最適化された元OVO開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

この方法の全体的な目標は、ニワトリ胚に最適化されたX ovo培養技術を提示することであり、これにより、ハンバーガーおよびハミルトンステージ19からステージ40までの後期発生までの胚発生を観察できます。この方法は、発生生物学研究室の学生だけでなく、ニワトリの胚をモデル生物として使用してこのX ovo培養法を設定したい研究者にも役立ちます。まず、卵を準備します。

卵は摂氏37度、湿度40%で約3日半インキュベートされており、これはハンバーガーとハミルトンのステージ19とほぼ相関しています。卵子は、殻が割れたときに胚が汚染されないように、70%エタノールを噴霧して調製します。卵を散布した後、卵はしばらく乾燥させます。

湿度チャンバーが準備されている間、湿度チャンバーはジップロック容器で作られています。湿度チャンバーを構築する最初のステップは、1〜2センチメートルの吸収性パッドの層を追加することです。この場合、キムはワイプしますが、綿のパッドの層も使用できます。

この吸収性パッドの層は、ここに示されているジップロック容器のベースに収まります。吸収層が所定の位置にあると、約150ミリリットルの蒸留水が容器の底に注がれます。この水の大部分はパディングによって吸収されるべきです。

これで湿度チャンバーが完成し、横に配置できます。小さな無菌のウェイボートを使用して、胚が殻から取り出されるときに胚を抱きかかえます。方法ボートは、インキュベーター内の卵の向きのために8.8センチメートル四方を測定し、胚は卵の上面に位置しているため、シェルは反対側で割れる必要があります。

次に、殻をそっと割って、卵をウェイボートのすぐ近くに置きます。1回の滑らかな動きで、卵子は引き離され、胚はボートの道に穏やかに放出されます。次に、胚を検査して、ヨークがまだ無傷であり、胚が生存可能であることを確認します。これは、ここに示すように、目に見える心拍と明らかな異常がないことを示しています。

次に、胚に抗生物質を追加して、感染と戦うのを助けます。凍結融解の頻度を最小限に抑えるために、5, 000単位のペニシリンと5ミリグラムのストレプトマイシン/ミルの濃度のペニシリンストレプトマイシンが割り当てられています。イベント。アリコートから40マイクロリットルを取り出し、ピペットを使用して周囲のアルブミンに加えます。

これで、胚を慎重に湿度チャンバーに入れる準備が整いました。湿度チャンバーに入ると、胚には汚染を防ぐために蓋が付けられます。9.5センチ四方の正方形のシャーレの蓋がウェイボートの上に置かれています。

ウェイボートの縁に湿気がないようにして、ペトリ皿とウェイボートの間にシールが形成され、胚への酸素が制限されないようにすることが重要です。次に、湿度チャンバーを完成させるために、ジップロック容器に蓋をします。ただし、蓋の2つの角だけが所定の位置に押し込まれているため、他の角は開いたままになり、空気の流れが胚に到達します。

湿度チャンバーが完成したら、37度のインキュベーターに入れ、胚が4日半後も成長を続けることができます。湿度チャンバーはインキュベーターから取り外すことができ、胚は約ステージ34で観察できます。この時点で、学生は血管系、大きな目、手足の芽などの胚を簡単に観察できます。

胚はさらに解剖顕微鏡で観察することができ、胚操作など、より高度な研究を行うことができます。この段階で胚を観察した後、胚は37度のインキュベーターに戻すことができ、少なくともステージ40、つまり14日間のインキュベーションまで成長し続けることができます。結論として、この方法は、卵殻の外側でニワトリの胚を培養することの最適化を示しています。

これは、学生が忙しい研究室環境でニワトリの胚の発生を観察する機会を提供し、さらに、研究者が操作を行っている場合に胚へのアクセスを提供します。