Name: 植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用インゲンマメ例として (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶ植物葉からのアポプラスト液抽出法。浸透・遠心分離技術を用いてPhaseolus vulgarisから高品質サンプルを取得し、細胞質汚染を最小限に抑えた下流解析を可能にする。

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この作業は、英国バイオテクノロジー・生物科学研究評議会（BBSRC）からゲイル・プレストン氏への助成金BB/J016012/1およびBB/E007872/1によって支援されました。

注：これらの要因が大幅に品質変動とAWF（ 図1）の収率に影響を与えることができるように、植物の成長条件の葉の出発物質の選択および標準化が重要である。考慮すべきパラメータは、表1に示され、議論でより詳細に説明する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>パラメーター</td><td colspan="3">例標準化</td></tr><tr><td></td><td> インゲンマメ </td><td> トマト </td><td> シロイヌナズナ </td></tr><tr><td>葉の種類</td><td>最初の真の葉、完全に拡張され、健全な</td><td>下から2 番目と3 番目の葉、アポプラスト抽出に使用されていない頂端リーフレットを取っ4最大のリーフレット</td><td>完全に展開ロゼット葉</td></tr><tr><td>植物の齢</td><td> 21日</td><td> 7から9​​週間</tD&gt; <td> 7週間</td></tr><tr><td>時刻</td><td>光時代中期（12:00） </td><td>光時代中期（12:00） </td><td>光時代中期（12:00） </td></tr><tr><td>水和</td><td>すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜き</td><td>すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜き</td><td>すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜き</td></tr><tr><td>ライト</td><td> 16時間明、400マイクロモルメートル-2秒-1 </td><td> 16時間明、400マイクロモルメートル-2秒-1 </td><td>週2から10時間の明（短日）、400マイクロモルメートル-2秒-1 </td></tr><tr><td>湿度</td><td> 70パーセント</td><td> 70パーセント</td><td> 70パーセント</td></tr><tr><td>温度</td><td> 22°C光、18℃暗黒</td><td> 22°C光、18℃暗黒</td><td> 21°C </td></tr></tbody></table> 標準化されたparameの表1例AWF抽出に使用される葉のためにTERS。 1.生成アポプラスト洗浄液注：このプロトコル中に感染した葉から微生物の病原体をinculding危険なmaterilaは、ドレインを下に洗浄すべきではありません。むしろ適切な廃棄手順を使用する必要があります。 <ol><li>葉の大きさに基づいて装置を選択する。 <ol><li>無針注射器を使用してより小さな葉（ 例えば、シロイヌナズナ、豆）を潜入。注射器に収まらないほど大きい葉を浸透させるために真空フラスコを使用してください。同時に複数の葉に潜入するために真空フラスコメソッドを使用します。 </li><li>カミソリの刃を使用して、小さなセクションに利用可能な浸潤法には大きすぎる葉を分割します。徹底的に損傷を受けた細胞から滲出する細胞質の汚染物質を除去するために浸透の前に蒸留水で葉の切片をカットすすぐ。 </li></ol></li><li>の60mLシリンジを用いて、葉の浸潤。 <ol><li>から葉を切り離しカミソリの刃を使用して、葉柄で植物。例えばトマトなどの化合物の葉の場合は、petioluleでリーフレットを切り離す。 </li><li>葉の表面の汚染物質を除去するために蒸留水に浸して、新鮮に切除した葉をすすぐ。優しく吸収性の組織または紙で吸い取りによって葉を乾燥させます。 </li><li>浸透する前に葉の重さを測定します。 </li><li> （他の浸透液を使用することができる、議論を参照）を注意深くロールおよび/または60 mlシリンジ中に葉を折るし、蒸留水で注射器を満たす。約40ミリリットルマークにプランジャーを下げながら、シリンジ内の空気を取り出します。 </li><li>手袋をはめた指またはパラフィルムの一部のいずれかと注射器先端をカバーし、その後60ミリリットルマークに外側にプランジャーを引いて、注射器内の負圧を作成します。ゆっくりプランジャーを解放します。 注：細胞溶解および細胞質の汚染を生じ得る圧力を解放すばやく。 </li><li>シリンジ先端のプラグを抜き、すべての空気を排出し、先端を押して取り外し再接続正圧のささやかな量を作成するためのプランジャーにさらに下方。 </li><li>浸透した領域の暗く色によって見られるように葉が完全に、浸透されるまで1.2.6 -を繰り返して、1.2.5を繰り返します 。 </li><li>シリンジから葉を削除します。穏やかに、しかし完全に表面の液体を除去するために吸収紙葉ブロット。 </li><li>浸潤葉の重量を測定します。密接に浸透量を近似浸潤前後の重量差を計算する。 </li></ol></li><li>真空フラスコによる葉の浸潤： <ol><li>カミソリの刃を使用して、葉柄に植物から葉を切り離します。 </li><li>葉の表面の汚染物質を除去するために蒸留水に浸して、新鮮に切除した葉をすすぐ。優しく吸収紙で吸い取りによって葉を乾燥させます。 </li><li>浸透する前に葉の重さを測定します。 </li><li> 250ミリリットル以上のサイドアームフラスコの共同で（複数の葉に浸潤している場合、または葉）の葉を置き（他の浸透液を使用することができる、 説明を参照）を蒸 ​​留水をntaining。完全液体と葉をカバーしています。 </li><li>フラスコに真空を適用します。穏やかに葉から気泡を放出するために攪拌する。慎重にゆっくりと真空をリリース。 注：すぐに真空を解放すると、細胞溶解および細胞質汚染の原因となります。 </li><li>浸透した領域の暗く色によって見られるように、葉になるまで繰り返しステップ1.3.5は 、完全に浸透させる。 </li><li>フラスコから葉を削除します。穏やかに、しかし完全に表面の液体を除去するために吸収紙葉ブロット。 </li><li>浸潤葉の重量を測定します。密接に浸透量を近似浸潤前後の重量差を計算する。 </li></ol></li><li>遠心分離によるAWFの回収： <ol><li> 4インチ（10cm）に幅のパラフィルムの一部に葉を置きます。