Name: RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 学ぶRNAシーケンス解析によるマウスEML造血前駆細胞の自己再生・分化制御機構の解明。Lin-CD34+とLin-CD34-サブ集団の転写因子発現差を同定し、幹細胞生物学への貢献を示す。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JQW、SZ、SD、KCは、国立衛生研究所とStaman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundationからの助成金によってサポートされています。

<ol><li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+aging%3A+wrinkles+in+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li>
<li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li>
<li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid%2C+myeloid%2C+and+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li>
<li>Weiler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D3%3A+a+gene+induced+during+myeloid+cell+differentiation+of+Linlo+c-Kit%2B+Sca-1%28%2B%29+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells.</a> Blood. 93, 527-536 (1999).</li>
<li>Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+precursor+cells+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Chu, Y., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+platform+selection%2C+experimental+design%2C+and+data+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation.</a> Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).</li>
<li>Hornett, E. A., Wheat, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RNA-Seq+analysis+in+non-model+species%3A+assessing+transcriptome+assemblies+as+a+scaffold+and+the+utility+of+evolutionary+divergent+genomic+reference+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species.</a> BMC genomics. 13, 361(2012).</li>
<li>Eswaran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+cancer+reveals+novel+splicing+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations.</a> Scientific reports. 3, 1689(2013).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptomes+during+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+revealed+by+short%2C+long%2C+and+paired-end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).</li>
<li>Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+of+Arabidopsis+pollen+uncovers+novel+transcription+and+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing.</a> Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).</li>
<li>Edgren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fusion+genes+in+breast+cancer+by+paired-end+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.</a> Genome biology. 12, 6(2011).</li>
<li>Ilott, N. E., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+long+non-coding+RNAs+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing.</a> Methods. 63, 50-59 (2013).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+long+non-coding+RNAs+based+on+RNA-Seq+data+of+mouse+Klf1+knockout+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study.</a> BMC bioinformatics. 13, 331(2012).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16(2010).</li>
<li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106(2009).</li>
<li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307(2013).</li>
<li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+studies+using+microarrays%3A+principles%2C+problems%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+physiology+education%22%5BJournal%5D)">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute%2Fsubacute+phases%3A+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567(2013).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li>
<li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106(2010).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTFDB%3A+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3(2008).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li>
<li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction%2C+RT-PCR%2C+and+direct+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li>
<li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human%2C+mouse%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li>
<li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J+%22Characterize+Mammalian+Transcriptome+Complexity%22">Characterize Mammalian Transcriptome Complexity</a>. , LAP Lambert Academic Publishing. (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

哺乳動物のトランスクリプトームは、34〜38は非常に複雑です。 RNA-配列技術はまた、遺伝子発現解析のための他の方法に勝る多くの利点を有する新規な転写産物の検出および一塩基変化の検出など 、トランスクリプトーム解析の研究においてますます重要な役割を果たしている。冒頭で述べたように、マイクロアレイのハイブリダイゼーションのアーチファクトを克服する新規の転写物のde novoを識別するために使用することができる。 RNAシークエンスの1つの制限は、サンガー配列と比較し、相対短い読み取り長である。しかし、シークエンシング技術の急速な改善と、長さが絶えず増加してお読みください。本稿では、マウスのEM​​L細胞の自己再生および分化に潜在的な重要な調節因子を特定するためにこの技術を使用する詳細な方法を提供する。 このプロトコルの最初の重要なステップは、EML細胞培養である。 EMLは、造血前駆細胞株であり、それはあり得るがSCFを大量に増殖させた。 EML細胞の培養条件は通常の不死化細胞株よりも多くの注意が必要です。細胞...

