Name: T細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞からのT細胞分化法。OP9-DL1共培養システムを用いて造血幹細胞を誘導し、Tリンパ球の発生過程を研究する体外モデルを構築する詳細プロトコルを解説します。

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私たちはJoon Kim氏に専門的なフローサイトメトリーの支援に感謝します。著者らの研究室での研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)(BDOにSC1-GM095402を付与)およびカナダ衛生研究所(J.C.Z.P.)のSCOREプログラムによってサポートされています。J.C.Z.P.は、カナダ発生免疫学研究講座の支援を受けています。ハンターカレッジの生物医学研究インフラストラクチャは、助成金MD007599を通じてNIHマイノリティ機関研究センター(RCMI)プログラムによって部分的にサポートされています。また、ニューヨーク州幹細胞科学プログラム(NYSTEM)が、助成金C023048を通じてハンターカレッジでの幹細胞研究の開始を支援したことにも感謝しています。

<ol><li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>Pui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+expression+in+early+lymphopoiesis+influences+B+versus+T+lineage+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination.</a> Immunity. 11, 299-308 (1999).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1101 (1994).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-2-deficient+blastocyst+complementation%3A+an+assay+of+gene+function+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).</li>
<li>de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cell-derived+prehematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors.</a> Blood. 102, 1649-1653 (2003).</li>
<li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+autophagic+protein+beclin+1+early+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development.</a> J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).</li>
<li>Lahiji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+TCR-alpha+gene+locus+control+region+activity+in+T+cells+derived+in+vitro+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells.</a> J Immunol. 191, 472-479 (2013).</li>
<li>Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+embryonic+stem+cells+into+endothelial+cells+in+an+in+vitro+model+of+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.</a> Blood. 93, 1253-1263 (1999).</li>
<li>Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+lineage+analysis+by+cell+sorting+and+culture+identifies+FLK1%2BVE-cadherin%2B+cells+at+a+diverging+point+of+endothelial+and+hemopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages.</a> Development. 125, 1747-1757 (1998).</li>
<li>de Pooter, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+requires+GATA-2+to+inhibit+myelopoiesis+from+embryonic+stem+cells+and+primary+hemopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors.</a> J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).</li>
<li>Watarai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+NKT+cells+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+bearing+rearranged+invariant+Valpha14-Jalpha18+TCRalpha%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha.</a> 115, 230-237 (2010).</li>
<li>Pipkin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+transfer+activates+and+delineates+a+locus+control+region+for+perforin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin.</a> Immunity. 26, 29-41 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

OP9-DL1共培養系幹細胞からの血液細胞型の発達中のさまざまな遺伝子産物の役割を研究するために利用されている。8,12,13また、遺伝子調節DNAの機能を研究するための有効なモデルを証明して細胞分化の間に。9,14全体のマウスモデルの代替としてこの方法を使用すると、造血における多くの基本的な質問に対応した実験の時間とコストでかなりの節約をもたらすことができる。しかし、これらの目的のためにこのプロトコルの適合は、これらの手順で使用されるであろうMESCクローン間の潜在的な変動性の認識が必要である。公開されたプロトコルのタイムラインは、手入れの行き届いた、非操作さMESCライン、平均値から期待できる。7また、キメラマウスの作製のために選択されMESCクローンは通常、より高品質のものであり、OP9共培養では非常に堅牢に実行されます。一方、MESCクローンが安定から直接出現異所的に組み込まれた導入遺伝子を用いたトランスフェクションは、平均から平均以下の範囲の初期分化効率のさまざまな程度を表示します。ここに記載されているプロトコルは、in vitroでの造血の...