を5mlピペットチップ（または同様のサイズのオブジェクト）を使用して、パラフィルム内の葉をロールアップ。 </li><li> 20ミリリットル注射器にピペットチップでロールアップの葉を挿入します。上向きにすべてのカットの葉のエッジを配置します。きれいな50ミリリットルポリエチレン又はポリカーボネートチューブに注射器を挿入します。 </li><li>遠心分離し、4℃でスイングバケットローター1,000×gで10分間、管内の注射器。 注：遠心分離の後、葉の視覚的検査は、浸透液の大部分が排出されたことが示される。濃い緑色のパッチは、追加の遠心分離時間が必要であることを示している。 </li><li>新しい1.5 mlチューブに回収AWFをピペット。 注：AWFの容積は約その葉のための浸透量を一致させる必要があります。ボリュームは、遠心分離時間または遠心分離速度の追加、その後も小さい場合に必要です。 </li><li>遠心分離する任意の細胞または粒子状物質を除去するために5分間、15000×gでAWFサンプル。また、REMOする0.22μmのフィルターを介してAWFを渡す細胞および粒子状物質VEの。 </li><li>新しいチューブに上清をピペットで。ストレージまで氷上にサンプルを保管してください。 </li><li> -80℃でAWFのサンプルを保管してください。 </li></ol></li></ol>細胞質汚染2.アッセイ<ol><li>酵素反応（ 例えば、タンパク質分解）を最小化し、遠心分離工程が完了した直後にアッセイを実行するために氷上でAWFのサンプルを保管してください。 NOTE：代謝産物アッセイのために、試料は直ちに抽出後に凍結されてもよいし、使用するまで-80℃で保存した。 </li><li>標準のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）アッセイプロトコルの場合は15を参照してください。それ以外の場合は、市販のMDHアッセイキットを使用しています。 </li><li>標準グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）アッセイプロトコル16を参照のこと;それ以外の場合は、市販のG6PDHアッセイキットを使用しています。 </li><li>例えば、グルコース-6-リン酸（G-6-P）のような細胞代謝産物の定量化のためのステップ5に記載したようにGC-MSを使用して</stro&gt; NG。そうでない場合は、G-6-Pを直接アッセイ用の市販のキットを使用。 </li></ol>アポプラスト希釈ファクター3.計算<ol><li> ステップ1.2.4または1.3.4（例えば、蒸留水）に上記で使用浸潤液の2つのボリュームが準備します。 50μMの最終濃度を1液に、インジゴカルミン粉末を追加し、他には何も追加しません。 </li><li>プレートリーダーを用いてインジゴカルミン浸潤溶液200μlの610 nmの（OD 610）での吸光度を測定します。インジゴカルミンなしでODを浸透液の610 200μlのを減算することにより、この値を修正してください。下記の式にOD 610infiltrateとしてこの補正された値を代入します。 </li><li> （インジゴカルミンとない）の両方浸潤ソリューションと（ ステップ1.2または1.3）上記のように、少なくとも3回の反復の葉の浸潤を実行します。 </li><li>浸透後、R蒸留水で葉で、InSe外表面に残っているインジゴカルミン存在を削除します。 </li><li> （ ステップ1.4）上記のように遠心分離を進めます。 </li><li>インジゴカルミンAWF抽出200μlの平均OD 610を決定します。インジゴカルミン無料AWF200μlの平均OD 610値を減算して、この値を修正してください。下記の式にOD 610AWFとしてこの補正された値を代入します。 </li><li>ように補正吸光度値から（ すなわち、倍希釈）、希釈係数を計算する。 アポプラスト希釈係数= ODの610infiltrate /（OD 610infiltrate - OD 610AWF） </li><li> プランタアポプラスト液中の濃度/作用を推定する希釈倍率によってAWFから乗算濃度または活性値。 </li></ol>凍結乾燥により完全な強さにAWFの4濃度<ol><li>凍結乾燥機とAの電源を入れます作業温度及び圧力で安定させるためにLLOW。 </li><li>新鮮なまたは保存されAWFサンプルの所望の量をプール。 </li><li> 2ミリリットル遠心管に均等にサンプルを配布します。 </li><li>再構成ボリュームを決定します。 凍結乾燥/アポプラスト希釈係数の前に再構成ボリューム=ボリューム</li><li>蓋を閉じた状態で、液体窒素中でチューブを凍結する。 </li><li>一つ以上のチルド凍結乾燥容器に凍結されたチューブを転送します。チューブを転送する一方で、ガス交換を可能にするために鋭利なもので刺してきたものにふたを交換してください。 </li><li>凍結乾燥機に血管を取り付け、完全にサンプルを凍結乾燥。 </li><li>マシンからサンプルを取り出し、蒸留水を算出した額を加算してAWFを再構成する。 </li><li> unpierced蓋を交換し、-80℃でサンプルを記憶。 </li></ol>ガスクロマトグラフィー質量分析法17 5.代謝物の分析 &lt;OL&gt; <li> 1.5ミリリットルチューブにピペットAWF200μlの</li><li>内部標準として10μg/ mlのリビトールを含むメタノール700μlのを追加します。 </li><li> 10分間70℃で加熱する。 </li><li> 11000×gで10分間遠心。 </li><li>新しい1.5 mlチューブに上清700μlのを転送します。 </li><li> 10秒間の冷クロロホルムと渦の375を添加する。 </li><li> 10秒間のdH 2 Oと渦の500を添加する。 </li><li> 2200×gで15分間遠心。 </li><li>その後、熱することなく、完全に真空濃縮器でサンプルを乾燥、新しい1.5ミリリットルチューブに上層の水層を150μlのを転送します。 </li><li> 20 mg / mlのメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン30μlのサンプルを溶解する。 </li><li> 2時間激しく振とうしながら70℃でインキュベートする。 </li><li> MSTFA50μlの（N-メチル-N-（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド）を加える。 </li><li> 30分間振盪しながら37℃でインキュベートする。 </li><li> GC-MSコンプへの転送サンプルatibleガラスバイアル。 </li><li>サンプルのGC-MS分析を実行します。 Lisec らを参照してください。2009年17、GC-MS機器のセットアップとパフォーマンスの詳細については。 </li></ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