造血幹細胞は、成体骨髄ニッチに主に存在する稀な血液細胞である。これらは、血液および免疫系1を補充するために必要な細胞の産生を担う。幹細胞の種類としては、HSCは、自己再生および分化の両方が可能である。 HSCの運命決定を制御するメカニズムの解明、自己複製または分化のどちらかに向かって、血液疾患の研究や臨床使用量2のためのHSCの操作に貴重なガイダンスを提供します。研究者が直面する問題の一つは、HSCが維持され、非常に限られた範囲でインビトロで増殖することができることである。その子孫の大部分は、部分的に文化2で分化されている。 ゲノムワイドスケールでの自己再生および分化の過程を制御する重要な調節因子を同定するために、我々は、モデル系としてマウス原始造血前駆細胞株EMLを使用した。目細胞株は、マウス骨髄3,4から導出された。異なる成長因子を供給すると、EML細胞は、in vitroで 5 において赤血球、骨髄、およびリンパ系細胞に分化することができる。重要なことに、この細胞株は、幹細胞因子（SCF）を含む培地中で大量に増殖させることができ、それでもそれらの多能性を維持する。 EML細胞は、自己再生リン-SCA + CD34 +表面マーカーCD34およびSCA 6に基づいて、部分的に分化したリン-SCA-CD34-細胞の亜集団に分けることができる。短期HSCのと同様に、SCA + CD34 +細胞は、自己複製が可能である。 SCFで処理した場合、LIN-SCA + CD34 +細胞は急速に林-SCA + CD34 +およびLIN-SCA-CD34-細胞の混合集団を再生成し、6を増殖し続けることができます。つの集団は、形態学的に類似しており、c-キットmRNAおよびタンパク質6の同様のレベルを有する。リン-SCA-CD34-細胞はIL-3の代わりに、SCF 3を含有する培地中で増殖させることが可能である。 UnveilingのEML細胞の運命決定に重要な調節因子は、造血時の初期発生の移行における細胞および分子メカニズムのより良い理解を提供します。 自己複製リン-SCA + CD34 +および部分的に分化リン-SCA-CD34-細胞との間の根本的な分子の違いを調べるために、我々は、差次的に発現される遺伝子を同定するために、RNA配列を使用した。転写因子は、細胞の運命を決定する上で重要であるように、特に、我々は、転写因子に焦点を当てる。 RNA-seqがゲノム7,8から転写されたRNAをプロファイリングし、定量化するために、次世代シーケンシング（NGS）技術の能力を利用して最近開発されたアプローチです。簡単に述べると、トータルRNAは、ポリ選択と初期template.The RNAテンプレートは次いで逆転写酵素を用いてcDNAに変換されるように、断片化されている。 cDNAライブラリーを構築するために、無傷の、非分解RNAを用いて、完全長のRNA転写物をマッピングするために重要である。 PURのためシークエンシングの姿勢は、特定のアダプター配列は、cDNAの両端に付加される。そして、ほとんどの場合、cDNA分子は、PCRによって増幅され、ハイスループット様式で配列決定した。 シーケンシング後、得られたは参照ゲノムとトランスクリプトームデータベースに整列させることができる読み取ります。数は、参照遺伝子のマップがカウントされ、この情報は、遺伝子発現のレベルを推定するために使用できることを読み取る。読み込みは、非モデル生物9にトランスクリプトームの研究を可能にする、参照ゲノムなしデノボ組み立てることができる。 RNA-seqの技術は、スプライスアイソフォーム10-12、新規な転写物13および14の遺伝子融合を検出するために使用されてきた。タンパク質をコードする遺伝子の検出に加えて、RNA-配列はまた、新規に検出し、そのような18の非コードRNA 15,16、マイクロRNA 17は、siRNA などの長い非コードRNAの転写レベルを分析するために使用され得る。なぜなら、tの彼は、この方法の精度は、単一ヌクレオチド変異19,20の検出に利用されている。 RNA-配列技術の出現の前に、マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイルを分析するために使用される主要な方法であった。予め設計されたプローブは、マイクロアレイスライド21を形成するように合成し、続いて固体表面に付着される。 mRNAを抽出し、cDNAに変換される。逆転写プロセスの間に、蛍光標識されたヌクレオチドは、cDNAに組み込まれ、cDNAはマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせることができる。特定の場所から収集された信号の強度は、そのスポット21上の特異的プローブに結合したcDNAの量に依存する。 RNA-配列技術と比較して、マイクロアレイはいくつかの限界がある。 RNA-配列技術は、その使用が制限されるとき、比較的高いバックグラウンドレベルで新規な転写物を検出することが可能であるが、まず、マイクロアレイは、遺伝子アノテーションの既存の知識に依存している葛ね発現レベルが低い。による背景信号が飽和し、マイクロアレイの精度は両方の高度に発現される遺伝子と低い7,22のため制限され、一方でまた、RNA-配列技術は、検出（8000倍）7の非常に高いダイナミックレンジを有する。最後に、マイクロアレイプローブは、一つのサンプル23内の異なる転写物の相対発現レベルを比較した場合、結果はあまり信頼性を高めるそれらのハイブリダイゼーションの効率、が異なる。 RNA-配列がマイクロアレイに比べて多くの利点を有するが、そのデータ分析は複雑である。これは、多くの研究者がまだRNA-配列の代わりに、マイクロアレイを使用する理由の一つです。様々なバイオインフォマティクスツールは、RNA配列のデータ処理および分析24のために必要とされる。 いくつかの次世代シーケンサー（NGS）のプラットフォームのうち、454、イルミナ、SOLIDとイオントレントは、最も広く使用されているものである。 454は最初の商用NGSプラットフォームだった。他のシーケンシングプラットフォームとは対照的にそのようなイルミナ固体として、454プラットフォームは、より長い読みの長さ（平均700ベースの読み取り）25を生成します。長くは、その高い効率25を組み立てるためにtranscriptiomeの初期特性評価のための優れている読み取ります。 454プラットフォームの主な欠点は、シーケンスのメガベース当たりのコストが高いことである。イルミナとSOLIDプラットフォームは増大した数と短い長さで読み込み、生成する。シーケンスのメガベース当たりのコストは、454プラットフォームよりもはるかに低い。が短いため、大量のデータ分析がはるかに計算集約され、イルミナとSOLIDプラットフォーム用に読み取ります。イオントレントプラットフォーム用のシーケンシングするための機器および試薬の価格は安いですし、シーケンシング時間は25短い。しかし、エラーレートとシーケンスのメガベース当たりのコストは、イルミナとSOLIDプラットフォームに比べて高くなっている。異なるプラットフォームは、独自の長所と短所を持っており、データ解析のために異なる方法を必要とする。ナンプラーTFORMは、配列決定の目的や資金の利用可能性に基づいて選択する必要があります。 本稿では、例として、イルミナRNA-のSeqプラットフォームを取る。我々は、EMLの細胞の自己再生および分化において重要な調節因子を調査するためのモデル系としてEML細胞を使用し、発現量の計算および新規な転写産物を検出するためのRNA-配列ライブラリーの構築およびデータ分析の詳細な方法を提供した。我々は、機能テスト（ 例えば shRNAのノックダウン）と結合EMLモデルシステム2のRNA-seqの研究は、造血分化の初期段階の分子機構を理解する上での強力なアプローチを提供し、として機能することができるという本発明者らの以前の刊行物に示されている一般に、細胞の自己再生および分化の分析のためのモデル。