マウス胚性幹細胞(mESC)をin vitroでT細胞に分化させる細胞培養システムが確立されました。1 このシステムは、Notchシグナル伝達の能力を利用してT細胞の分化を促進します。2 OP9-DL1細胞株は、骨髄由来のOP9細胞3にNotchリガンドであるDelta-like 1(DL1)を形質導入することによって作製されました。4 in vitroでNotchシグナル伝達カスケードが活性化されると、T細胞の発達が促進され、他の細胞系譜が排除されます。適切なサイトカインを含めることで、このシステムは、mESCが造血、ひいてはT細胞系譜への逐次的な進行をサポートする細胞培養の「微小環境」を提供します。このシステムは、胸腺の正常なT細胞個体発生中に見られるさまざまな発生段階におけるT細胞のフローサイトメトリー同定をサポートします。T細胞の発生に関連する選択された問題を調査するために、この手順は、マウス胚性幹細胞由来の造血前駆体からT細胞の発達を誘発するために使用されるin vivo全マウスモデル5およびin vitro胎児胸腺臓器培養法の魅力的な代替手段となっています。6 OP9共培養システムの主な利点は、標準的で直接的な細胞培養技術を使用し、実験動物の継続的な使用に依存しないことです。
このアプローチを使用した実験では、以前に公開された詳細なプロトコルに従います。7 この技術を用いて、非操作mESCクローン、キメラ胚8作製のために厳選した高品質mESCクローン8、薬剤選択から直接得られる安定トランスフェクションESCクローンの造血分化産物を調べました。9 このモデルにおけるmESCから中胚葉様コロニーへの最初のin vitro分化の時間的動態は、個々のクローン間で変動する可能性があることに注目しました。mESC-OP9共培養は、中胚葉への進行について視覚的に評価できます。これは通常、共培養の5日目までに完了しますが、個々のクローンでは、完了が1日または2日遅れることがあります。定量的(~80-90%)中胚葉形成は、最適な造血前駆細胞(HPC)形成と堅牢なリンパフォポイシスを得るためには、移植前に達成する必要があります。したがって、複数のmESCクローンを扱う場合、この「5日目」の経過は、すべてのクローンが中胚葉様コロニーへの移行を完了するまで遅らせるのが最善です。これにより、造血分化条件に移行した後のクローン間のその後の発達の同期が可能になります。80-90%の中胚葉形成の通過から3日後、HPCはOP9単層から収集されます。HPCを新しいOP9細胞に播種して、単球細胞、赤血球、およびB細胞系統の分化を可能にすることができます。あるいは、HPCをOP9-DL1細胞に播種し、T細胞の発達に向けて駆動することもできます。すべてのin vitro分化培養物は、5日目からFlt-3Lを提供し、さらにIL-7を8日目から追加します。実験中のさまざまな時点で実施されるフローサイトメトリー解析により、造血分化とT細胞発生の段階と系統の進行をモニタリングできます。CD4/CD8二重陽性(DP)T細胞は、共培養の16日目までに出現し始め、DP細胞とCD8シングルポジティブ(SP)細胞の両方が20日目までに豊富に存在します。共培養の一般的な結果と堅牢性は、発生する重要な発達のターニングポイントの完了を視覚的に確認する能力に大きく依存します。このプロトコルは、これらのマイルストーンと、差別化を成功させるための鍵となるその他の重要なパラメーターを認識するためのガイドとなることを目的としています。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>幹細胞認定 FBS</td><td>Gemini</td><td>100-125</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl L-グルタミン</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPESバッファー&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>TMS-003-C</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシンリージェント溶液(50 mg / ml)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール(55 mM) in DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu;m PES膜</td></tr><tr><td>細胞培養グレード水</td><td>コーニング</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>12000-022</td><td>粉末、製造推奨重</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウムごとに再構成&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>SH 30396.03</td><td>個々のロットの試験が必要&nbsp;</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FLT-3 リガンド</td><td>R&D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>マウス組換えマウス IL-7</td><td>PeproTech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>LIF &nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>0.1%ゼラチン入りウトラピュア水</td><td>ミリポア</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEFs マイトマイシンC処理</td><td>ミリポア</td><td>PMEF-CF</td><td>有糸分裂的に停止したMEFは、</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー(40 &mu;m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100 x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6-well</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 mlポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き</td><td>BDファルコン</td><td>352235</td><td>チューブ、FACS用&nbsp;</td></tr><tr><td>ES R1細胞</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td></td></tr><tr><td>OP9細胞</td><td></td><td></td><td>細胞は、理化学研究所細胞リポジトリ(日本)から入手できます。</td></tr><tr><td>OP9-DL1細胞</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td>細胞はZ&uacuteから要求できます。&ntilde;iga-Pfl&uuml;cker研究所。</td></tr><tr><td>FlowJoソフトウェア&nbsp;</td>当研究室では<td>、Tree Star</td><td></td><td>FACSデータ解析</td></tr><tr><td>、Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>FACScan、FACSCalibur、FACSVantageを使用しています</td></tr></tbody></table>

t細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

OP9/OP9-DL1共培養システムは、マウスとヒトに由来する胚および造血の祖先から分化した血液細胞型を導き出すための確立された方法となっています。現在、造血に関連する複雑な遺伝的、細胞的、分子的な問題など、ますます多様化する問題に対処するために使用されており、これらの基本的な知見を治療応用につなげる取り組みの最先端にいます。手順は簡単で、定期的に堅牢な結果が得られます。しかし、in vitroで造血分化を成功させるには、試薬と細胞培養の維持に特別な注意を払う必要があります。さらに、このプロトコルは、難しくはありませんが、習得するために注意を払い、練習するテクニックに敏感なステップを特徴としています。ここでは、マウス胚性幹細胞(mESC)からTリンパ球を分化するための手順に焦点を当てます。私たちは、in vitroで再現性のある頑健な細胞分化を可能にする重要なステップとパラメーターについての議論を含む詳細なプロトコルを提供します。この技術は、動物の使用を減らし、コストを削減し、基礎実験とトランスレーショナル実験の両方のタイムラインを短縮する可能性があるため、この技術の幅広い採用を検討することは、この分野の利益になります。