植物組織源の最適化アポプラスト抽出を行う際に生物学的および技術的な変動が大きくなる可能性があり、したがって、高度に標準化されたワークフローは、（ 図1）の実験全体で連続性を高めるために有用である。重要なことには、植物組織の供給源は、リーフ型、葉の年齢、成長/環境条件および時刻（ 表1）を含めた、標準化されなければならない。大きな違いは、異なる葉が浸透しているとAWF、その後遠心分離によって回収しやすさに存在する。これらの違いは、気孔の数、開口の大きさ及び肉抵抗12,14と相関している。偶数P.の異なる品種間AWF抽出手順の容易性、歩留まりに大きな違いがある尋常 。ここで使用Tendergreen品種の例葉カナダのワンダー品種よりも、この方法を用いてAWF抽出に対してより適している。中にP.は、最初の真の葉がそれらアポプラストの抽出のための当然の選択作り、侵入する最大かつ最も簡単に尋常 。アポプラスト空気と水の体積は、AWFの抽出性12,14の違いにつながるいくつかの種で、葉齢とともに変化することが示されている。 Pに尋常 、古い葉は、遠心分離の際に少ないAWFに浸潤し得、実質的にはより困難になる。それらは完全な展開に達したときに、したがって、葉を採取した。続いて浸潤AWFを回復するために、より高い遠心分離スピードを必要とすることが困難な葉。一つはので慎重に大規模なAWF抽出のための組織源に応じ決定する前に、いくつかの異なる葉の種類や品種を選別する必要があります。 植物成長条件は、実験の文脈内で可能な限り標準化されなければならない。それらが許す限り、成長のキャビネットを使用することが好ましい一貫した湿度、温度、およびガーゼトン強度連隊が維持される。 などの代謝物、酵素の濃度は概日周期14を通して変化するため、葉の収穫は常に日の同じ時刻に発生する必要があります。最後に、植物は全て同様の膨圧を持つ離れることを保証するために、植物は収穫（〜1時間）の前にすぐに給水されるべきである。 葉の浸潤および遠心分離の最適化細胞が遭遇する機械的ストレスが浸潤や遠心分離ステップの間に高すぎる場合に起因する部分的な細胞溶解にAWFの望ましくない細胞質の汚染が発生します。したがって、与えられたリーフタイプの手順は、歩留まりを最大化し、AWFの細胞質汚染を最小限に抑えることとの間に最適化されたトレードオフにする必要があります。全ての場合において、人はAWF葉細胞の機械的な破壊を回避するために回収することができる最低遠心分離速度を使用する必要があります。 centrifuの最適化ゲーション速度は体積を回収し、遠心分離速度の範囲にわたってアポプラスト汚染を監視することにより、各リーフタイプについて経験的に決定されるべきである。これは、閾値遠心力が超えられるまでそのようなMDH、G6PDHおよびグルコースリン酸イソメラーゼなどのマーカーの酵素活性は、これらの活動は、おそらく、細胞質漏れ9,12,14に、急速に増加させるの上、低いままであることが観察されている。 Baker ら。2012 11によって示されるように、遠心分離工程の間に支持するためのパラフィルムの使用は、AWF抽出の有効性を向上させることができ、過度の折り畳み及び圧縮による葉身に機械的損傷を最小限に抑えることができる。一つはAWF抽出の損傷や完全性について葉を調べる必要がある場合さらに、パラフィルムの使用は、遠心分離後に、葉の可視化を向上させます。 野内12は、Dである、カットイネ葉切片からAWFの回復の最適化を説明ifficultが浸透し、それらの小さな気孔の開口部のAWFを収集するために、より高い遠心速度を必要とする。イネの葉の表面の濡れ、いずれかの蒸留水中で葉または浸透液に界面活性剤を添加し予備浸漬することにより改善、浸透プロセスを容易にした。アポプラスト汚染12を監視しながら、より高い遠心分離スピード（6000×gで）も使用した。切断された葉の切片を使用する場合、細胞質汚染があっても、創傷部位の徹底的な洗浄でより優勢になるというリスクが常に存在する。カットの葉は、したがって、必要な場合にのみ使用してください。 多くの研究のために蒸留水を浸透流体11として使用される。しかしながら、化合物は、ある種のアポプラスト化合物、特にタンパク質13の抽出を改善するために、このような塩または緩衝剤として、浸透流体に添加することができる。 Lohaus 14は、イオン性および浸透力oの効果を評価する回収AWFの組成がn、それらを無視できることがわかった。浸潤培地のpHの変化は、しかしながら、AWF組成物14に影響を与え得る。 抽出されたアポプラスト流体の適切な取り扱いと保管は重要です。 AWFは、プロテアーゼおよび他の酵素13,20と同様に、揮発性有機化合物を豊富に含むことが示されている。したがって、それは氷の上で、またはそうでなければ、-80℃で保存したサンプルを維持することが推奨されているリカバリ後AWFの組成の変化を低減することができる。また、AWFの酵素アッセイは、タンパク質分解による酵素の不活性化、長期の希釈を制限または凍結融解をするために、抽出後できるだけ早く実施すべきである。 