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>BHK cell culture</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD34 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-81</td><td>FACS sorting</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-81</td><td>FACS ソーティング</td></tr><tr><td>APC マウス系統抗体カクテル</td><td>BD Biosciences</td><td>558074</td><td>FACS ソーティング</td></tr><tr><td>BD FACSAria Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>特別オファーsysmtem</td><td>FACSの選別</td></tr><tr><td>コーニング&trade;細胞培養処理フラスコ 75 cm2</td><td>Corning incorporated</td><td>430641</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Corning&trade;細胞培養処理フラスコ 25 cm2</td><td>Corning incorporated</td><td>430639</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ I, Amplification Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td>ライブラリー調製</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>BHK 細胞培養</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140071</td><td>BHK細胞培養</td></tr><tr><td>馬 血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050-122</td><td>EML 細胞培養</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>HyClone</td><td>SH30228.02</td><td>EML 細胞培養</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>系統 細胞枯渇キット、マウス</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>系統陰性細胞の単離</td></tr><tr><td>NanoVue Plus 分光光度計</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9569-62</td><td>品質管理</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;ナプコ&トレード;8000 Water-Jacketed CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-497-002</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>EML 細胞培養</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>RNA exraction</td></tr><tr><td>TruSeq&trade;RNAサンプル調製キットv2 -セットB (48 rxn)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2002</td><td>ライブラリ調製</td></tr><tr><td>2100 電気泳動 バイオアナライザー 機器</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td>品質管理</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>0.45 &micro;m シリンジフィルター</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td>細胞培養</td></tr></tbody></table>

