Name: の高分解能電子顕微鏡ヘリコバクター·ピロリ CAG IV型分泌系線毛 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ高分解能走査型電子顕微鏡を用いたHelicobacter pyloriのCAG IV型分泌系線毛の可視化法。鉄制限条件下で線毛産生が増加することを示し、胃癌などの疾患メカニズム解明に貢献します。

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この研究は、退役軍人省のキャリア開発賞1IK2BX001701と、国立トランスレーショナルサイエンス推進センターからのCTSA賞UL1TR000445によって支援されました。 その内容は著者の責任であり、必ずしもNational Center for Advancing Translational SciencesまたはNational Institutes of Healthの公式見解を表すものではありません。 走査型電子顕微鏡実験は、NIHの助成金CA68485、DK20593、DK58404、DK59637、およびEY08126の支援を受けたVUMC Cell Imaging Shared Resourceを使用して部分的に実施されました。

1. H.ヒトの胃上皮細胞と鉄可用性と共培養の様々な条件でピロリ菌の成長<ol><li> H.を選択これらの研究のためのピロリ菌株のPMSS1それが無傷のCAG病原性島を有しており、機能しているIV型分泌系を表現しているため。また、ネガティブコントロールとして同質遺伝子ケージ変異体（PMSSIΔCAGE）を利用する。 5％CO 2存在下、37℃で24時間、5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したTSAプレート上で細菌を成長させる。 注：試薬を準備し、材料および装置の表で概説したような材料を組み立てる。各試薬の最終的な濃度は、括弧内に記載されています。 </li><li>滅菌綿棒を用いてプレートからの細菌をこすりや部品から製造された改質ブルセラブロス中に接種し（材料および機器の表を参照）およびコレステロールを補った。 37で一晩培養液をインキュベート毎分（rpm）200回転で振とうしながら、5％CO 2を補充した室内空気中のC°。 NOTE：コレステロール起因血清が複雑であるという事実のために、ウシ胎児血清の代わりに使用されている。結果のばらつきの原因となるようなヘムなどの栄養素の鉄の多数の供給源を含む。 </li><li>細菌培養の日に、12ウェルプレート（ウェル当たり約1×10 5細胞）でポリ-D-リシン処理したカバースリップ上にAGSヒト胃上皮細胞（ATCC CRL-1739）をシードする。 </li><li>次の日、100μMのFeCl 3を 、200μMのジピリジルの（合成鉄キレート剤）、または200μMのジピリジルプラス250μMのFeCl 3を補充しただけでは修正されたブルセラブロス中0.3のOD600以降に細菌培養を希釈。 200rpmで振盪しながら、5％CO 2を補充した室内空気中、37℃で4時間、これらの培養物をインキュベートする。 </li><li>千×gで遠心した細菌は、細胞を収集し、私を再懸濁する前に、上清を削除するにはnは新鮮修正ブルセラブロス等量のは、コレステロールを補った。文化の尺度OD600（×10 OD600 = 1.0 = 5.5 8細胞/ ml）及び20の感染多重度（MOI）の上皮細胞への細菌を追加：1。細菌細胞の生存率を評価するために、血液寒天プレート上に連続希釈し、プレート細菌細胞を実行する。 </li><li> Hをインキュベート走査電子顕微鏡（SEM）試料調製を行う前に、静的条件下で、5％CO 2の存在下、37℃で4時間ピロリおよびAGSヒト胃上皮細胞の共培養。 </li></ol> 2. SEM Hを可視化するためにサンプル調製ピロリ CAG-T4SS線毛<ol><li> Hを削除するピロリ菌とインキュベーターとデカント培養上清からのAGS共培養（IL-8 ELISAのために保存）。 0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で穏やかに3回洗浄する。 2.0％パラホルムアルデヒド溶液中で、室温で2.5〜4時間のサンプルを修正％グルタルアルデヒド、および0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液。