浸透処理はアポプラスト液を希釈し、この希釈の程度を決定することがしばしば必要である。遠心分離工程はまた、細胞内区画からの水でAWFを希釈することができる。希釈倍率は、必要とされている測定はAWFに行われたとき編、 インビボアポプラスト化学濃度を推定する。このようにして可能な限り正確にインビボで代謝物濃度に一致-希釈係数はまた、それが微生物のための成長培地を模倣アポプラストとして使用されている場合、完全な強さに戻すAWFを濃縮するために必要とされる。いくつかのバリエーションが、浸透流体に添加マーカー化合物の希釈を測定することにより、AWF希釈係数を決定するためのステップ4に記載の方法に存在する。すべてのメソッドのためにAWF希釈計算が浸透流体がかなりAWF復旧処理中に葉の細胞によって吸収されるか、または希釈されていないことを前提としています。この仮定は、以前に浸透ステップ14のために確認されているが、遠心分離工程のために未検証されている。マーカー化合物は、また、吸収された輸送またはアポプラストにいる間変更してはなりません。インジゴカルミンは、最も広く使用され、完全に使用される染料を試験するAWF希釈の計算のために。インジゴカルミンは、陽イオン交換樹脂と、単離された細胞壁に低い吸光度を表示し、 セイヨウアブラナにおけるAWF計算、エンドウマメ、トマトおよびダイズ 11,21,22に適していることが示された。しかし、いくつかの葉の種類、 例えば、米やキュウリに、インジゴカルミンは、完全にAWF希釈係数12,21の過小評価につながる浸潤、後に回収することはできませ現れた。インジゴカルミンの回復の欠如は、特にストレス下で24、アポプラストに産生されることが知られているスーパーオキシド23によってイサチンスルホン酸に開裂することにより、その感受性にすることができる。イサチンスルホン酸へのインジゴカルミンの切断は、610 nmでの吸光度の損失および245 nmでの増加になります。この反応はアポプラストにかなりの程度で起こるかどうか、またはこの反応がinfiltratするスーパーオキシドスカベンジャーの添加によって阻害され得るかどうかイオン液体は、これまでに検討されていない。ブルーデキストランはイネにおけるAWF希釈係数の定量化のために代わりにインジゴカルミンの使用されてきたAWF中での安定性と回復が報告されていないものの、12を残します。あるいは、[14 C]ソルビトール又は他の定量化内部標準としての放射性標識化合物は、代わりに、染料を用いることができ、放射能濃度の減少を測定し、同様の方法11,14,25で希釈係数を計算するために使用される。 技術の限界いくつかの注意点は、浸潤、遠心分離AWF分離法のために存在する。まず、浸透中アポプラストの希釈は、植物からの応答を誘発し得る。周囲の葉細胞はアポプラスト液の特定の成分の減少濃度を検出する場合、それらは、代謝物濃度の解釈を歪め、さらに代謝物を排出することによって応答することができる。でこの問題の評価は、それが浸潤し、遠心分離や浸透液のイオン強度の緩やかな差の時間のいずれも抽出AWF 14,22の組成に影響を与えることが観察された。したがって、アポプラスト希釈に起因するいかなるアーティファクトは最小限であると考えられている。 第二の潜在的な欠点は、遠心分離によるAWFの溶出はいくつかの理由のためにアポプラスト中に存在する全ての分子を捕捉しないことである。特定の陽イオンおよびタンパク質中のいくつかの化合物は、しっかりと負に帯電した細胞壁に関連し、AWF 13で溶出しないことができる。タンパク質のような他の分子は、14を使用する遠心分離スピードでアポプラストから効率的に溶出するには大きすぎるかもしれない。活性酸素種は、それらの広報アポプラストに生成された化合物の重要なクラスであるが、により、これらの化合物の短命の性質、及びそれらの製造不特定の要件esenceはよくAWF抽出によって捕獲されていません。それはAWFはアポプラスト液のインビボ合成を表し、これは種間でどのように変化するかを正確に知られていない。 何も普遍的に受け入れていないものの、いくつかのアッセイは、細胞質の汚染を測定するために存在する。主に細胞質酵素のアッセイ（ 例えば、G6PDH、ヘキソースのリン酸イソメラーゼ、MDH）が実行しやすいという利点があるが、細胞質の漏れ14,18とよく相関しない場合があります。細胞質の代謝物（ 例えば、六炭糖リン酸塩、クロロフィル）の評価は、おそらくもっと指標であるが、あまりウェル11を確立されている。それにもかかわらず、アッセイのいずれかのタイプは、サンプル間のアポプラスト汚染の相対的定量化のために有用であり得る。理想的には、複数の独立した測定値は、AWFサンプルの完全性を検証するために使用されるべきである。 その限界を認めているが、浸潤、centrifugatiここに記載されている技術にアポプラストタンパク質、一次および二次代謝産物及び無機イオンの研究では、シンプルで堅牢な技術のまま。