rnaシーケンシング解析によりeml造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

造血幹細胞（HSC）は、白血病やリンパ腫などの多くの疾患において、患者の造血系を再構築するために、移植治療のために臨床的に使用されている。 HSCの自己再生および分化を制御するメカニズムを解明することは研究および臨床用途のためのHSCのアプリケーションのために重要である。しかし、によりインビトロで増殖することができないことにHSCを大量に得ることができない。このハードルを克服するために、我々は、この研究のためのモデル系として、マウス骨髄由来の細胞株、EML（赤血球、骨髄、およびリンパ球）細胞株を使用した。 RNAシークエンシング（RNA-配列）がますます遺伝子発現研究のためのマイクロアレイを置き換えるために使用されてきた。ここではEML細胞の自己再生および分化の調節において潜在的な主要因を調査するためにRNA-配列技術を使用する具体的な方法を報告する。このホワイトペーパーで提供されるプロトコルは、3つの部分に分かれています。最初のパーtはどのように文化のEML細胞と独立したLIN-CD34 +およびLIN-CD34-細胞に説明しています。プロトコルの第2の部分は、トータルRNA調製およびハイスループット配列決定のための後続のライブラリー構築のための詳細な手順を提供しています。最後の部分は、RNA配列データ解析のための方法を説明し、リン、CD34 +およびリン-CD34-細胞との間の差次的に発現する転写因子を同定するためにデータを使用する方法について説明します。最も有意に差次的に発現される転写因子はEML細胞の自己再生および分化を制御する潜在的な重要な調節因子であると同定された。本稿の議論のセクションでは、この実験の成功パフォーマンスのための主要なステップを強調表示します。 要約すると、本論文では、EML細胞中で自己複製と分化の潜在的な調節因子を同定するために、RNA-配列技術を使用する方法を提供しています。特定された主要な要因は、in vitroおよびiの下流の機能解析に供されているn個の生体内。

リン- CD34 +およびCD34-リン-EML細胞において差次的に発現される遺伝子を分析するために、我々は、RNA配列の技術を使用した。 図1は、手順のワークフローを示している。磁気細胞選別による系統陰性細胞の単離後、我々は、LIN-SCA + CD34 +およびFACSアリアを使用してLIN-SCA-CD34-細胞を分離した。リン富化EML細胞を、抗CD34、抗のSca1および系統カクテル抗体で染色した。唯一のリニア細胞はのSca1及びCD34発現の分析のためにゲートした。二つの集団（SCA + CD34 +およびSCA-CD34- EML細胞）をFACS分析（ 図2）6によって観察することができた。 細胞分離の後、我々は、それぞれCD34 +およびCD34-細胞からトータルRNAを抽出し、RNAの質を分析した。 RNA-配列データの精度は、主にRNA-配列ライブラリーの品質に依存して、総RNAの品質は、高品質のライブラリーを調製するために不可欠である。高品質のRNAサンプルは1〜OD 2...