一次固定した後、試料を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄する。 </li><li>つの連続10分間の固定ステップで0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の0.1％四酸化オスミウムを用いた二次固定を行う。二次固定した後、試料を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄する。 </li><li>一次および二次固定した後、 表1の通りのエタノール濃度を増加させて、順次洗浄することにより試料を脱水する。 </li><li>エタノール脱水後、液体二酸化炭素の3つの連続回の洗浄を行う。 1073 PSIの31.1ºCの温度及び圧力で臨界点乾燥機を用いて、臨界点でのドライサンプル。 </li><li>マウントは、アルミニウムのSEM試料スタブ上にカバースリップとの適切な接地を実現し、SEM画像中に充電を回避するために、サンプルエッジでコロイド銀の細い線を描く。 </li><li>コー​​トサンプルを5nmと試料の二次電子信号とエッジ効果を高めるためにスパッタコート機を用いて金 - パラジウム。 </li></ol>高解像度のSEM分析3.イメージングパラメータ<ol><li>電界放射銃走査電子顕微鏡（FEG-SEM）を持つビュー·サンプル。 </li><li> 5〜10ミリメートルの作動距離で高真空モードでの画像。 </li><li> 5 kVの加速電圧に設定してください。 </li><li> 2-2.5にスポットサイズを設定します。 </li><li>宿主 - 病原体インターフェースのより良いビューを達成するために、15〜25度の間の試料を傾けて。 </li><li>宿主 - 病原体相互作用のこれらの領域は線毛形成細菌のために濃縮されているように、高倍率の視聴のための上皮細胞のエッジに付着細菌を画像化する優先順位をつける。 </li></ol> Piliの数量化を評価するために4.統計分析<ol><li> H.を分析線毛/セルならびにpiliated脱pheを示す細胞のパーセント数を定量化するためにImageJソフトウェアを使用してピロリ CAG-T4SS線毛下記の指示に従ってNOTYPE。 </li><li> ImageJソフトウェアで開く顕微鏡写真ファイル。均一な幅（10-13 nm）を、長さ（60〜150 nm）を用いて、細菌細胞と宿主細胞との間に形成された構造として線毛を識別する。 注：線毛構造が主要なATPアーゼ大国IV型分泌線毛アセンブリをコードする遺伝子における不活性化を抱くようなΔ ケージ変異株として同質遺伝子株は、上のWTの細菌株上に存在するが、存在しない。 </li><li>直線ツールで線を引くと、次に「分析」タブをクリックすることにより、測定ツールを校正。ドロップダウンメニューから「セットスケール」を選択し、「既知の距離」というラベルの付いたボックスに倍率バーの値を入力し、適切な設定（ナノメートル）の長さの単位を設定します。 「OK」をクリックします。 </li><li>線毛の長さや幅を上に描画するために直線ツールを使用して、CAG-T4SS線毛を測定し、各線毛を測定するためには、 &quot;Ctrl-M」を押してください。測定された値を持つダイアログボックスを守ってください。これらの値を記録したりコピーし、表計算プログラムに貼り付けます。 </li><li>長さを使用し、幅のパラメータは、以前にCAG-T4SSのプロファイルに適合しない24、無視機能を設立しました。その後、10〜13 nmの幅と60〜150 nmの長さのカットオフ内にある値に基づいて線毛の数を定量化する。 </li><li>を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して両側スチューデントt検定によって統計的に線毛の定量分析を行う。 </li></ol> 5.オプション：IL-8分泌の評価は、線毛の生産と相関する<ol><li>ステップ2.1から上清を用い、キットを製造業者の指示（材料および装置の表を参照）ごとに、IL-8のELISAを行う。 </li><li> IL-8は、宿主細胞によって分泌を分析し、培地単独中で成長WT PMSS1に対するパーセントのIL-8誘導を計算する。これを、GraphPad Prismを使用して、両側スチューデントt検定を用いて統計分析を実行するftware。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