<html>植物アポプラストは、植物細胞を囲む間の空間である。これは、多くの代謝および輸送プロセスが行われる動的な環境である。アポプラストの主要な構造成分を組み立て、アポプラスト内に位置する酵素、構造タンパク質および代謝物によって修飾された細胞壁である。健康な植物細胞にアポプラストは、一般的にアミノ酸、糖および他の栄養素がH +共輸送1によって細胞質にアポプラストからインポートされることを可能にする酸性の状態に維持される。ショ糖輸送中に、光合成のソースからのスクロース移動ア​​ポプラストを通って、師部血管系へ。ショ糖は、その後、シンク器官2ショ糖を切断アポプラストインベルターゼによって維持浸透ポテンシャルによって輸送される。糖および他の栄養素も上向きに輸送され、蒸散流3を通して、気孔の空洞内に蓄積することができます。 &quot;&gt;アポプラストはまた、多くの病原体が彼らの寄生のライフスタイルを確立し、環境ニッチを表します。細菌性植物病原体は彼らがそのような気孔として、あるいは傷4を通して自然の開口部を介してアクセスするアポプラストの高い密度に増殖する能力を持っている。アミノの濃度細菌および真菌病原体5,6の栄養要求をサポートするのに十分であることが示されているアポプラストトマトおよび他の窒素化合物を含む。一次防御応答微生物病原体に向かっても、細胞外ペルオキシダーゼによって、アポプラスト中の反応性酸素種、すなわち生を生じる。及びオキシダーゼと架橋およびカロース沈着7を介して細胞壁の強化植物細胞壁は、抗菌活性を有する二次代謝産物が豊富であり、これらの二次代謝産物の生化学的性質は、種8の間で変化する。 上記に言及した結果編および他のプロセスは、葉アポプラスト液はタンパク質、糖、有機酸、アミノ酸、二次代謝物、金属および他のカチオン（ 例えば Mg 2+、K +のNa +、Ca 2+の、Feの2/3の様々な含まれ+）。シュートのアポプラストの溶質濃度はアポプラストと木部、師部および細胞質9との間に発生する輸送プロセスのバランスによって大幅に制御されている。しかし、代謝反応と微生物の成長も消費したりアポプラストの溶質を生産する。アポプラストの組成物は、植物種および遺伝子型の間の光、栄養および生物的および非生物的ストレス9を含む環境条件の変化に応じて異なることが知られている。アポプラスト物の組成を研究することによって、それがそのような酸化還元と浸透ポテンシャル、pHは、栄養/代謝物の可用性と酵素活性のような特性を含め、どのように変化するか、1は、植物が再どのように小説洞察を得ることができますその環境それに相当。その代謝産物および/またはイオンが、揮発性の一時的または細胞壁および原形質膜と結合することのできる空間的に構造化された動的な区画であるため、理解またはアポプラスト液中に発生する分子の変化を特徴づけるは複雑である。さらに、異なる分析技術は、異なる化学種の範囲をカバーするために必要とされる。 可溶性アポプラストの組成を研究するために、流体は、通常、組織から抽出される必要がある。いくつかの方法が新たに提案されたフィルタストリップ法10を含む様々な組織からのアポプラスト液を抽出するために存在するが、葉のための最も確立された抽出方法は、浸透、遠心分離である。この手法は、以前は11-13とLohaus ら評価されている。2001年14方法の技術的なパラメータの多くの精密検査を提供する。名前、浸潤-centrifuによって示唆されるようにゲーション技術は、本質的に、葉の穏やかな遠心分離によって浸潤/アポプラスト流体混合物の回収が続くネイティブアポプラスト液と混合し、水性浸透流体とアポプラスト空隙の置換を含む二段階法である。回収された流体が希釈され、アポプラスト中に存在する全ての化合物（下記参照）が含まれないように、この流体は、一般的にアポプラスト洗浄液（AWF）、または時々間洗浄流体ではなく、アポプラスト液として知られている。浸潤遠心法十分な容積の単一またはプールAWFサンプルが生成され、下流の生化学的分析技術（ 例えば、タンパク質電気泳動、酵素活性測定、NMR、クロマトグラフィーおよび質量の多くのタイプの広い範囲に供することができるように容易に拡張可能である分析）。リーフAWFはまた、植物コロニー微生物のウィットとの相互作用を研究するための成長培地を模倣アポプラストとして有用であるHその環境5。 次のプロトコルでは、 インゲンマメを使用して浸潤·遠心分離技術を実行する方法について説明CV 尋常 。 Tendergreen葉、およびメタボロミクスを中心とした下流の分析のいくつかの例を提供する。重要なことには、AWFの品質を評価するための方法は、異なる葉タイプの手順を最適化するために助言に沿って設けられている。

