におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価するエクスビボ Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

この手順の全体的な目標は、生理学的流動条件下で白血球と内皮接着分子との相互作用を評価するための ex vivo 動静脈閉回路を作成することです。これは、まず、目的の内皮接着分子で薄いガラスチャンバーをコーティングすることによって達成されます。第2ステップでは、ポリエチレンとシリコンチューブをチャンバーに接続し、次に外科的にマウスに接続します。

次に頸動脈からの血液がチューブを通って流れるのを許します。そして、天然白血球とコーティングされたガラスチャンバーとのその後の相互作用はリアルタイムで記録されます。最終的には、固定化された接着分子との相互作用による白血球の変位と転がり速度に対するさまざまな処理の影響を経時的に計算できます。

この手法は、プロサイトメトリー解析などの既存の手法と比較した場合の主な利点として、この手法では、白血球と内皮分子との相互作用を生理学的流動条件下で評価できることです。実験の前日、1センチメートルのPE10ポリエチレンチューブを6センチメートルのシリコンチューブに接続し、続いて5センチメートルのポリエチレンチューブを接続します。動物の頸静脈側のチューブセットアップを準備するには、1 cmのポリエチレンチューブから約1.5 cm離れた6 cmのシリコンチューブ内にTTUを追加して、先ほど示したようにチューブを接続します。

次に、10センチメートルのシリコンチューブの一方の端を圧力トランスデューサーに接続し、頸動脈側のTチューブのT端をもう一方の端に挿入します。接続サイトがしっかりと固定され、漏れがないことを確認してください。次に、25ゲージの針に接続された1ミリリットルのシリンジを使用して、各マイクロフローチャンバーに新たに調製された目的の内皮表面コーティングタンパク質を注入し、コーティングされたチャンバーを摂氏4度の15ミリリットルチューブに翌日一晩保管します。

頸静脈チューブと頸動脈チューブをマイクロフローチャンバーに接続するには、チャンバーの両側に1センチメートルのシリコンチューブを接続し、チューブがチャンバーに接するように伸びた小さな長方形のパラメータで接続をシールします。シリンジを使用して、チャンバーとチューブに0.1%ウシ血清アルブミンを充填します。その後、漏れがないか確認した後、チャンバーに45分間インキュベー

インキュベーションの終わり近くの室温で、マイクロフローチャンバーをノッチからペトリ皿まで安定させ、各ノッチに少量のシリコンを滴下します。次に、頸静脈チューブと頸動脈チューブをチャンバーの両側に接続します。次に、シリコーンが乾燥している間に、ヘパリンを充填した60ミルのロックシリンジを圧力トランスデューサに接続し、気泡がなくなるまで100 USPグレードのヘパリンをチューブとチャンバーに流します。

マウスをマイクロフローチャンバーに接続する前に、コンピューター、顕微鏡、および適切な圧力記録装置の電源を入れてください。ソフトウェアをセットアップしたら、10〜12週前のマウスを固定します。腹側位置では、ハサミで首の部分を切開し、甲状腺を解剖して気管と血管を露出させます。

頸動脈が完全に露出するまで洗浄します。迷走神経を傷つけないように注意してください。次に、折りたたまれた縫合糸の曲がりを頸動脈の下に通し、曲げで縫合糸を切断します。

つまり、動脈の下には2つの縫合糸があるのです。各縫合糸を締めずに結び目にループし、同じように左頸静脈の縫合糸を配置します。頸静脈縫合糸が所定の位置にあるとき、マウスIPに1ミリリットルのヘパリンを注入します。

注射後、頸動脈の上部縫合糸を締め、血管クランプを動脈の露出部分にできるだけ低く配置します。鉗子を使用して上部縫合糸で動脈を保持し、次に細かいマイクロハサミを使用して、上部縫合糸に近い動脈の円周の約8分の1に小さな切開を行います。次に、チューブホルダーを使用して動脈に切開した部分から頸動脈チューブを挿入し、下部縫合糸で下ろします。

次に、下の縫合糸を結び、続いて上の縫合糸を結びます。そのため、動脈はチューブの周りに密閉され、いくつかの結び目を作ってしっかりと密閉されます。頸静脈チューブについても同じ手順を繰り返した後、血管クランプを除いた頸動脈チューブの血管クランプを一時的に開いて流れをテストします。

漏れがない場合は、マウスを顕微鏡に移動し、頸動脈と頸静脈のチューブをマイクロフローチャンバーチューブに接続して、マイクロフローチャンバーを通る白血球の回転速度を記録します。頸動脈クランプを完全に解放して、チャンバーを満たします。血液を3〜5分間循環させて、流れの状態を安定させます。

それまでの間、チャンバーが顕微鏡の対物レンズと同じ高さになり、その端が画面上のビデオ録画ウィンドウと平行になるように、顕微鏡のステージを調整します。次に、室温の水でシャーレを作り、チャンバー内を流れる細胞が見えるように10 x 水浸対物レンズをディッシュに下げ、必要に応じて光強度を調整して中程度の生理学的流量圧力をシミュレートし、トランスデューサーが安定した30 mmの水銀を読み取るようにチューブのクランプを調整します。次に、開始を押して、白血球の輸送と圧力の両方の記録を開始し、最初の時間経過はチャンバーの頸静脈端に近く、完了するまで頸動脈端に向かって流れに逆らって移動します。

記録が終了したら、入力部位のバルブを閉じて血流を止め、必要に応じてチャンバーを別の接着分子でコーティングした新しいチャンバーと交換します。各記録中、チャンバー内では相互作用する白血球のみが明らかになります。例えば、これらの各画像では、白い矢印は、対象の接着分子によって捕捉され、他の自由に流れる細胞の中でチャンバーに沿って転がっている個々の白血球を示しています。

血流の中では、チャンバーの外側に共通のアーティファクトが見られ、すべての画像に大きな暗い球体が見られ、視聴者は固定点に対する白血球の動きを理解するのに役立ちます。グラフは、データの最終的なプロットを示しています。第1の実験的処置は、左へのシフトとして明らかな圧延速度を減少させることが観察され、第2の実験的処置は、制御圧延速度と比較して、右へのシフトとして現れる速度を増加させることが観察された。

白血球の標識やvivo x Vivaなどの他の方法を利用して、特定の白血球サブタイプの疾患の進行の寄与などの他の質問に答えることができます。