LIFの存在下で、MEF上で増殖させた場合、たmESCは、未分化状態に維持することができる。理想的な条件下では、それらは位相差顕微鏡（ 図1）に光沢のあるハローに囲まれた細胞のコンパクトなコロニーとして見える。これらの培養物を毎日監視する必要があります。細胞のコンフルエンスに応じて、メディアを変更することができ、または細胞が分割することができる。隣接MESCコロニーは互いに接触点に来るべきではありません。未分化たmESCの正常な、健康な培養物は、 インビトロ T細胞分化に必須の出発点である。共培養を開始すると、それは細胞が過密することなく、完全にコンフルエントにすることをお勧めします。 OP9単層上に細胞を播種するために回収した細胞の大部分が（むしろフィーダー細胞以外）MESCであるようにするためである。合流点での主な違いは、0日に区別される各種MESCクローン間で観察されている場合、それはTISに予め付着によりMEFにを除去することがベストです共培養シードにたmESCをカウントする前に、（完全なES細胞培地を使用してステップ3.4.3-3.4.6のように）培養皿を訴える。 ...

マウス胚性幹細胞は、OP9-DL1共培養システムを使用してin vitroでT細胞に分化させることができます。この手順を成功させるには、試薬/細胞のメンテナンス、および主要な技術に敏感なステップに細心の注意を払う必要があります。ここでは、これらの重要なパラメータについて説明し、このテクノロジーの採用を促進するための詳細なプロトコルを提供します。

T細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

この手順の全体的な目標は、in vitroでマウス胚性幹細胞またはe ESCからのT細胞の定量的分化を促進することです。これは、最初にESCをOP9間質細胞の単層に播種することによって達成されます。5〜7日後、中胚葉のようなコロニー形成が収穫され、新鮮なOPナインセル単層に再メッキされます。3日後、小さな丸い造血前駆細胞またはHPCを採取し、新鮮なOP nine単層に移して赤血球、単球、およびB細胞を作製するか、新鮮なOP nine DL one単層に移してT細胞を作製します。最終的に、この方法は、造血とtリンパ球の発達を調節する分子、遺伝、細胞のイベントを研究するためのin vitroモデルとして使用できます。この手順は、トロント大学のJuan Carlos Sunga Fluker博士の研究室で開発されました。私たちは彼のグループからこの技術を学び、ハンター大学でのT細胞発生中の遺伝子制御の研究に応用することができました。この手法が既存の方法よりも優れている点は、動物を使わずに細胞株を用いたT細胞発生の実験的操作と観察が可能になることです。まず、50, 000個のマウスESCを10ミリリットルのOP 9メディアに希釈します。次に、OP 9培養プレートから古い培地を取り除いた後、ESC懸濁液を、細胞を均等に分布させ、5日目に細胞を摂氏37度でインキュベートするように注意します。コロニーの80〜90%が目に見える中胚葉のような形態を示している場合は、共培養皿から培地を吸引し、4ミリリットルのPBSで細胞を渦巻きながら洗浄します。次に、約5分後に摂氏37度でポイント25%トリプシンの4ミリリットルで細胞を切り離し、激しいピペッティングで細胞単層を破壊し、均質な大部分の単一細胞懸濁液が達成されるまで過度の気泡を導入しないように注意します。次に、細胞を4ミリリットルの完全なOP 9培地と混合し、新しい空の10センチメートル皿にプレレートします。30分後、非接着性の非op-nine細胞を40マイクロメートルのストレーナーで50ミリリットルの円錐管にろ過します。次に、6ミリリットルのPBSで皿をやさしく洗い、同じストレーナーに通します。アタッチされたOPを9セル残します。収集した細胞を400Gおよび摂氏4度で5分間スピンダウンし、ペレットを3ミリリットルの完全OP9培地に再懸濁します。細胞を数えた後、最適にコンフルエントなOP nine培養物から培地を取り出し、500, 000個の細胞を10ミリリットルの最終容量でOP nineプレートに播種します。各分析時点について、次に、各共培養物にヒト組換えリガンド1ミリリットルあたり5ナノグラムを補充し、3つのリガンドを適合させ、プレートをインキュベーターに入れます。8日目に顕微鏡で共培養を観察します。造血前駆細胞またはHPC

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Research

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Immunology and Infection

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マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

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マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

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胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

この資料では、効率的に派生し、胚盤胞の段階でマウス胚からの多能性幹細胞株を培養するプロトコルについて説明します。...

マウス着床前胚幹細胞の誘導

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学ぶマウス胚性幹細胞からのT細胞分化法。OP9-DL1共培養システムを用いて造血幹細胞を誘導し、Tリンパ球の発生過程を研究する体外モデルを構築する詳細プロトコルを解説します。

T細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの

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