<table><tbody><tr><td>エッペンドルフ微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>フィッシャー</td><td>12-640&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 mlシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>20 mlシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>4インチパラフィルム</td><td>ビーミス</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>サイドアームフラスコ</td><td>SciLabware</td><td>12972831</td><td></td></tr><tr><td>真空源</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mlピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td>50-813-28&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>インディゴカーマイン</td><td>シグマ</td><td>I8130</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>SciQuip</td><td>Christアルファ 2-4 LD</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>biorad</td><td>166-0612EDU</td><td></td></tr><tr><td>オキサロ酢酸</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース-6-リン酸</td><td>Sigma</td><td>G7250</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td></td><td>Roche 10128023001</td><td></td></tr><tr><td>MDH assay kit</td><td>Biovision</td><td>K654-100</td><td></td></tr><tr><td>G6PDH assay kit</td><td>Sigma</td><td>MAK015-1KT</td><td></td></tr><tr><td>G-6-P アッセイキット</td><td>Biovision</td><td>K657-100</td><td></td></tr><tr><td>リビトール</td><td></td><td>Sigma A5502</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma</td><td>472476</td><td></td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>Thermor Scientific</td><td>SC250EXP</td><td></td></tr><tr><td>methoxyamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>226904</td><td></td></tr><tr><td>N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド</td><td>シグマ</td><td>394866</td><td></td></tr></tbody></table>

