植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用インゲンマメ例として

この手順の目標は、浸透遠心分離技術を使用して植物の葉から再生不良液を抽出することを実証することです。これは、最初に葉を浸透液に浸し、シリンジまたは真空ポンプを使用して発生する圧力差を使用して葉を完全に浸透させることによって達成されます。2番目のステップは、支持装置を使用して遠心分離する葉を準備することです。

次に、葉を穏やかに遠心分離して、APOプラスト洗浄液を得る。最後のステップは、APOプラスト希釈係数を決定し、アラスト洗浄液の品質を測定することです。最終的に、浸潤遠心分離アッセイは、さまざまなダウンストリーム分析に使用できる代表的なAPOプラストサンプルを取得するために使用されます。

この手法が他の既存の方法に及ぼす主な利点は、細胞質化合物による汚染が最小限に抑えられたアッパープラスサンプルを得るために、さまざまな葉の種類に対して最適化することが容易であることです。この方法は、APLの組成が植物間でどのように異なり、さまざまな生理学的条件やストレスの下で変化するかを理解することが重要な、植物生理学や植物微生物の相互作用などの分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。最初のステップとして、白衣、手袋、ゴーグルのルールを着用して安全対策を講じてください。

次に、葉のサンプルを浸すための蒸留水の量を準備します。この場合、サンプルを収集する準備ができているかみそりの刃、豆の品種の柔らかい緑の葉。かみそりの刃を葉のペットに当て、植物の葉を取り付けます。

採取したら、切り出したばかりの葉を蒸留水に浸して、葉の表面の汚染物質を取り除きます。次に、吸収性ティッシュまたは紙を使用して、葉をやさしくブロックして乾かします。浸潤を進める前に、葉の重量を測定してください。

これは、後で浸透量を概算するのに役立ちます。60ミリリットルの注射器で浸潤プロセスを開始します。プランジャーを取り外した状態で、葉を慎重に転がしたり、シリンジに折りたたんだりします。

次に、シリンジに浸透液を入れます。ここでは、蒸留水が使用されています。プランジャーを挿入し、シリンジを反転させて、その中の空気を排出します。

後で比較するために、葉の色に注意してください。パラパラパラメータの小さな部分を使用して、プランジャーを40ミリリットルのマークに移動します。シリンジの先端を覆います。

次に、プランジャーを60ミリリットルのマークまで引っ張って、負圧を作り出します。シリンジを反転させて、葉の表面から気泡を放出します。プランジャーを約2秒かけてゆっくりと開始位置に戻します。

シリンジの先端の蓋を外し、空気を排出します。次に、先端を再度覆い、プランジャーを押して適度な量の正圧を作り出します。葉が完全に浸透するまで、空気を排出し、正圧を適用し続けます。

完全な浸潤の証拠は、浸潤した領域の色が暗くなっていることです。これが見られたら、シリンジから葉を取り出します。葉を吸収紙でやさしくブロックして、表面の液体を取り除きます。

次に、浸潤した葉の重量を測定し、別の浸透方法として真空フラスコを使用します。もう一度、葉を集めて蒸留水ですすいでください。ブラストして乾かした後、葉の重さを測ります。

最小容量が250ミリリットルのサイドアームフラスコを入手してください。葉をフラスコに入れ、蒸留水で覆います。次に、フラスコにストッパーを取り付け、サイドアームに真空ポンプを取り付けます。

圧力がかかるまで十分な時間、フラスコに真空剤を塗布します。約650ミリメートルの水銀。フラスコを静かに攪拌して、圧力を下げた状態で葉から気泡を放出します。

その後、約10秒かけて慎重にゆっくりと真空を解除します。バキュームを適用し、フラスコを攪拌し、葉が完全に浸透するまでバキュームを解放するプロセスを繰り返します。完全な浸潤の証拠は、浸潤した領域の色が暗くなっていることです。

完全に浸透した葉をフラスコから取り出し、吸収紙で葉をやさしく拭きます。表面の液体を除去するには、浸透した葉の重量を測定して、おおよその浸透量を決定できるようにします。葉が完全に浸透したら、遠心分離の準備