鉄は、細菌性病原体を含む人生のほとんどの形態、必須の微量栄養素​​である。侵入微生物の生存を制限するための努力では、脊椎動物のホストは「栄養免疫」18として知られるプロセスで栄養鉄を隔離する。これに応答して、細菌性病原体は、その周囲を感知し、そのような鉄獲得システム、毒素および毒素分泌機構19,20などの病原性機能の精緻化を調節するためにグローバルなシグナル伝達分子として鉄を使用するように進化してきた。 ピロリ菌は、鉄、亜鉛、および22を成長させるようなヘム、ヘモグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン23として代替鉄源を使用することができるマグネシウムなどの微量栄養素を必要とする。H.ピロリ菌は 、最も成功した病原体のように、それは、ホスト21からの栄養素の鉄を除去を助けるために病原性因子の幅広いレパートリーを進化してきました。一つの毒性因子、CagAは、エフェクターmolecuルCAG-T4SSのは、それが容易に栄養鉄源として細菌...

ピロリ菌感染は、胃がん1の重大な危険因子です。 しかし、疾患の転帰はさまざまであり、宿主の遺伝学、ピロリ菌株の遺伝的多様性、宿主食などの環境要素など、多くの要因に依存します11。 以前の報告では、ピロリ菌感染、鉄欠乏症(血中フェリチンおよびヘモグロビン濃度の低下によって測定)、およびIL-8分泌を含む炎症性サイトカイン産生の増加との間に相関関係が存在することが確立されています。これは最終的に胃疾患の進行の増加につながります12。 急性ピロリ菌感染は、宿主の栄養鉄吸収能力を損なう低塩素酸症とも関連しており、最終的には鉄の恒常性の変化につながります13。 これらの臨床知見は、胃ニッチ内の鉄の利用可能性が疾患の転帰における重要な要因である可能性があることを示唆しています。 実際、ピロリ菌感染の動物モデルでは、食事による鉄の摂取が少ないと胃疾患が悪化することが実証されています14。 これらの動物の鉄レベルの低下は、ピロリ菌が細菌の複製に必要な鉄を得るために鉄獲得応答を誘導することを必要とします。ピロリ菌は、宿主細胞内の鉄輸送を攪乱して、CagA依存的な方法で細菌の複製を促進する能力を持っています15。 興味深いことに、cag病原性島は鉄応答性転写因子Fur16,17によって制御されていることが示されています。 さらに、Cag+株は炎症の増加やがんなどの胃疾患と関連しています1。 これらの知見は、ピロリ菌が鉄欠乏環境に存在する宿主細胞から鉄を取得しようとしてCag-T4SSの発現を変化させ、疾患の転帰を悪化させるというモデルを支持しています。 
炎症と罹患率を増加させる2つの要因は、Cagの発現と食事による鉄の摂取量の少なさです。これらの事実は、鉄の利用可能性が減少すると、宿主病原体界面でのCag-T4SS線毛の産生が増加し、胃疾患が悪化するという仮説を支持しています11-14。 この原稿で提供されている方法の目標は、Cag-T4SSピルス生合成の調節における微量栄養素鉄の役割を確立することです。 以前の研究では、2つのアプローチを利用して、Cag-T4SS発現の鉄依存的な増加を観察しました。まず、高鉄食餌および低鉄食餌で維持された動物からの出力株を解析し、低鉄食餌の出力株が高鉄食餌株よりも多くのCag-T4SSピリを産生することを明らかにした14。第二に、H. pylori 7.13株をin vitroで鉄が豊富な状態で増殖させたところ、毛毛形成が減少し、鉄キレート剤の存在下で増殖した細胞は有意に多くの毛毛を産生しました。
私たちは、Cag-T4SS線毛表現型の鉄依存性制御の研究を続けており、追加のヘリコバクターピロリ菌株であるPMSS1を用いて実施された以下の最適化されたプロトコルと代表的な結果を提供しています。 この技術の開発の背後にある理論的根拠は、鉄制限の条件下でのCag-T4SS活性の増加とCag-T4SSの線毛形成の増加を相関させることでした。 この技術の広範な意味と使用により、Cag-T4SS線毛の産生を増加させる最適化された培養条件が提供されます。 このアッセイは、この重要な細菌表面の特徴を濃縮することにより、Cag-T4SSの組成と構造を決定しようとしている研究者にとって有用です。 電界放出型電子顕微鏡によるサンプル調製と可視化は、Cag-T4SSを可視化するための光学顕微鏡法などの代替技術に比べて多くの利点があり、このオルガネラ10の調節を研究することに関心のある研究者に適しています。

<table><tbody>カゼインからの<tr><td>変性ブルセラブロスペ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プトン(10 g / L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>動物組織の消化物(10 g / L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物(2 g / L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース(1 g / L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(5 g / L)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール(250X)(4 ml / L)</td><td>Life Technologies</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>塩化第二鉄(100または250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>ジピリジル(200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>修正RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI + HEPES(1X)</td><td>Life Technologies</td><td>22400-121</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(100 ml / L)</td><td>Life Technologies</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡の準備パラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド(2.0%水性)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>グルトアルデヒド(2.5%水性)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16220</td><td></td></tr>カ<tr><td>コジル酸ナトリウム(0.05 M)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム(0.1%水)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(絶対)</td><td>シグマ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>コロイド銀塗料</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>SEMサンプルスタブ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 分泌評価</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantikine IL-8 ELISA キット</td><td>R&Dシステムズ</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