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用インゲンマメ例として

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

アポプラストは、原形質膜の外側に位置し、細胞壁を含む植物組織中の異なる細胞外区画である。葉植物のアポプラスト区画は、細胞壁形成、細胞の栄養と水の取り込みとエクスポート、植物エンドファイト相互作用および病原体に対する防御応答を含むいくつかの重要な生物学的プロセス、のサイトです。浸潤遠心法がよく、様々な植物種の可溶性アポプラスト組成の分析のためのロバストな手法として確立されている。この方法によって得られた流体は、一般的にアポプラスト洗浄液（AWF）として知られている。以下のプロトコルは、 インゲンマメ （フランス語豆）CVからAWF抽出のための最適化された減圧浸潤および遠心分離方法を説明している。 Tendergreen葉。この方法および他の植物種のためのプロトコルの最適化の限界が議論される。 AWF下流experimenの広い範囲で使用することができる回収アポプラストの組成物を特徴づけるために求め、それが植物種及び遺伝子型、植物の開発および環境条件に応じてどのように変化するか、または微生物がアポプラスト液中で成長する方法を決定し、その組成の変化に対応するためのts。

健康的な3週齢のPに行っAWF抽出のための典型的な結果CV 尋常 。浸透液として蒸留水を用いてTendergreen 葉は、 表2に示す。ヤングP.尋常葉浸潤に適している、そして、ここで使用される遠心分離速度で（1,000×gで）遠心分離により浸透液の大部分の除去は、葉が元の緑色に戻すとして直接見ることができる。P.尋常葉新鮮重量が浸透する前に平均1.1 XGにあったとのグラム新鮮重量あたりのAWFの0.5ミリリットルが得られた。 AWFのタンパク質濃度は、溶液は、標準的なBradfordタンパク質アッセイを使用して/ 0.18±0.08 mgであると決定された。インジゴカルミンの希釈を測定することによって計算これらの葉の希釈係数は、2.3±0.3倍であった。上記の値は、グラムの葉新鮮我々当たりAWFの収率を決定するために必要とされる種と予備実験の間、実質的に変えることができるIGHT、ならびに所与のリーフタイプ期待できるAWFタンパク質濃度および希釈係数。 圧力の変化があまりに急速である場合、遠心分離ステップ中に遠心力が高すぎる場合、細胞の完全性の損傷は、溶浸​​工程中の両方を発生することができる。これは、細胞質の汚染のマーカーAWFサンプルをアッセイすることが必要である。理想的には、複数の独立したアッセイが行われる。ここでは、3つの可能なアッセイからの結果を表2に報告されている。P.のよく行わ抽出で尋常性 AWFは、G6PDHは、標準的な酵素アッセイによって検出されなかった。これはG6PDHの活動のみしきい値遠心力12の上方に検出可能になる他の報告と一致している。対照的に、リンゴ酸脱水素酵素活性（2.5 U / ml）でのベースラインレベルは、すべてP.において検出可能であった標準代謝アッセイを使用して、尋常 AWFサンプル。遠心を増やす千×gでの閾値より上のceが増加MDH活性をもたらした（結果は示さず）。他の種からのアポプラスト、内因性MDH活性が18を含むことが知られているように、ここで検出された量は、本物のアポプラスト活動と考えられ、このベースラインレベルを超える有意な増加は、汚染の指標とされている。そのようなヘキソース-6-リン酸として、主に細胞質であると考えられる代謝物は、また、AWFの汚染を評価するために用いることができる。ここでは、GC-MS分析は、AWF抽出のG-6-Pのゼロまたはトレースレベルを検出した。対照的に、カットトウモロコシ根部において、G-6-Pは、すべての遠心分離速度でAWF抽出の後に検出された細胞質汚染10を表す、より高速で濃度が増加した。 PのGC-MSによる代謝物解析60識別可能な代謝産物と識別不能な化合物のほぼ同数（ 図2） - 尋常葉AWFは、典型的には、40を生じる。またはganic酸、単糖、及びアミノ酸が同定可能な代謝産物の大部分を表し、ただし、二次植物代謝産物も検出され、AWF 11から定量化されている。これらの異なる分子クラスからいくつかのサンプルのピークは、図2のラベルが貼られてさらに下流の分析技術は、例えば、様々な分子を定量化するためにこれらのAWFサンプルに適用されます。ICP-MS、NMR、HPLC、原子吸光分析、タンパク質質量分析。 図3に、クーマシーブリリアントブルー染色したSDS-PAGEゲルに示されるようにアポプラストのタンパク質成分はまた、AWFで表されている。他の役割の中で、アポプラスト酵素は、細胞壁の合成および細胞外の反応の生成に関与している酸素種。様々な種からAWFのプロテオミクス研究は、個々のタンパク質の十を同定し、アポプラストのタンパク質成分がいる環境保護に応答することが示されているnmentalストレス13,19。理想的にはAWFエキスは、ルビスコなどの細胞質タンパク質による汚染から自由でなければなりません。しかし実際には、これを達成することは困難である。 SDS-PAGE後〜53 kDaのルビスコタンパクバンドの存在は、AWFサンプルの完全性のためのさらなる定性アッセイを提供する。例えば、 図3のレーン2にロードされたサンプルは、レーン1のことルビスコ汚染の大きな量を含む。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td>インゲンマメはAWF尋常</td></tr><tr><td> AWFの容量（ml G -1葉FW） </td><td> 0.49±0.09 </td></tr><tr><td>タンパク質の濃。 （MGミリリットル-1） </td><td> 0.18±0.08 </td></tr><tr><td>希釈係数</td><td> 2.3±0.3 </td></tr><tr><td> G6PDH活性（Uミリリットル-1） </td><td></td></tr><tr><td>のGlc-6-P量（mg ml -1の） </td><td>どれも検出されず</td></tr><tr><td> MDH活性（Uミリリットル-1） </td><td> 2.5±0.9 </td></tr></tbody></table> PからAWF抽出表2.典型的な結果CV 尋常 。 Tendergreen葉。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg"> 図1.標準アポプラスト抽出ワークフロー。数字は、プロトコルの手順を参照してください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg"> 図2の例PのGC-MSクロマトグラムは。CV 尋常 。 Tendergreen AWF番号の例の代謝物ピークは、次のとおりです。1-マロン、2リン酸、3-コハク酸、4-不明、5-リンゴ酸、6-アスパラギン、7-リビトール（内部STandard）、8-クエン酸塩、9 - グルコース、10イノシトール、11、カフェー酸、12-スクロース。 <img alt="図3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250"> 図3.例SDS-PAGEクマシーは、Pのゲルを染色した。AWFの葉の抽出物尋常 。このゲルは、豊富なプラスチド酵素ルビスコによって細胞質汚染量が異なる2つのAWF抽出のタンパク質成分との間の比較を提供します。 AWFの抽出後、両試料は、冷アセトンの4倍過剰（v / v）のアセトンをタンパク質沈殿にかけ、十分の一元の体積の水に再溶解。レーン1および2は、40μgのタンパク質を含む。ルビスコ大鎖（〜53 kDa）の対応するバンドを矢印で示す。 M rは ：タンパク質分子量マーカー。