4インチ幅のパラフィルムをレイアウトします。パラフィルムに葉をのせます。次に、5ミリリットルのピペットチップを使用して、パラフィルムの葉を巻き上げます。

プランジャーを取り外した20ミリリットルのシリンジ本体を取り、丸めた葉をピペットの先端で挿入します。切り取った葉の端を、プランジャーの端に向けて配置します。50ミリリットルのポリエチレンまたはポリカーボネートチューブを入手し、シリンジを挿入します。

スイングバケットローター付きの遠心分離機を採用します。浸潤した葉の入ったチューブをロードし、摂氏4度と1000Gの遠心分離機を10分間遠心分離します。遠心分離後、葉を調べて、浸潤液の大部分が排出されているかどうかを判断します。

遠心分離機のチューブには、回収されたAPOプラスト洗浄液が入っており、回収されたアラスト洗浄液を新鮮な1.5ミリリットルのチューブにピペッティングします。APOプラスト洗浄液サンプルを遠心分離機に入れ、15, 000 Gで5分間回転させて、細胞や粒子状物質を除去します。遠心分離後、スーピネートを新しいチューブにピペットで移します。

サンプルをマイナス80°Cで保存できるようになるまで氷の上に置いておきます。APOプラット洗浄液の品質を評価する方法の1つは、APOプラット希釈係数を計算することです。これを行うには、この場合、それぞれが1つの容量に複数の浸透に十分な2つの容量の浸透流体蒸留水を準備します。

インジゴカルマイン粉末を最終濃度50マイクロモルまで加えます。もう一方には何も追加しません。96ウェルマイクロプレートを入手し、3つのウェルに200マイクロリットルの浸潤液を充填します。

インジゴカーミンを使用して、さらに3つに200マイクロリットルの混じりけのない浸透液を充填し、リーダー内のマイクロプレートをベースにして、各流体の吸光度を測定します。610ナノメートルでは、インジゴカルミンを含む流体の平均吸光度から液体の平均吸収剤を差し引いたものから、浸潤液の補正された吸光度が得られます。次に、各浸潤溶液について、葉浸潤プロトコルを3回複製します。

葉のサンプルを水に浸します。インディゴカーマイン浸透液を使用する場合は、負圧と正圧を加え、浸透後に蒸留水で葉をすすぎ、葉の表面に残っているインディゴカーマインを取り除きます。遠心分離機を使用して最後の洗浄液を回収します。

最後の洗浄液を回収した後、マイクロプレートのウェルにあるプレートリーダーに戻します。インディゴカーミンフリー抽出物の各200マイクロリットル、および各インディゴカーミンアラスト洗浄液抽出物の200マイクロリットルを配置しました。610ナノメートルでサンプルの吸光度を測定し、補正された吸光度を取得します。

数値の各セットを平均し、差を取ります。浸透液の補正された吸光度とアプラスチック洗浄液の補正された吸光度を使用してAPL希釈係数を決定し、アプラスチック液中の濃度または活性の推定値を取得します。インプランターは、最後の洗浄液からの濃度または活性値に、fasi vulgaris品種から抽出された最後の洗浄液の希釈係数を掛けます。

テンダーグリーンは、このガスクロマトグラフィー質量スペクトル有機酸を製造するために使用された。単糖とアミノ酸は、識別可能な代謝物の大部分を表しています。こちらはSDSページの比較で、fasi vulgarus alast洗浄液葉エキスのクマシステインジェルです。

抽出物は、細胞質汚染の量が異なります。これは、石膏酵素ルビスの量が異なることで観察されます。この手順を実行するときは、この手順に続いて、組織の損傷や細胞質汚染を引き起こさないように、少なくともできるだけ穏やかであることを覚えておくことが重要です。

タンパク質または代謝物質量分析などの他の方法を実施して、再生不良液の組成に関する追加の質問に答えることができます。アプラスチック洗浄液は、植物組織にコロニーを形成する微生物に対する再生不良化学物質の影響を研究するためのグロスメディウムとしても使用できます。