Name: 転写開始点を決定するための蛍光に基づくプライマー伸長技術とのRNaseの切断サイトインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶ蛍光プライマー伸長法による細菌転写開始点とRNA切断サイトの同定。自動ゲルシーケンサーを用いて高感度にin vivo解析を行い、遺伝子発現制御の理解に貢献する。

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研究室での彼女の支援に対して、また自動化されたゲルシーケンサーの支援に対してVera Augsburgerに感謝します。私たちは、SPP1316およびSPP1617の「優先プログラム」内の助成金BE4038/2およびBE4038/5による資金提供について、ドイツ研究振興協会に感謝します。

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
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<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

著者らは、利益相反を引き起こすような開示すべきことは何もありません。

蛍光プライマー伸長はTSP-または二次RNA処理識別のためのいずれか、RNAの5 &#39;末端を決定するための簡単​​かつ迅速な方法である。原因蛍光プライマーの使用のために、反応が設定することができ、（放射性標識したプライマーの場合と異なり）追加のセキュリティ対策なしで実行されます。サンプルは、蛍光によって検出されるように、電気泳動、X線フィルムが一般的に使用される放射性の方法に比べて迅速な分析を可能にする進行中に、それらを画像化することができる。 一般に、プライマー伸長反応の品質グレードとプライマーの結合能力に強く依存する。結合部位は、関心のある領域に近づき過ぎ選択される場合、プライマースミア信号をマスクすることができ、結合部位に対し、遠すぎる（&gt; 300 bp）の5 &#39;末端から劣悪な信号をもたらし得る。 蛍光色素は、共有結合しなければなりません合成およびオリゴヌクレオチド中のカスタムDNAオリゴヌクレオチドの5 &#39;末端は、残留塩による逆転写反応との干渉を防止するために、HPLCにより精製されるべきで...