の高分解能電子顕微鏡ヘリコバクター·ピロリ cag iv型分泌系線毛

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

ヘリコバクター・ピロリは、人間の人口の半分のヒト胃ニッチにコロニーを形成するらせん状のグラム陰性菌です1,2。 ピロリ菌は胃がんの主な原因であり、がん関連死の世界で2番目に多い原因です3。 胃疾患のリスク増加と関連している病原性因子の1つは、ピロリ菌の染色体内の40kbの領域であるCag病原性島であり、IV型分泌系と同族のエフェクター分子であるCagAをコードしています4,5。 Cag-T4SSは、CagAとペプチドグリカンを宿主上皮細胞5,6に移す役割を担っています。 Cag-T4SSの活性は、サイトカイン発現のアップレギュレーション、炎症誘発性経路の活性化、細胞骨格リモデリング、発がん性細胞シグナル伝達ネットワークの誘導など、宿主細胞生物学に多数の変化をもたらします5-8。 Cag-T4SSは、内膜と外膜にまたがり、細胞から細胞外空間まで伸びるサブアセンブリコンポーネントで構成される高分子マシンです。 Cag-T4SSの細胞外部分は「毛膜」5と呼ばれます。 多くの研究により、Cag-T4SS線毛は宿主-病原体界面9,10で形成されることが実証されています。 しかし、この重要なオルガネラの生合成を調節する環境的特徴は、ほとんど不明のままです。 最近、鉄の利用可能性が低い条件がCag-T4SSの活性と線毛生合成を増加させたことを報告しました。 ここでは、ヒト胃上皮細胞と共培養する前に、さまざまな鉄の利用可能性の条件下でピロリ菌を増殖させるための最適化されたプロトコルを紹介します。 さらに、高分解能走査型電子顕微鏡分析により、鉄制限条件下で示される超毛様化表現型の可視化のための包括的なプロトコルを提示します。

本稿では、鉄利用能を変化させる条件はH.を調節する能力を有することが実証されているホスト病原体の界面でのピロリ菌 CAG-T4SS線毛生合成。 、H。単独の培地で培養した場合ピロリ菌は 3線毛/セルの平均を形成している。ときにH.ピロリ菌は、鉄で栽培されて枯渇細菌の増殖（ 図1）サブ阻害性である（合成キレート剤ジピリジルを使用）の条件は、細菌が作り出す数々のCAG-T4SS線毛（〜7線毛/セル）とき、人間の胃の細胞と共培養（ 図2）。栄養鉄の外因性源が存在する場合には逆に、CAG-T4SS線毛の形成が抑制される（FE試料中の1未満線毛/細胞、1未満線毛/ FE +ディップサンプル中の細胞）（ 図2）。宿主-病原体界面での線毛の定量化は、鉄制限、Hの状態であることを明らかにしピロリ菌は、CAG-T4SS線毛た（p &lt;0.000の2倍の増加を示す 1）培地のみで増殖した細胞と比較して11％（p &lt;0.05...

ここでは、Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS)として知られる発癌性細菌オルガネラを可視化する方法を説明します。 Cag-T4SSは、鉄の利用可能性のさまざまな条件に応じて、ピロリ菌の表面で異なる方法で生成されることがわかりました。

