の高分解能電子顕微鏡ヘリコバクター·ピロリ CAG IV型分泌系線毛

この手順は、鉄制限の条件下で発生するCAGタイプ4分泌システムpiiの過剰産生を視覚化します。第2のステップは、ピロリ菌を胃上皮細胞と共培養することです。次に、共培養サンプルを走査型電子顕微鏡で処理します。

最終的には、鉄制限の条件下でCAGタイプ4分泌系のpi eye産生の増加を示すために使用される高解像度走査型電子顕微鏡法。この原稿の技術は、CAGタイプ4分泌系が疾患予後不良のリスク増加と関連しているため、胃がんなどのピロリ菌関連疾患にとって重要です。したがって、この重要な細菌表面の調節についての理解を深めることができます。

オルガネラは、新しい化学療法の標的を明らかにすることができます そして、蛍光顕微鏡法などの既存の方法に対する高解像度走査型電子顕微鏡法の利点は、個々のタイプ4分泌錠剤を視覚化できることです。電子顕微鏡法のこの方法に不慣れな個人は、手順、特に慎重なタイミングと繊細な手を必要とするため、湿式化学に問題を抱えています。寒天プレートが成長します。

HピロリPM、S1細菌、およびその同質遺伝子CAG e変異体は、機能するタイプ4の分泌システムを欠いています。培養物を接種し、コレステロールを補給した改変エラブロスを一晩で成長させます。次に、GSヒト胃上皮細胞を、鉄の利用可能性のさまざまな条件に対応する12ウェルプレートのポリリジン処理カバースリップに播種します。

ピロリ菌を光学濃度600の0.3に希釈し、改質ブルブロスのみで溶解します。100マイクロモルの塩化鉄、200マイクロモルの合成鉄キレート剤ディッパー、または200マイクロのディッパーと200マイクロモルの塩化鉄培養液を含む培地。4時間のサンプルでバクテリアを1000Gで遠心分離し、Resusはコレステロールを補給した新鮮な改変ブルブロスにペレットを懸濁します。

細菌密度を測定します。次に、上皮細胞にhピロリ菌を20対1の多重感染で感染させます。段階希釈を行い、細菌細胞を血液寒天プレートに播種します。

細菌細胞の生存率を評価するには、共培養物を細胞培養インキュベーターに4時間置きます。hピロリIとGS共培養物から上清をデカントします。接着細胞を0.05モルのコート酸ナトリウム緩衝液で3回穏やかに洗浄します。

その後、サンプルを室温で2〜4時間固定します。次に、サンプルを0.05モルのCa酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄します。二次固定では、0.05モルのCaコー酸ナトリウムバッファーに0.1%四酸化オスミウムを2つの連続した10分間の固定ステップで添加します。

次に、3回の洗浄後、エタノールの濃度を上げてサンプルを脱水します。サンプルを臨界点乾燥機に置き、チャンバーに液体二酸化炭素を充填します。エタノールをチャンバーからパージし、チャンバーに液体二酸化炭素を再び充填します。

その後、サンプルは摂氏31.1度の臨界点まで運ばれ、1073 PSIは、アルミニウムSEMサンプルスタブにカバースリップを取り付け、接地のためにサンプルエッジにコロイド状銀の細い線をペイントします。SEMイメージングでは、スパッタコートマシンを使用して、サンプルに5ナノメートルの金パラジウムをコーティングして、サンプルの二次電子信号とエッジ効果を高めます。電界放出型電子顕微鏡の画像を使用して、5〜10ミリメートルの作動距離で高真空モードでサンプルを検査します。

加速電圧を5キロボルトに設定します。次に、スポットサイズを2から2.5に設定します。次に、サンプルを15〜25度傾けて、宿主の病原体界面をよりよく見ることができ、高倍率で見ることができます。

上皮細胞のエッジに付着する細菌のイメージングを優先し、宿主病原体の相互作用に富むPI生命を温める細菌を検出します。Image Jソフトウェアで顕微鏡ファイルを開きます。細菌細胞と宿主細胞の間に形成される構造が、幅10〜13ナノメートル、長さ60〜150ナノメートルの均一であることを特定します。

直線ツールで線を引き、ドロップダウンメニューから[分析]タブをクリックして、測定ツールをキャリブレーションします。[スケールの設定]を選択し、既知の距離で倍率バーの値を入力し、長さの単位をナノメートルに設定します。次に、[OK]をクリックします。

次に、直線ツールを使用してパイロットの長さまたは幅を描画し、コントロールMを押して各パイロットを測定し、測定値をスプレッドシートプログラムに記録します。CAGタイプ4分泌システムのプロファイルに適合しない特徴を無視するために、以前に確立された長さと幅のパラメータを使用してください。次に、統計的に分析された範囲内の値に基づいてPI Iの数を定量化し、両側スチューデントT検定を使用してPI LIを定量化します。

この実験では、ピロリ菌を鉄が枯渇した条件で、合成キレート剤のディップパリタールを使用して、成長を著しく阻害しない濃度で培養しました。この細菌は、ヒト胃細胞と共培養すると、多数のCAGタイプ4分泌系PIIを産生しました。逆に、栄養鉄の外因性供給源が存在する場合、CAGタイプ4分泌系PIIの形成が抑制されます。

宿主病原体界面におけるPIIの定量化により、鉄制限の条件下では、ピロリ菌はCAGタイプ4分泌系PI eyeで2倍の増加を示し、培地のみで増殖した細胞と比較して、積み重なった細胞の割合が11%増加することが明らかになりました。興味深いことに、宿主IL 8の分泌によって測定されるCAGタイプ4分泌系の活性は、鉄制限条件下では増強され、過剰な鉄の利用可能性の条件下で抑制されますが、PI LIの寸法は鉄の利用可能性のすべての条件で一貫しています。CAGタイプ4分泌システムの関与と一致して、鉄の利用可能性は、その発生後にCAG e変異体の表面上のPI LIの生合成を変化させない。

このSEM技術は、CAGタイプ4分泌システムの分野の研究者がタンパク質の局在を探求する道を開きました。CAGタイプ4分泌システム枕に関して。最近、エフェクタータンパク質CAGaが4型分泌錠剤の先端に局在することが発見されました。