プライマー伸長は、1つの基地解像度までの特定のRNA分子の5 '末端を決定するための分子方法である。そのような5'-RACE（cDNA末端の迅速増幅）のような他の方法の利点は、高速のターンアラウンドタイムと容易にRNA分子の異なる長さの混合物を分析する能力である。 この方法は、特定の長さのcDNA断片を生成する、特異的な蛍光プライマーを用いて逆転写反応するRNA分子を供することによって動作する。これらのcDNA分子は、変性ポリアクリルアミドゲル上で従来のサンガー配列決定反応2と一緒に実行される起因蛍光標識プライマーの使用に、それらの蛍光によって検出することができる。 cDNA断片の長さは、5 'RNA末端のマッピングを可能にする、シークエンシングラダーとの比較によって評価される。 伝統的に、プライマー伸長反応は、組み合わせて使用​​される放射性同位体でX線フィルム上のcDNA分子を検出することができる。それらの感度が若干低いとはいえ起因する健康被害、廃棄物処理の問題や取り扱いの容易さのために、より新しいプロトコルは、自動化されたシーケンサーを持つプライマー伸長を検出するための蛍光を利用している。蛍光プライマーは（我々の手で一年以上）、長い​​間安定しているように、蛍光標識されたプライマーを用いて、定期的な放射性標識化手順は、省略することができる。 ここで記述する方法は、自動化されたゲルシーケンサーを利用したが、若干の変更を加えて、キャピラリーシーケンサーも、cDNAの分離および検出の3のために使用することができる。ゲル分析の並列性は、RNA切断または加工の小さな量を検出することが可能となる。別の利点は、検出することができる末端切断、あるいは一つの塩基の処理として、この方法は、高解像度である。 RNA切断または処理、tは検出に関してはypicallyプライマー拡張の2つのタイプが区別される。他の場合には、処理は、生体内で行われ、得られたRNAが精製されるのに対し、あるケースでは、酵素処理は、精製されたRNAおよび精製された酵素を用いてインビトロで行われる。プライマー伸長は、in vitroで実施する両方の場合において、RNAは、RNAの供給源に依存して、しかし、供され、この方法は、in vitroまたはin vivoでのプライマー伸長と呼ばれるか。ここで提示したプロトコルでは、使いやすさのために（無精製タンパク質必要）と同時に、転写開始点と処理を決定する可能性を、in vivoでのプライマー伸長のみに焦点を当てる。しかし、in vitroでのプライマー拡張は同じように設定する原則にあり、このプロトコルは、出発点として役立つことができる。 ここに示された方法は、それらが高に適しているように、多くの細菌種に適用することができ純度および核酸の高収率製剤。 私たちの研究室での研究は、毒素-抗毒素（TA-）システム4,5、プライマー伸長法が広く使用されているフィールドの規制範囲に焦点を当てています。 TA-システムが安定しており、内因的に積極的な毒性タンパク質や毒性6,7を打ち消す主に不安定なタンパク質またはRNA抗毒素で構成され、原核生物のゲノム中に存在する小さな遺伝的要素である。毒素活性は、しばしば複製の阻害、細胞壁合成、または他の機構によって作用するが、ほとんどの場合RNase活性8,9によってれる。一般的に、RNアーゼ特異性プライマー伸長法であるそのうちの一つの異なる試験を行うことによって決定される。切断された完全長断片の混合物が同時にそれらの5 '末端を決定するために分析することができるように、プライマー伸長反応は、この用途に非常に適している。 、in vitroおよびin vivoプライマーエクステンション内のミックスを使用特定の毒素のRNase切断は、 例えば、配列特異性は、10-13を決定することができる。 <img alt="プライマー伸長、RNA単離、cDNA合成、サンガーシーケンシング、ゲル電気泳動図" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図1"> プライマー伸長手順の概要を図1。細菌培養実験のニーズに応じてインキュベートし、処理される。全RNAを、細胞から抽出したDNAの痕跡を除去するためにDNアーゼIで処理したcDNAを得た標的特異的蛍光DNAプライマーを用いて逆転写反応に供される。ゲノムDNAまたはプラスミドを抽出し、続いてcDNA断片とサイズ比較用蛍光サンガー配列決定反応のために使用される。プライマー伸長産物は、変性尿素ポリアクリルアミドゲル上サンガーシークエンシング産物と一緒に実行して、自動化されたレーザー顕微鏡で分析する。ラcDNAのバンドとラインアップしているシーケンシングベースSTの5 'cDNAの端（青い矢印）のベース。 Feketeの中でより多くの情報、 ら 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 全体のプライマー伸長手順の概要を図1に見ることができる。簡単に説明すると、細菌細胞を培養し、収穫し、細胞ペレットを溶解し、RNAを抽出した。精製されたRNAは、逆転写酵素のためのテンプレートとして作用し得るDNA分子の痕跡を除去するためにDNアーゼIで処理する。特異的な蛍光プライマーは、RNAに付加関心領域にハイブリダイズし、続いて一本鎖の相補的DNA（cDNA）の結果として、逆転写されている。配列決定ラダーは、蛍光プライマーを用いた従来のサンガー配列決定によって作成され、プライマー伸長cDNA断片の横に変性ポリアクリルアミドゲル上で分離する。結果として生じるゲルは、対象の5 '末端の同定を可能にする、蛍光バンドを比較することによって分析される。転写開始点およびプロセシング部位は、次いで配列比較によって個別に評価される。

<table><tbody><tr><td>AMV 逆転写酵素 (20-25 U/&micro;l)</td><td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識プライマー</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5'DY-681の修正普通"DNAオリゴヌクレオチド。LICOR IRDye 700/800などの互換性のある染料は、IDTdnaなどの他のサプライヤーからも入手できます。</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 シーケンサー ImagIR データ収集ソフトウェア</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>製品販売終了</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid mini preparation kit</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrate</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>RNAストレージバッファ</td><td>アンビオン(ライフテクノロジーズ)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P / C / I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>代替品:"酸フェノール:クロロホルム、pH 4.5 (IAA含有、125:24:1)アンビオンから(AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull;RNase Inhibitor</td><td>Ambion(ライフテクノロジー)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase蛍光標識プライマーサイクルシーケンシングキット、7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol試薬</td><td>ライフサイエンス</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ 0.1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

