30 分後、300 マイクロリットルのファックス バッファーをすべてのチューブに追加し、セルを 200 G で 5 分間スピンダウンします。

最終洗浄後、500マイクロリットルのファックスバッファーで細胞を3回洗浄します。Resusは、蛍光活性化細胞選別により、チューブ1内のリンネガティブSCA陽性CD34陽性およびリンネガティブSCAネガティブCD34陰性細胞を分離するファックスバッファーの500マイクロリットルに各細胞ペレットを懸濁します。リン陰性CD34陽性およびリン陰性CD34陰性細胞からトリオールを用いて全RNAを抽出し、デオキシリボヌクレアーゼを用いて汚染されたDNAを除去する。

メーカーのプロトコルに従って、製造元の指示に従ってバイオアナライザーを使用して全RNAの品質を評価します。RNAインテグリティナンバーまたはRINが9を超えるRNAサンプルのみをmRNA抽出およびその後のライブラリ構築手順に使用します。この図は、RINが9.4に等しい高品質のRNAサンプルの結果を示しています。ここで使用するライブラリ構築プロトコルは、Illumina RNAシーケンシングプラットフォームに特有のもので、RNAサンプル調製キットを利用しています。

このビデオでは選択された手順のみが示されているため、製造元の指示に従ってください。まず、オリゴDT磁気ビーズを使用してポリMNAを積極的に選択します。次に、ポリmRNAをフラグメント化し、ランダムプライマーを用いて逆転写を行い、mRNAをCD NAに変換します。その後、合成された第2鎖CD NAを用いて二本鎖DNAを作製します。

次に、3つのプライムオーバーハングを除去し、5つのプライムオーバーハングをDNAポリメラーゼジンテートで充填します。3つの主要な末端は、互いにライゲーションするCD NAフラグメントに終了します。シーケンシングのために、二本鎖CDNAの両端にマルチプレックスインデックスアダプターを追加します。

最後に、分光光度計を用いて断片のCD NAの濃縮のためのPCRを行い、増幅されたDNAの吸光度260以上を吸光度260以上測定する。ライブラリーの濃度に関する情報を取得するには、ライブラリーの品質を評価し、バイオアナライザーを使用してDNA断片のサイズ範囲を測定します。RNAシーケンシングデータ解析の方法は、付属のプロトコルテキストに記載されており、ダウンストリーム解析のためのデータファイル処理、新規転写産物の検出、発現レベルの評価、発現差のある遺伝子の検出、発現差のある転写因子の同定が含まれます。

系統陰性EML細胞を抗CD34アンティカワンおよび系統カクテル抗体およびlin陰性頭蓋骨陽性CD34陽性およびlin陰性scaで染色した。ネガティブCD34ネガティブ細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングのみを用いて分離した。Lin 陰性細胞を SCA one および CD 34 発現の分析のためにゲーティングしました。

図書館の建設が終了したときに、EML細胞の2つの集団が観察されました。ライブラリー内のDNA断片のサイズは、バイオアナライザーを使用して確認しました。この代表的なデータは、良質なライブラリを示していますが、フラグメントサイズは約300塩基対でピーク

D-E-S-E-Qアルゴリズムは、転写因子が硫酸塩の測定に重要であるため、差次的に発現する転写因子に焦点を当てた差次的発現解析に使用されました。lin 陰性 CD 34 陽性と lin 陰性 CD 34 陰性の間で 1.5 倍以上変化する転写因子が見つかり、このヒートマップに示されています。特に、lin陰性CD34陽性細胞におけるTCF7の相対発現レベルは、lin陰性CD34陰性細胞におけるそれよりも100倍以上高い

したがって、TCF sevenは、EML細胞の自己更新および分化の制御におけるその機能を確認するための、さらなるクロマチン免疫沈降およびシーケンシング分析および機能試験のために選択されました。一度マスターすると、RNAライブラリは数日で完了し、開発後適切に実行すれば、全体の手順は約1か月で完了できます。この技術は、B細胞や悪性B細胞など、多様な細胞タイプや組織間で異なる遺伝子発現を探求する意欲のある研究者への道を開きました。

この手順を試みる際には、高CARTRNAが全RNA疾患の手順の基礎であるため、高CARTRNAを使用することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、EML細胞の再生と分化を制御する主要な調節因子を特定する方法について、より深く理解できるはずです。