の高分解能電子顕微鏡ヘリコバクター·ピロリ CAG IV型分泌系線毛

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

この手順は、鉄制限の条件下で発生するCAGタイプ4分泌システムpiiの過剰産生を視覚化します。第2のステップは、ピロリ菌を胃上皮細胞と共培養することです。次に、共培養サンプルを走査型電子顕微鏡で処理します。最終的には、鉄制限の条件下でCAGタイプ4分泌系のpi eye産生の増加を示すために使用される高解像度走査型電子顕微鏡法。この原稿の技術は、CAGタイプ4分泌系が疾患予後不良のリスク増加と関連しているため、胃がんなどのピロリ菌関連疾患にとって重要です。したがって、この重要な細菌表面の調節についての理解を深めることができます。オルガネラは、新しい化学療法の標的を明らかにすることができます そして、蛍光顕微鏡法などの既存の方法に対する高解像度走査型電子顕微鏡法の利点は、個々のタイプ4分泌錠剤を視覚化できることです。電子顕微鏡法のこの方法に不慣れな個人は、手順、特に慎重なタイミングと繊細な手を必要とするため、湿式化学に問題を抱えています。寒天プレートが成長します。HピロリPM、S1細菌、およびその同質遺伝子CAG e変異体は、機能するタイプ4の分泌システムを欠いています。培養物を接種し、コレステロールを補給した改変エラブロスを一晩で成長させます。次に、GSヒト胃上皮細胞を、鉄の利用可能性のさまざまな条件に対応する12ウェルプレートのポリリジン処理カバースリップに播種します。ピロリ菌を光学濃度600の0.3に希釈し、改質ブルブロスのみで溶解します。100マイクロモルの塩化鉄、200マイクロモルの合成鉄キレート剤ディッパー、または200マイクロのディッパーと200マイクロモルの塩化鉄培養液を含む培地。4時間のサンプルでバクテリアを1000Gで遠心分離し、Resusはコレステロールを補給した新鮮な改変ブルブロスにペレットを懸濁します。細菌密度を測定します。次に、上皮細胞にhピロリ菌を20対1の多重感染で感染させます。段階希釈を行い、細菌細胞を血液寒天プレートに播種します。細菌細胞の生存率を評価するには、共培養物を細胞培養インキュベーターに4時間置きます。hピロリIとGS共培養物から上清をデカントします。接着細胞を0.05モルのコート酸ナトリウム緩衝液で3回穏やかに洗浄します。その後、サンプルを室温で2〜4時間固定します。次に、サンプルを0.05モルのCa酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄します。二次固定では、0.05モルのCaコー酸ナトリウムバッファーに0.1%四酸化オスミウムを2つの連続した10分間の固定ステップで添加します。次に、3回の洗浄後、エタノールの濃度を上げてサンプルを脱水します。サンプルを臨界点乾燥機に置き、チャンバーに液体二酸化炭素を充填します。エタノールをチャンバーからパージし、チャンバーに液体二酸化炭素を再び充填します。その後、サンプルは摂氏31.1度の臨界点まで運ばれ、1073 PSIは、アルミニウムSEMサンプルスタブにカバースリップを取り付け、接地のためにサンプルエッジにコロイド状銀の細い線をペイントします。SEMイメージングでは、スパッタコートマシンを使用して、サンプルに5ナノメートルの金パラジウムをコーティングして、サンプルの二次電子信号とエッジ効果を高めます。電界放出型電子顕微鏡の画像を使用して、5〜10ミリメートルの作動距離で高真空モードでサンプルを検査します。加速電圧を5キロボルトに設定します。次に、スポットサイズを2から2.5に設定します。次に、サンプルを15〜25度傾けて、宿主の病原体界面をよりよく見ることができ、高倍率で見ることができます。上皮細胞のエッジに付着する細菌のイメージングを優先し、宿主病原体の相互作用に富むPI生命を温める細菌を検出します。Image Jソフトウェアで顕微鏡ファイルを開きます。細菌細胞と宿主細胞の間に形成される構造が、幅10〜13ナノメートル、長さ60〜150ナノメートルの均一であることを特定します。直線ツールで線を引き、ドロップダウンメニューから[分析]タブをクリックして、測定ツールをキャリブレーションします。[スケールの設定]を選択し、既知の距離で倍率バーの値を入力し、長さの単位をナノメートルに設定します。次に、[OK]をクリックします。次に、直線ツールを使用してパイロットの長さまたは幅を描画し、コントロールMを押して各パイロットを測定し、測定値をスプレッドシートプログラムに記録します。CAGタイプ4分泌システムのプロファイルに適合しない特徴を無視するために、以前に確立された長さと幅のパラメータを使用してください。次に、統計的に分析された範囲内の値に基づいてPI Iの数を定量化し、両側スチューデントT検定を使用してPI LIを定量化します。この実験では、ピロリ菌を鉄が枯渇した条件で、合成キレート剤のディップパリタールを使用して、成長を著しく阻害しない濃度で培養しました。この細菌は、ヒト胃細胞と共培養すると、多数のCAGタイプ4分泌系PIIを産生しました。逆に、栄養鉄の外因性供給源が存在する場合、CAGタイプ4分泌系PIIの形成が抑制されます。宿主病原体界面におけるPIIの定量化により、鉄制限の条件下では、ピロリ菌はCAGタイプ4分泌系PI eyeで2倍の増加を示し、培地のみで増殖した細胞と比較して、積み重なった細胞の割合が11%増加することが明らかになりました。興味深いことに、宿主IL 8の分泌によって測定されるCAGタイプ4分泌系の活性は、鉄制限条件下では増強され、過剰な鉄の利用可能性の条件下で抑制されますが、PI LIの寸法は鉄の利用可能性のすべての条件で一貫しています。CAGタイプ4分泌システムの関与と一致して、鉄の利用可能性は、その発生後にCAG e変異体の表面上のPI LIの生合成を変化させない。このSEM技術は、CAGタイプ4分泌システムの分野の研究者がタンパク質の局在を探求する道を開きました。CAGタイプ4分泌システム枕に関して。最近、エフェクタータンパク質CAGaが4型分泌錠剤の先端に局在することが発見されました。

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Research

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