転写開始点を決定するための蛍光に基づくプライマー伸長技術とのrnaseの切断サイトインビボ

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

蛍光ベースのプライマー伸長（FPE）は、転写開始点またはRNA分子のプロセシング部位を決定するための分子方法である。これは、特定の蛍光標識プライマーおよび変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られたcDNA断片のその後の分析を使用して、目的のRNAを逆転写することによって達成される。同時に、従来のサンガー配列決定反応は、正確な対応するベースにcDNA断片の末端をマッピングするためにゲル上で実行される。生成物をクローン化しなければならず、複数の候補を配列決定5&#39;-RACE（cDNA末端の迅速増幅）とは対照的に、プライマー伸長によって生成されたcDNA断片の大部分は、同時に1つのゲルの実行を検出することができる。また、（逆転写の結果の最終分析に）全体の手順は、1営業日で完了することができる。蛍光標識されたプライマーを用いることによって、危険な放射​​性同位体の使用は、試薬を標識回避することができ、生成物は、電気泳動手順中に検出することができるように、処理時間が低減される。 以下のプロトコールでは、確実かつ迅速にS.（例えば、毒素-抗毒素システムコンポーネントによって）開始点及びRNAプロセッシング部位、転写を推定するRNAの5 &#39;末端を検出するためのin vivo蛍光プライマー伸長方法を記載球菌、E。 coliおよび他の細菌。

図6に示されるように、プライマー伸長反応は、目的の転写物の転写開始点を決定するために用いることができる（通常-10および-35要素によって識別される）のプロモーター領域を推定するのを助けることができる。一番上の（最長）のcDNA断片は、mRNAの5 '末端を表し、従って、配列決定ラダーと比較した場合に容易にマッピングすることができる。 <img alt="ompA転写開始、mRNA切断;ゲル電気泳動、遺伝子発現解析図。" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図6"> プライマー伸長反応の図6の代表的な結果 。左側のE.からの完全なin vivoでのプライマー伸長ゲル種々のプラスミドを持つ大腸菌が示されている。興味のある個々の領域が拡大している。上部（A）は、o...

ここでは、自動ゲルシーケンサーを使用して、細菌の転写産物とin vivoでのRNAプロセシングから転写の開始点を決定するための蛍光ベースのプライマー伸長法について説明します。