このプロトコルは、フランスの豆植物(Phaseolus vulgaris)をモデル例として、植物の葉からのアポプラスト洗浄液の最適化された抽出を詳述しています。

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

この手順の目標は、浸透遠心分離技術を使用して植物の葉から再生不良液を抽出することを実証することです。これは、最初に葉を浸透液に浸し、シリンジまたは真空ポンプを使用して発生する圧力差を使用して葉を完全に浸透させることによって達成されます。2番目のステップは、支持装置を使用して遠心分離する葉を準備することです。次に、葉を穏やかに遠心分離して、APOプラスト洗浄液を得る。最後のステップは、APOプラスト希釈係数を決定し、アラスト洗浄液の品質を測定することです。最終的に、浸潤遠心分離アッセイは、さまざまなダウンストリーム分析に使用できる代表的なAPOプラストサンプルを取得するために使用されます。この手法が他の既存の方法に及ぼす主な利点は、細胞質化合物による汚染が最小限に抑えられたアッパープラスサンプルを得るために、さまざまな葉の種類に対して最適化することが容易であることです。この方法は、APLの組成が植物間でどのように異なり、さまざまな生理学的条件やストレスの下で変化するかを理解することが重要な、植物生理学や植物微生物の相互作用などの分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。最初のステップとして、白衣、手袋、ゴーグルのルールを着用して安全対策を講じてください。次に、葉のサンプルを浸すための蒸留水の量を準備します。この場合、サンプルを収集する準備ができているかみそりの刃、豆の品種の柔らかい緑の葉。かみそりの刃を葉のペットに当て、植物の葉を取り付けます。採取したら、切り出したばかりの葉を蒸留水に浸して、葉の表面の汚染物質を取り除きます。次に、吸収性ティッシュまたは紙を使用して、葉をやさしくブロックして乾かします。浸潤を進める前に、葉の重量を測定してください。これは、後で浸透量を概算するのに役立ちます。60ミリリットルの注射器で浸潤プロセスを開始します。プランジャーを取り外した状態で、葉を慎重に転がしたり、シリンジに折りたたんだりします。次に、シリンジに浸透液を入れます。ここでは、蒸留水が使用されています。プランジャーを挿入し、シリンジを反転させて、その中の空気を排出します。後で比較するために、葉の色に注意してください。パラパラパラメータの小さな部分を使用して、プランジャーを40ミリリットルのマークに移動します。シリンジの先端を覆います。次に、プランジャーを60ミリリットルのマークまで引っ張って、負圧を作り出します。シリンジを反転させて、葉の表面から気泡を放出します。プランジャーを約2秒かけてゆっくりと開始位置に戻します。シリンジの先端の蓋を外し、空気を排出します。次に、先端を再度覆い、プランジャーを押して適度な量の正圧を作り出します。葉が完全に浸透するまで、空気を排出し、正圧を適用し続けます。完全な浸潤の証拠は、浸潤した領域の色が暗くなっていることです。これが見られたら、シリンジから葉を取り出します。葉を吸収紙でやさしくブロックして、表面の液体を取り除きます。次に、浸潤した葉の重量を測定し、別の浸透方法として真空フラスコを使用します。もう一度、葉を集めて蒸留水ですすいでください。ブラストして乾かした後、葉の重さを測ります。最小容量が250ミリリットルのサイドアームフラスコを入手してください。葉をフラスコに入れ、蒸留水で覆います。次に、フラスコにストッパーを取り付け、サイドアームに真空ポンプを取り付けます。圧力がかかるまで十分な時間、フラスコに真空剤を塗布します。約650ミリメートルの水銀。フラスコを静かに攪拌して、圧力を下げた状態で葉から気泡を放出します。その後、約10秒かけて慎重にゆっくりと真空を解除します。バキュームを適用し、フラスコを攪拌し、葉が完全に浸透するまでバキュームを解放するプロセスを繰り返します。完全な浸潤の証拠は、浸潤した領域の色が暗くなっていることです。完全に浸透した葉をフラスコから取り出し、吸収紙で葉をやさしく拭きます。表面の液体を除去するには、浸透した葉の重量を測定して、おおよその浸透量を決定できるようにします。葉が完全に浸透したら、遠心分離の準備をします。4インチ幅のパラフィルムをレイアウトします。パラフィルムに葉をのせます。次に、5ミリリットルのピペットチップを使用して、パラフィルムの葉を巻き上げます。プランジャーを取り外した20ミリリットルのシリンジ本体を取り、丸めた葉をピペットの先端で挿入します。切り取った葉の端を、プランジャーの端に向けて配置します。50ミリリットルのポリエチレンまたはポリカーボネートチューブを入手し、シリンジを挿入します。スイングバケットローター付きの遠心分離機を採用します。浸潤した葉の入ったチューブをロードし、摂氏4度と1000Gの遠心分離機を10分間遠心分離します。遠心分離後、葉を調べて、浸潤液の大部分が排出されているかどうかを判断します。遠心分離機のチューブには、回収されたAPOプラスト洗浄液が入っており、回収されたアラスト洗浄液を新鮮な1.5ミリリットルのチューブにピペッティングします。APOプラスト洗浄液サンプルを遠心分離機に入れ、15, 000 Gで5分間回転させて、細胞や粒子状物質を除去します。遠心分離後、スーピネートを新しいチューブにピペットで移します。サンプルをマイナス80°Cで保存できるようになるまで氷の上に置いておきます。APOプラット洗浄液の品質を評価する方法の1つは、APOプラット希釈係数を計算することです。これを行うには、この場合、それぞれが1つの容量に複数の浸透に十分な2つの容量の浸透流体蒸留水を準備します。インジゴカルマイン粉末を最終濃度50マイクロモルまで加えます。もう一方には何も追加しません。96ウェルマイクロプレートを入手し、3つのウェルに200マイクロリットルの浸潤液を充填します。インジゴカーミンを使用して、さらに3つに200マイクロリットルの混じりけのない浸透液を充填し、リーダー内のマイクロプレートをベースにして、各流体の吸光度を測定します。610ナノメートルでは、インジゴカルミンを含む流体の平均吸光度から液体の平均吸収剤を差し引いたものから、浸潤液の補正された吸光度が得られます。次に、各浸潤溶液について、葉浸潤プロトコルを3回複製します。葉のサンプルを水に浸します。インディゴカーマイン浸透液を使用する場合は、負圧と正圧を加え、浸透後に蒸留水で葉をすすぎ、葉の表面に残っているインディゴカーマインを取り除きます。遠心分離機を使用して最後の洗浄液を回収します。最後の洗浄液を回収した後、マイクロプレートのウェルにあるプレートリーダーに戻します。インディゴカーミンフリー抽出物の各200マイクロリットル、および各インディゴカーミンアラスト洗浄液抽出物の200マイクロリットルを配置しました。610ナノメートルでサンプルの吸光度を測定し、補正された吸光度を取得します。数値の各セットを平均し、差を取ります。浸透液の補正された吸光度とアプラスチック洗浄液の補正された吸光度を使用してAPL希釈係数を決定し、アプラスチック液中の濃度または活性の推定値を取得します。インプランターは、最後の洗浄液からの濃度または活性値に、fasi vulgaris品種から抽出された最後の洗浄液の希釈係数を掛けます。テンダーグリーンは、このガスクロマトグラフィー質量スペクトル有機酸を製造するために使用された。単糖とアミノ酸は、識別可能な代謝物の大部分を表しています。こちらはSDSページの比較で、fasi vulgarus alast洗浄液葉エキスのクマシステインジェルです。抽出物は、細胞質汚染の量が異なります。これは、石膏酵素ルビスの量が異なることで観察されます。この手順を実行するときは、この手順に続いて、組織の損傷や細胞質汚染を引き起こさないように、少なくともできるだけ穏やかであることを覚えておくことが重要です。タンパク質または代謝物質量分析などの他の方法を実施して、再生不良液の組成に関する追加の質問に答えることができます。アプラスチック洗浄液は、植物組織にコロニーを形成する微生物に対する再生不良化学物質の影響を研究するためのグロスメディウムとしても使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Rufián, J. S. ら、植物組織内の 緑膿菌シリンガ 遺伝子の発現の単細胞解析。 J. Vis. Exp.

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学ぶ植物葉からのアポプラスト液抽出法。浸透・遠心分離技術を用いてPhaseolus vulgarisから高品質サンプルを取得し、細胞質汚染を最小限に抑えた下流解析を可能にする。

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用インゲンマメ例として

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