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

この手順の全体的な目標は、RNAシーケンシング技術を使用して、マウスEML細胞の自己複製と分化の潜在的な主要な調節因子を特定することです。これは、まず、表面マーカーに基づいて系統陰性CD34陽性および系統陰性CD34陰性EML細胞を分離することによって達成される。2番目のステップは、mRNAを単離し、mRNAをcDNAに変換し、シーケンシング用のライブラリを準備することです。次に、DNAライブラリーをハイスループットシーケンシングにかけます。最後のステップは、シーケンシング結果を解析し、発現差のある転写因子を探すことです。最終的に、RNAシーケンシング技術を使用して、系統陰性CD34陽性および系統陰性CD34陰性EML細胞において発現差のある転写因子を示します。マイクロレイなどの他のG発現プロレン法に対するRNAシーケンシングの主な利点は、感度、精度、ダイナミックレンジが広く、既存の遺伝子アノテーション情報に依存しないことです。この方法は、細胞の自己複製と分化を調節する主要な転写因子は何かなど、幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、造血前駆細胞を制御する主要な調節因子、自己再生および分化についての理解を深めることが効果的な治療法の開発につながる可能性があるため、血液疾患の治療にまで及びます。一般に、この方法に不慣れな個々の人は、シーケンシング分析にさまざまなバイオフォーマティクスツールが必要なため、苦労します。幹細胞因子収集用の赤ちゃんハムスター腎臓またはBHK細胞は、25平方センチメートル、摂氏37度、CO25%のフラスコに10%FBSを含むdmem培地で培養されます。細胞が80〜90%のコンフルエンストリプシンアイに達し、室温で5分間200Gで遠心分離してそれらを収集したら、スナットを廃棄し、細胞パレットを10ミリリットルの新鮮なBHK細胞培養培地に再懸濁します。2ミリリットルの細胞懸濁液を新しい75平方センチメートルのフラスコアプリに移し、48ミリリットルの新鮮なBHK細胞培養液を添加します。フラスコ文化への媒体。BHK細胞を2日間。2日後、培地を回収し、ポイント45マイクロメートルフィルターに通します。メディウムは摂氏マイナス20度で保管してください。このプロトコールで使用されるマウス赤血球、骨髄、およびリンパ球またはEML細胞は、摂氏37度および5%CO2のBHK細胞培養培地を含むEML塩基性培地中で懸濁液中で培養されます。EML細胞を低細胞密度に維持し、ピーク密度はミリリットルあたり600,000細胞未満です。細胞を2〜3日ごとに1〜5の割合で細胞に穏やかに分割しますが、系統陽性細胞を枯渇させるためには10世代を超えないようにします。EML細胞を200Gで5分間遠心分離して回収します。細胞をPBSで一度洗浄し、上清を捨てた後、再度遠心分離します。PBSで細胞を懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞をカウントします。細胞数は、後続のステップで抗体濃度を決定するために必要です。製造元の指示に従って、系統抗体カクテルと磁気活性化細胞選別システムを使用して、系統陰性細胞またはライン陰性細胞を単離します。この手順を開始するには、lin陰性細胞を200Gで5分間スピンダウンします。PBSで細胞ペレットを再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞をカウントします。セルをファックスバッファで2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞を200Gで5分間ペレット化します。5本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに、それぞれ1、2、3、4、5の番号を付けます。適切な量のファクトバッファーで細胞を100マイクロリットルあたり100万個の細胞の濃度に再懸濁します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を5本のマイクロ遠心チューブのそれぞれに分注します。1 μg の抗マウス CD 34 FE 抗体をチューブ 1 とチューブ 2 に加えます。チューブを混合し、すべてのチューブを摂氏4度で暗闇で1時間静かにインキュベートします。次に、ポイント25マイクログラムのPE標識アンティカ、1つの抗体、およびPC標識系統の20マイクロリットルを追加します。カクテル抗体を2つ1つに、PC標識系統のチューブ3と20マイクロリットルにPE標識アンティカ1抗体のポイント25マイクログラムを追加します。チューブ4に対するカクテル抗体。チューブを穏やかに混合し、細胞を摂氏4度で暗所でさらに30分間インキュベートします。30 分後、300 マイクロリットルのファックス バッファーをすべてのチューブに追加し、セルを 200 G で 5 分間スピンダウンします。最終洗浄後、500マイクロリットルのファックスバッファーで細胞を3回洗浄します。Resusは、蛍光活性化細胞選別により、チューブ1内のリンネガティブSCA陽性CD34陽性およびリンネガティブSCAネガティブCD34陰性細胞を分離するファックスバッファーの500マイクロリットルに各細胞ペレットを懸濁します。リン陰性CD34陽性およびリン陰性CD34陰性細胞からトリオールを用いて全RNAを抽出し、デオキシリボヌクレアーゼを用いて汚染されたDNAを除去する。メーカーのプロトコルに従って、製造元の指示に従ってバイオアナライザーを使用して全RNAの品質を評価します。RNAインテグリティナンバーまたはRINが9を超えるRNAサンプルのみをmRNA抽出およびその後のライブラリ構築手順に使用します。