転写開始点を決定するための蛍光に基づくプライマー伸長技術とのRNaseの切断サイトインビボ

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

この手順の全体的な目標は、蛍光プライマー伸長反応を使用して、転写の開始点とRNAがin vivoで細菌から切断部位を特定することです。これは、最初に大腸菌やSアリアなどの細菌を増殖させ、RNA分子を単離することによって達成されます。次に、特定の蛍光プライマーと逆転写酵素を使用してRNAを逆転写し、CD NAフラグメントを作製します。次に、DNAまたはプラスミドを細菌細胞から単離し、シーケンシングキットを使用してDNAテンプレートから蛍光サンガーシーケンシングラダーを作成します。最後に、CDNAフラグメントとシーケンシングラダーを分離し、自動ゲルシーケンサーを使用してポリアクリルアミドゲル上で同時に検出し、互いに比較します。最終的に、蛍光プライマー伸長法は、RNA分子の5つのプライム末端を1塩基の分解能までマッピングするために使用されます。この手法が、人種や放射能に基づく一次伸長などの他の方法よりも優れている点は、電気泳動中に同時に検出が行われるため、RNA分子の末端から5つを迅速に同定できることです。感度は赤活性ベースの一次伸長と似ていますが、実験室の担当者は、レート放射能放射線安全トレーニングを必要とせずにこの方法を使用できます。私たちは、この蛍光一次伸長技術を使用して、毒素抗毒素系のRNA成分を調べることに成功しました。この手順を実演するブドウ球菌は、私の研究室の大学院生であるChristopher Schusterです。高収率のRNAを調製し、テキストプロトコルに従ってプライマーを設計した後、最初にサーモサイクラーを摂氏95度に予熱してプライマー伸長反応を行います。各RNAサンプルについて、以下の化合物をPCRチューブ内で混合し、サンプルを摂氏95度で1分間変性させます。次に、チューブを氷上に5分間置き、プライマーとRNAをハイブリダイズします。次に、PCRマシンを摂氏47度に設定します。次に、ここで説明するように逆転写マスターミックスを準備します。4マイクロリットルの逆転写マスターミックスを各ハイブリダイズRNAサンプルに加え、チューブを摂氏47度で1時間インキュベートします。反応を停止するには、サンプルを摂氏95度に2分間加熱します。次に、6マイクロリットルのフォームアミドローディング染料を加え、マイナス20°Cの暗所で一晩または最大2週間保管します。ゲノムDNAまたはプラスミドを調製した後、テキストプロトコルに従って、約10〜15マイクログラムのゲノムDNAまたは100〜500ナノグラムのプラスミドDNAの12マイクロリットルを蛍光標識プライマーおよびDMSOピペット1マイクロリットルと混合することにより、サンガーシーケンシング反応を組み立てる。各シーケンシングの1マイクロリットルを別々の標識済みPCRチューブに混合します。次に、各チューブに3マイクロリットルのD-N-A-D-M-S-Oプライマーミックスを追加します。PCR装置を以下のプログラムに設定し、サンプルを装置に入れてから実行してください。分析後、6マイクロリットルのローディング色素をサンプルに加え、次に氷上に置きます。ほこりのない清潔な25センチプレートを使用して、すぐに使用する場合、または摂氏マイナス20度で長期間使用する場合は、背面ガラスプレートに0.25ミリメートルスペーサーを配置し、ガラスプレートのノッチ付き端とレールエントリーパイロットの両方を上に向けて上部のノッチ付きガラスプレートを下げます。ガラスプレートの両側にゲルレールを取り付け、つまみを軽く締めてゲルをキャストします。ここにリストされている化合物をビーカーと攪拌子で組み合わせ、磁気攪拌板に置きます。PSを添加してチーム化した直後に、50ミリリットルのシリンジを使用してアクリルアミド溶液を取り込み、先端に0.45ナノメートルのフィルターを配置します。挟まれたプレートを10〜20度の角度で置き、シリンジの先端を一方の側から他方の側に連続的に動かしながら、ガラスプレートの間にゲル溶液をゆっくりと分注します。ゲル溶液がガラスプレートの下端に接触したら、ゲル溶液の分注を停止します。バブルフックを使用して、形成された可能性のある気泡をすべて取り除きます。次に、切欠きのある端でガラスプレートの間にゲルポケットスペーサーをスライドさせ、ゲル溶液に浸し、キャスティングプレートを取り付けて固定し、上部レールネジを軽く固定し、ゲルを1〜2時間硬化させます。キャスティングプレートとポケットスペーサーを取り外す前に、蒸留脱イオン水を使用して、塩とゲルの残留物のポケットを洗浄し、ゲルを流します。バッファータンクホルダーをフロントガラスプレートのゲルレールにスライドさせ、ノブを締めます。ゲルを自動ゲルイメージャーの下部ゲルタンクに加熱プレートに当てて置き、レールエントリーパイロットを装置ブラケットにスライドさせて固定します。1つのXTBEバッファーを使用して、上部と下部のゲルバッファーチャンバーを充填します。次に、下部バッファチャンバーを閉じ、電源コードを使用して上部バッファチャンバーを電源に接続します。ゲルポケットに塩分が含まれている場合は、バッファーを使用してポケットに繰り返しピペットで入れて清掃します。次に、上部バッファー蓋を使用して、上部バッファータンクチャンバーを閉じます。イメージャーとコンピューターの電源を入れ、テキストプロトコルに従ってベース画像IRデータ収集ソフトウェアを起動した後、ここに記載されている設定を使用してスキャナーコントロールを設定します。次に、電圧オンを選択し、Enterキーを押して、空のゲルを20分間事前実行します。その間、PCRマシンを使用して、シーケンシングラダーとプライマー伸長製品を摂氏90度に2分間加熱します氷上で冷却する前に、電気泳動を停止し、自動ゲルシーケンサーを開き、上部バッファータンクの蓋を取り外します。次に、サメの歯の櫛をガラス板の間とサメの歯と一緒に挿入します。ゲルピペットにプライマー伸長製品の1〜2マイクロリットルをわずかに突き刺すか、ラダー反応を各ゲルポケットにシーケンシングします。空のポケットに。ローディング染料を使用してそれらを充填し、一貫性のないランニング動作を防ぎ、バッファータンクとゲルシーケンサーのドアを閉じます。次に、レーザーの電圧オンを選択し、スキャンステータスをオンにして電気泳動を開始し、Enterキーを押します。対象領域がレーザーを通過したら、ここに示すように電気泳動を停止します。プライマー伸長反応は、目的の転写産物の転写開始点またはTSPを決定するために使用でき、プロモーター領域の推定に役立ちます。この例では、MPE mRNAのTSPは、以前に発表されたデータと一致するGとして同定されました。マイナス35およびマイナス10のプロモーターエレメントは、T-T-G-T-A-AおよびT-A-G-A-C-Tであると推定され、これらのモチーフは、プライマー伸長を使用してmRNA切断産物を同定することにより、各コンセンサス配列の塩基とのみ異なります。ここには、RNAが存在しないか不活性な場合に、RNAが存在しないか不活性な場合に、STARTcoonに近い切断のRNAマッピングが示されており、RNA活性の結果としてSTARTcoonの近くにプライマー伸長産物が形成されません。しかし、この図ではスタートコートのすぐ下流に2つの強いバンドが現れており、逆転写反応の過剰なRNAが個々のバンドの同定を妨げているため、プライマー伸長実験が失敗したことを示しています。これは、テンプレートRNAの総量を目的のRNAの存在量に合わせて調整する必要があることを示しています。このビデオを見た後、蛍光プライマーと自動ゲルシーケンサーを使用してin vivoで転写開始点とRNA切断部位を解明する方法について、ある程度の練習を積んでよく理解できるはずです。この方法は、すばやく簡単に実行できます。あなたの実験に頑張ってください。

fluorescence-based-primer-extension-technique-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、光退色後蛍光回復（FRAP）や胚性幹（ES）細胞におけるクロマチン蛋白質の動態を監視する（FLIP）光退色で蛍光の損失を含む光退色の方法を説明します。クロマチン可塑性を研究する手段の一つであると考えられているクロマチン蛋白質のダイナミクスは、多能性細胞で強化されています。...

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

エキソヌクレアーゼは、ゲノムの安定性を確保する上で重要な役割を果たします。WRNエキソヌクレアーゼ機能の喪失は、早期老化をもたらします。ヌクレアーゼの基質やその他の要件をin vitroで研究することは、in...

ヒト早老症WRNエキソヌクレアーゼのオルソログであるDmWRNexoを特徴付けるための蛍光ベースのエキソヌクレアーゼアッセイ、および他のヌクレアーゼへの応用

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。...

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。...

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

ここでは、短い合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドと精製されたPol IIのみを必要とするRNAポリメラーゼII(Pol II)伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの複合体は、Pol...

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

この研究は、DNase 活性の検出と定量的評価のためのシンプルでユーザーフレンドリーなレシオメトリック FRET...

レシオメトリック蛍光共鳴エネルギー移動によるDNase活性の評価

本プロトコルは、アクチノマイシンD処理、RT-qPCR、非線形回帰解析を用いて、マウス胚性幹細胞における遺伝子間および遺伝子内強化RNAの安定性と半減期を定量的に測定します。位置特異的な正規化戦略を組み込み、文脈依存的なeRNA崩壊動態を正確にモデル化します。...

マウス胚性幹細胞におけるエンハンサーRNA安定性の最適化された定量的評価

学ぶ蛍光プライマー伸長法による細菌転写開始点とRNA切断サイトの同定。自動ゲルシーケンサーを用いて高感度にin vivo解析を行い、遺伝子発現制御の理解に貢献する。

転写開始点を決定するための蛍光に基づくプライマー伸長技術とのRNaseの切断サイトインビボ

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