この図は、RINが9.4に等しい高品質のRNAサンプルの結果を示しています。ここで使用するライブラリ構築プロトコルは、Illumina RNAシーケンシングプラットフォームに特有のもので、RNAサンプル調製キットを利用しています。このビデオでは選択された手順のみが示されているため、製造元の指示に従ってください。まず、オリゴDT磁気ビーズを使用してポリMNAを積極的に選択します。次に、ポリmRNAをフラグメント化し、ランダムプライマーを用いて逆転写を行い、mRNAをCD NAに変換します。その後、合成された第2鎖CD NAを用いて二本鎖DNAを作製します。次に、3つのプライムオーバーハングを除去し、5つのプライムオーバーハングをDNAポリメラーゼジンテートで充填します。3つの主要な末端は、互いにライゲーションするCD NAフラグメントに終了します。シーケンシングのために、二本鎖CDNAの両端にマルチプレックスインデックスアダプターを追加します。最後に、分光光度計を用いて断片のCD NAの濃縮のためのPCRを行い、増幅されたDNAの吸光度260以上を吸光度260以上測定する。ライブラリーの濃度に関する情報を取得するには、ライブラリーの品質を評価し、バイオアナライザーを使用してDNA断片のサイズ範囲を測定します。RNAシーケンシングデータ解析の方法は、付属のプロトコルテキストに記載されており、ダウンストリーム解析のためのデータファイル処理、新規転写産物の検出、発現レベルの評価、発現差のある遺伝子の検出、発現差のある転写因子の同定が含まれます。系統陰性EML細胞を抗CD34アンティカワンおよび系統カクテル抗体およびlin陰性頭蓋骨陽性CD34陽性およびlin陰性scaで染色した。ネガティブCD34ネガティブ細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングのみを用いて分離した。Lin 陰性細胞を SCA one および CD 34 発現の分析のためにゲーティングしました。図書館の建設が終了したときに、EML細胞の2つの集団が観察されました。ライブラリー内のDNA断片のサイズは、バイオアナライザーを使用して確認しました。この代表的なデータは、良質なライブラリを示していますが、フラグメントサイズは約300塩基対でピークに達しています。D-E-S-E-Qアルゴリズムは、転写因子が硫酸塩の測定に重要であるため、差次的に発現する転写因子に焦点を当てた差次的発現解析に使用されました。lin 陰性 CD 34 陽性と lin 陰性 CD 34 陰性の間で 1.5 倍以上変化する転写因子が見つかり、このヒートマップに示されています。特に、lin陰性CD34陽性細胞におけるTCF7の相対発現レベルは、lin陰性CD34陰性細胞におけるそれよりも100倍以上高い。したがって、TCF sevenは、EML細胞の自己更新および分化の制御におけるその機能を確認するための、さらなるクロマチン免疫沈降およびシーケンシング分析および機能試験のために選択されました。一度マスターすると、RNAライブラリは数日で完了し、開発後適切に実行すれば、全体の手順は約1か月で完了できます。この技術は、B細胞や悪性B細胞など、多様な細胞タイプや組織間で異なる遺伝子発現を探求する意欲のある研究者への道を開きました。この手順を試みる際には、高CARTRNAが全RNA疾患の手順の基礎であるため、高CARTRNAを使用することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、EML細胞の再生と分化を制御する主要な調節因子を特定する方法について、より深く理解できるはずです。

identification-key-factors-regulating-self-renewal-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。...

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

ここでは、4つの骨髄系統に対する臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞の免疫発食特性特性およびサイトカイン誘導分化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルの応用には、CD34+細胞の骨髄性分化に対する骨髄疾患変異または小分子の影響に関する調査が含まれる。...

ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞および前駆細胞のパンミエロイド分化

ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。...

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Hoxb5レポーターシステムを使用して、長期造血幹細胞(LT-HSC)および短期造血幹細胞(ST-HSC)を分離するための段階的なプロトコルを提示します。...

長期および短期造血幹細胞の単離方法

赤血球生成のモデリングは、このプロセスにおけるアクターの生物学的意義を理解し、分化欠陥を緩和する可能性のある新しい治療アプローチを評価する貴重な機会を提供します。ここでは、ex...

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

学ぶRNAシーケンス解析によるマウスEML造血前駆細胞の自己再生・分化制御機構の解明。Lin-CD34+とLin-CD34-サブ集団の転写因子発現差を同定し、幹細胞生物学への貢献を示す。

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

さらに動画を探す